專利名稱：擬穴青蟹雙鏈特異性脫氧核糖核酸酶及其制備方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及雙鏈特異性脫氧核糖核酸酶，特別涉及擬穴青蟹雙鏈特異性脫氧核糖核酸酶及其制備方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
擬穴青蟹(Scylla paramamosain),隸屬節(jié)肢動(dòng)物門(Arthropoda),甲殼綱(Crustacea)、十足目(Decapoda)、短尾亞目(Brachyura)、梭子蟹科(Portunidae)、青蟹屬(Scylla)，是印度洋、太平洋熱帶海域的重要養(yǎng)殖蟹種，在我國(guó)浙江、福建、廣東、海南省廣泛養(yǎng)殖。雙鏈特異性脫氧核糖核酸酶(Duplex-Specific Nuclease,以下簡(jiǎn)稱為DSN)是2004年從堪察加擬石蟹(Paralithodes camtschaticus,俗名:帝王蟹)肝胰腺中發(fā)現(xiàn)的一種熱穩(wěn)定核酸酶，該酶能夠降解雙鏈DNA和DNA-RNA的雜交體中的DNA而對(duì)單鏈核酸分子幾乎沒有作用。另外，DSN對(duì)完全互補(bǔ)配對(duì)的短片段雙鏈DNA (8 12bp)具有很高的酶切活性，而對(duì)于不完全互補(bǔ)配對(duì)的短片段雙鏈DNA的酶切活性很低。DSN的酶活性要在有二價(jià)金屬陽(yáng)離子如Mg2+的條件下才發(fā)揮作用，最佳的pH為
7.0-8.0 ;最適溫度為55 65°C;可以用10mmol/L EDTA終止酶切反應(yīng)，在37°C時(shí)對(duì)蛋白酶K有耐受性?；贒SN具有以上這些特點(diǎn)，雖然DSN發(fā)現(xiàn)的比較晚，但是一經(jīng)面世，很快被EVR0GEN公司制成了商品 ，廣泛的應(yīng)用于分子生物學(xué)研究中。同時(shí)，已經(jīng)在美國(guó)等地方申請(qǐng)相關(guān)的專利(US7951569B2、US20050164216A1 等)。目前，DSN主要有以下應(yīng)用:均一化文庫(kù)構(gòu)建:Zhulidov( [3]Zhulidov PA, Bogdanova EA, Shcheglov AS, etal.Simple cDNA normalization using kamchatka crab duplex_specific nuclease[J].Nucleic Acids Research, 2004, 32: e37)首次把DSN用于全長(zhǎng)cDNA的均一化文庫(kù)構(gòu)建，并成功地構(gòu)建了美國(guó)加州海兔(Aplysia califomica)神經(jīng)組織的均一化全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)。使用DSN作為工具特異降解雙鏈DNA，避免了以往cDNA文庫(kù)均一化過程中需要靠物理方法分離單、雙鏈DNA的繁瑣步驟。DSN均一化cDNA文庫(kù)原理和步驟如下:cDNA文庫(kù)先變性，再?gòu)?fù)性，因?yàn)樨S度高的DNA復(fù)性快，而豐度低的DNA復(fù)性慢，rRNAURNA來源的DNA分子復(fù)性速度快于mRNA，首先被DSN降解，通過各種來源的DNA分子的復(fù)性速度的不同來進(jìn)行均一化。DSN均一化處理能夠降解高豐度的來自rRNA、tRNA、管家基因的DNA分子，而保留低表達(dá)豐度的DNA分子。DSN能減低高豐度表達(dá)基因100倍以上，有效富集低豐度表達(dá)基因。米用DSN 均一化技術(shù)與 SMART (Switching mechanism at5，end of RNAtranscript)建庫(kù)技術(shù)相結(jié)合的方法,構(gòu)建均一化全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)已經(jīng)有廣泛的應(yīng)用，包括人的一些組織、海兔(Aplysia californica)的神經(jīng)組織、鋸緣青蟹性腺、鋸緣青蟹卵巢、大黃魚(Larimichthys crocea)卵巢、雜色鮑(Haliotis d iversicolor supertexta)月干膜腺、鴨(Anas platyrhynchos)早期胚胎、亞洲棉(Gossypium arboreum L.)、殺蟲真菌金龜子綠僵菌(Metarhizium anisopliae var.acridum)、堇菜(Viola verecumda A.Gray)葉片
坐寸O基于DSN對(duì)完全互補(bǔ)的短片段雙鏈DNA (8 12bp)具有很高的酶切活性，而對(duì)于不完全互補(bǔ)的短片段雙鏈DNA的酶切活性很低的特點(diǎn)，廣泛用于單核苷酸多態(tài)性(SingleNucleotide Polymorphism, SNP)的檢測(cè)和分析。另外,DSN還用于染色體端粒數(shù)量的測(cè)定、RNA測(cè)序、多重復(fù)序列的基因組鳥槍法測(cè)序、從cDNA中分離微衛(wèi)星DNA、單個(gè)細(xì)胞測(cè)序、低表達(dá)基因的檢測(cè)等方面。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一目的在于提供一種擬穴青蟹雙鏈特異性脫氧核糖核酸酶。本發(fā)明的第二目的在于提供一種擬穴青蟹雙鏈特異性脫氧核糖核酸酶的制備方法。本發(fā)明的第三目的在于提供擬穴青蟹雙鏈特異性脫氧核糖核酸酶的應(yīng)用。所述擬 穴青蟹雙鏈特異性脫氧核糖核酸酶的基因序列為:
acgggggtga aagagggagt gtggagagtg cagcagacga aatggagctt gagcgaggaa 50
tcttcacgca cttcgtttta atcaccattt tctccgcctg tgtctactgt tcggactgcg 120
tgtggaacaa agacaaggac ttccctcaat acccaccgct catcctcgat tccagtttcg 180
agtttgtact gccggtggag gaggatggca acagggtggt cagggtggcg gcgggagaga 240
ccgtgactct ggcatgtcca ggcgacgaga tcgaaaactt gcatcaggtg gaggcggagg 300
ctcgctgtct cgagaacggc ctcctggcta tcgaaaactc agagtgggat atggcgagcc ibU
權(quán)利要求
1.一種擬穴青蟹雙鏈特異性脫氧核糖核酸酶，其特征在于，所述擬穴青蟹雙鏈特異性脫氧核糖核酸酶的基因序列為:
2.一種擬穴青蟹雙鏈特異性脫氧核糖核酸酶，其特征在于，所述擬穴青蟹雙鏈特異性脫氧核糖核酸酶的氨基酸序列為: Met Glu Leu Glu Arg Gly He Phe Thr His Phe Val Leu He Thr Ile151015
3.一種擬穴青蟹雙鏈特異性脫氧核糖核酸酶的制備方法，其特征在于，包括以下步驟 1)提取擬穴青蟹肝胰腺總RNA； 2)用RT-PCR技術(shù)從總RNA中擬轉(zhuǎn)錄得到cDNA； 3)利用SMARTII-RACE的方法得到新的DSN基因； 4)利用基因重組的方法，構(gòu)建擬穴青蟹原核表達(dá)重組質(zhì)粒； 5)在大腸桿菌里面高效表達(dá)并純化出具有生物活性的重組擬穴青蟹DSN。
4.一種表達(dá)擬穴青蟹雙鏈特異性脫氧核糖核酸酶的重組載體，其特征在于，所述載體包括如權(quán)利要求I所述的擬穴青蟹雙鏈特異性脫氧核糖核酸酶的基因序列。
5.如權(quán)利要求4所述的重組載體，其特征在于，所述重組載體是中間插有6個(gè)His的親和標(biāo)記位點(diǎn)的高效表達(dá)載體pET-32a。
6.一種含有如權(quán)利要求5所述重組載體的原核細(xì)菌。
7.如權(quán)利要求6所述的原核細(xì)菌，其特征在于，所述原核細(xì)菌為大腸桿菌。
8.—種生物制劑，其特征在于，所述生物制劑含有如權(quán)利要求2所述的擬穴青蟹雙鏈特異性脫氧核糖核酸酶。
9.如權(quán)利要求8所述生物制劑在降解雙鏈DNA上的應(yīng)用。
全文摘要
擬穴青蟹雙鏈特異性脫氧核糖核酸酶及其制備方法與應(yīng)用，涉及雙鏈特異性脫氧核糖核酸酶。制備方法提取擬穴青蟹肝胰腺總RNA；用RT-PCR技術(shù)從總RNA中擬轉(zhuǎn)錄得到cDNA；利用SMART II-RACE的方法得到新的DSN基因；利用基因重組的方法，構(gòu)建擬穴青蟹原核表達(dá)重組質(zhì)粒；在大腸桿菌里面高效表達(dá)并純化出具有生物活性的重組擬穴青蟹DSN。提供一種重組載體，該載體包括所述擬穴青蟹雙鏈特異性脫氧核糖核酸酶的基因序列。提供一種生物制劑，該生物制劑含有所述擬穴青蟹雙鏈特異性脫氧核糖核酸酶，所述生物制劑應(yīng)用于降解雙鏈DNA。
文檔編號(hào)C12N1/21GK103255116SQ20131019908
公開日2013年8月21日 申請(qǐng)日期2013年5月24日 優(yōu)先權(quán)日2013年5月24日
發(fā)明者王藝?yán)? 張子平, 蘭旺仁 申請(qǐng)人:集美大學(xué)