帶報告基因的bac-oc43冠狀病毒載體系統(tǒng)的構(gòu)建及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明為帶報告基因的BAC-OC43冠狀病毒載體系統(tǒng)的構(gòu)建及應(yīng)用。所屬【技術(shù)領(lǐng)域】為1.分子生物學(xué)2.病毒學(xué)。更具體涉及一種攜帶綠色熒光蛋白的BAC-OC43冠狀病毒載體系統(tǒng)的構(gòu)建方法及應(yīng)用。通過該方法，我們可以快速準確的對OC43基因組進行改造，同時也能方便的對病毒進行半定量分析，為深入研究該病毒的復(fù)制機制、致病機理、感染譜以及開發(fā)新型疫苗奠定了基礎(chǔ)。
【專利說明】帶報告基因的BAC-0C43冠狀病毒載體系統(tǒng)的構(gòu)建及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于分子生物學(xué)和病毒學(xué)領(lǐng)域。更具體涉及一種攜帶綠色熒光蛋白的BAC-0C43冠狀病毒載體系統(tǒng)的構(gòu)建方法及應(yīng)用。通過該方法，我們可以快速準確的對0C43基因組進行改造，同時也能方便的對病毒進行半定量分析，為深入研究該病毒的復(fù)制機制、致病機理、感染譜以及開發(fā)新型疫苗奠定了基礎(chǔ)。
【背景技術(shù)】
[0002]冠狀病毒屬于巢狀病毒目、冠狀病毒科、冠狀病毒屬，因電鏡下病毒顆粒形似王冠而得名。冠狀病毒是病毒界的一個大家族，能感染從哺乳動物到禽類等一大批脊椎動物。根據(jù)國際病毒分類學(xué)委員會的最新規(guī)定，冠狀病毒分為α、β、Y和δ 4組，分別對應(yīng)I組、2組和3組冠狀病毒和新假定的一個屬。α冠狀病毒組包括人冠狀病毒229E(HCoV-229E)、NL63 (HCoV-NL63)以及一些動物冠狀病毒如豬傳染性胃腸炎病毒(porcine transmissiblegastroenteritis virus, TGEV)和犬冠狀病毒(canine coronavirus, CCoV)等；β 冠狀病毒包括人冠狀病毒0C43、SARS> HKul以及新近發(fā)現(xiàn)的HCoV-EMC等人冠狀病毒，還包括鼠肝炎病毒(murine hepatitis virus, MHV)和牛冠狀病毒(bovine coronavirus, BCoV)等動物冠狀病毒；Y冠狀病毒組包括禽傳染性支氣管炎病毒(avian infectious bronchitisvirus, IBV)和火雞冠狀病毒(turkey Coronavirus, TCoV)等。表皮細胞是冠狀病毒感染的主要靶細胞，巨噬細胞等分布廣泛的細胞也可被感染。冠狀病毒的宿主范圍相對比較局限，只感染它們的天然宿主以及密切相關(guān)的宿主。冠狀病毒主要與呼吸道、腸道、中樞神經(jīng)系統(tǒng)以及肝臟疾病有關(guān)，具有胃腸道、呼吸道或神經(jīng)系統(tǒng)嗜性。冠狀病毒感染人體后，還與胃腸炎、上呼吸道和下呼吸道感染有關(guān)。
[0003]1981年，Racaniello和Baltimore將包含脊髓灰質(zhì)炎病毒全長cDNA的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染宿主細胞，成功構(gòu)建了首個RNA病毒的全長cDNA克?。浑S后，該技術(shù)得到了廣泛的應(yīng)用和發(fā)展，獲得了許多RNA病毒的感染性克隆，包括正鏈和負鏈RNA病毒、分節(jié)段的和不分節(jié)段的RNA病毒。獲得cDNA感染性克隆后`，可以在DNA水平上通過突變、插入、缺失和互補等手段研究RNA病毒，具有非常廣泛的應(yīng)用前景。冠狀病毒龐大的基因組以及攜帶其復(fù)制酶序列的質(zhì)粒在細菌中的不穩(wěn)定性長期阻礙了冠狀病毒反向遺傳學(xué)的發(fā)展，直到2000年Almazan等首次利用D1-RNA和BAC質(zhì)粒系統(tǒng)成功構(gòu)建了 TGEV的全長cDNA感染性克隆。此后，通過體外將全場cDNA克隆到BAC載體、體外連接覆蓋基因組全長的cDNA以及痘苗病毒載體等相繼獲得多個冠狀病毒的感染性克隆。冠狀病毒感染性克隆的構(gòu)建成功為我們研究冠狀病毒蛋白和基因組功能、致病機理、毒力關(guān)鍵位點、病毒載體的開發(fā)提供了一個非常好的平臺。
[0004]相對其他病毒載體，冠狀病毒載體有獨特的優(yōu)勢:(I)冠狀病毒為單股正鏈RNA病毒，復(fù)制過程發(fā)生在細胞質(zhì)內(nèi)，并且不經(jīng)過DNA中間過程，避免了病毒基因組與宿主細胞DNA的整合。(2)冠狀病毒作為目前已知的最大的RNA病毒，有足夠的空間來容納較大的外源基因。(3)冠狀病毒主要感染呼吸道和腸道粘膜表面，能刺激腸相關(guān)淋巴組織誘導(dǎo)多效的分泌型免疫反應(yīng)。(4)通過對冠狀病毒S蛋白基因的操作可以改變其組織嗜性，從而對載體的組織嗜性進行改造。(5)我們可以獲得能夠感染多數(shù)我們感興趣的物種的非病原株來開發(fā)表達系統(tǒng)；同時還可以獲得冠狀病毒的感染性cDNA克隆來設(shè)計表達系統(tǒng)。(6)我們可以獲得能夠感染多數(shù)我們感興趣的物種的非致病性的冠狀病毒株以及感染性cDNA克隆來設(shè)計表達系統(tǒng)。(7)基于冠狀病毒獨特的非連續(xù)轉(zhuǎn)錄模式，理論上只要將合適的TRS (轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列)和外源基因一起插入病毒基因組就可以表達。目前，已經(jīng)開發(fā)出了兩類基于冠狀病毒的表達載體，即輔助病毒依賴的表達載體系統(tǒng)和單基因組表達載體系統(tǒng)。輔助病毒依賴的表達載體系統(tǒng)主要包括兩個部分:輔助病毒以及攜帶外源基因的微型基因組。首先通過對D1-RNA的改造，然后轉(zhuǎn)染感染有輔助病毒的細胞，在輔助病毒的作用下，D1-RNA得以轉(zhuǎn)錄、表達。利用該系統(tǒng)，研究者們成功表達了 β_葡萄糖醒酸酶(β-glucuronidase,⑶S)和豬繁殖與呼吸綜合征病毒PRRSV的0RF5 (PRRSV主要的保護性抗原)。輔助病毒依賴的表達載體系統(tǒng)在穩(wěn)定性方面有一定的局限性。比如表達HE蛋白的MHV D1-RNA系統(tǒng)只能穩(wěn)定傳代3次，基于TGEV的表達外源基因的微型基因組也只能穩(wěn)定傳代10次，同時該系統(tǒng)只能應(yīng)用于能產(chǎn)生D1-RNA的冠狀病毒，如TGEV、229E、MHV、IBV等。
[0005]2006年，加拿大的一個研究團隊成功了構(gòu)建了基于BAC系統(tǒng)的HCoV_0C43全長cDNA感染性克隆，為我們利用HCoV-0C43表達外源基因、研究基因功能打下了基礎(chǔ)。在該感染性克隆的基礎(chǔ)上，對HCoV-0C43基因組進行改造，構(gòu)建一種能夠表達綠色熒光蛋白的重組HCoV-0C43病毒載體系統(tǒng)，為深入研究該病毒的復(fù)制機制、致病機理、感染譜以及開發(fā)新型疫苗奠定了基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于提供一種攜帶綠色熒光蛋白的BAC-0C43載體系統(tǒng)以及構(gòu)建方法，具體步驟如下:
[0007](I)酶切位點的`選擇和引物設(shè)計所有HCoV-0C43相關(guān)的核酸序列均參考ATCC株(Genbank編號AY585228)。根據(jù)文獻報導(dǎo)，結(jié)合對HCoV_0C43基因組ORF的分析，選擇了 2個外源GFP基因的插入位點:取代NS2和NS12.9基因；然后根據(jù)插入位點，在其兩端選擇了兩個特異性的酶切位點用于攜帶GFP的外源片段的引入，如表1。然后根據(jù)選定的外源基因插入位點和酶切位點，設(shè)計引物分別擴增GFP以及插入位點與酶切位點之間的基因，用于后續(xù)的Overlapping PCR,如表2、表3所示。
[0008]表1酶切位點的選擇及位置
[0009]
功能酶切位點位置
取代 NS2Nrf18587
PmeI 23916取代 NS 12.9 SacII 24070_SanDI_29571_
[0010]表2GFP取代NS2引物列表
[0011]
【權(quán)利要求】
1.一種新型的BAC-0C43冠狀病毒載體系統(tǒng)，將帶報告基因的PBAC-0C43質(zhì)粒轉(zhuǎn)染宿主細胞后，凍融裂解細胞即可獲得能表達報告基因的重組病毒。
2.如權(quán)利要求1所述BAC-0C43病毒載體系統(tǒng)，其特征在于，利用HCoV_0C43重組病毒的復(fù)制表達外源基因。
3.如權(quán)利要求2所述BAC-0C43病毒載體系統(tǒng)，優(yōu)選HCoV_0C43基因組NS2和NS12.9基因位置作為外源基因插入位點，其他結(jié)構(gòu)基因之間的合適位置亦可采用。
4.如權(quán)利要求3所述，其構(gòu)建方法包括以下步驟: (1)外源基因插入位置的選擇 以GFP基因取代HCoV-0C43基因組的2個附屬基因:NS2和NS12.9。 (2)酶切位點的選擇和引物設(shè)計 所有HCoV-0C43相關(guān)的核酸序列均參考ATCC株(Genbank編號AY585228)。在選定外源基因插入位點后，在其兩端選擇了兩個特異性的酶切位點用于攜帶GFP的外源片段的引入，如表1 ;根據(jù)選定的外源基因插入位點和酶切位點，設(shè)計引物分別擴增GFP以及插入位點與酶切位點之間的基因，引物序列如表2、表3所示。 表1酶切位點的選擇及位置
5.如權(quán)利要求1所述，該病毒載體系統(tǒng)用于深入研究該病毒的復(fù)制機制、致病機理、感染譜以及開發(fā)新型疫苗。
【文檔編號】C12N7/01GK103805636SQ201310201244
【公開日】2014年5月21日 申請日期:2013年5月28日 優(yōu)先權(quán)日:2013年5月28日
【發(fā)明者】譚文杰 申請人:中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所