精氨酸脫亞氨基酶基因工程菌的構(gòu)建及其用途
【專利摘要】本發(fā)明在環(huán)境微生物中克隆到兩條精氨酸脫亞氨基酶基因，SEQID：No.1和SEQID：No.3，并構(gòu)建了大腸桿菌BL21基因工程菌，保藏號分別是CGMCCNo.7491和CGMCCNo.7492,并驗證了其在生產(chǎn)L-瓜氨酸方面的用途，L-精氨酸轉(zhuǎn)化率99%。
【專利說明】精氨酸脫亞氨基酶基因工程菌的構(gòu)建及其用途

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于工業(yè)生物技術(shù)和醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及一種基于精氨酸脫亞氨基酶的重組 酶、工程菌及其在瓜氨酸生產(chǎn)中的用途。 技術(shù)背景
[0002] 精氨酸脫亞氨酶（Arginine desiminase, ADI)是一種能夠分解精氨酸的蛋白質(zhì)。該 酶首先被應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)一步轉(zhuǎn)化精氨酸制備瓜氨酸(Applied Microbiology, 1971:992-999)， 也是目前被應(yīng)用最廣泛的瓜氨酸生產(chǎn)方法之一。1978年日本學者自惡臭假單胞菌純 化了并研究了該酶的性質(zhì)，發(fā)現(xiàn)該酶具有較高以精氨酸為底物合成瓜氨酸的活性（FEBS Letters，1978, 96 (2) : 389-391)。隨后，該酶被確定為微生物精氨酸代謝過程ADI代謝途徑 的關(guān)鍵酶（Gene, 1990, 87:37-43)。
[0003] 在醫(yī)學領(lǐng)域，學者在被支原體污染的表皮細胞中發(fā)現(xiàn)ADI能夠抑制細胞生 長(Biochemical and Biophysical Research Communications,1999,261:10-14), 是 一種細胞生長的抑制劑。進一步的研究發(fā)現(xiàn)ADI對人的腫瘤細胞，如肝細胞癌細胞、 黑色素瘤細胞、乳腺癌細胞的增殖亦有明顯的抑制作用（International Journal of Cancer, 1992, 51 (2) : 244-249; Leukemia, 2000, 14 (5) : 826-829)。國外已經(jīng)把 ADI 及 其修飾物作為一種新型抗癌藥進行研究，用于治療肝臟肉瘤、黑色素瘤等腫瘤（Expert Opinion on Investigational Drugs, 2006, 15(7):815-822; British Journal of Cancer, 2003, 89(5):907-914)〇
[0004] 本專利在未經(jīng)微生物純培養(yǎng)的方式下，通過對環(huán)境微生物基因組的研究，克隆并 表達了兩條精氨酸脫亞氨酶基因SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 3,相關(guān)微生物菌種于2013年 4月19日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(地址：北京市朝陽區(qū)北辰路1號院3號 中國科學院微生物研究所)，保藏號分別為CGMCC No. 7491和CGMCC No. 7492,菌種分類均為 大腸埃希氏菌co/i)，為L-瓜氨酸工業(yè)化生產(chǎn)和醫(yī)藥學研究提供了新的途 徑和基因資源。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供，一種利用精氨酸脫亞氨基酶或者含有該酶的工程菌進行 生物轉(zhuǎn)化獲取瓜氨酸的新途徑。
[0006] 本發(fā)明的技術(shù)方案如下： 實現(xiàn)上述目的的基本技術(shù)路線為： 總體技術(shù)方案是克隆包括ADI的編碼基因，利用合適的載體和限制性內(nèi)切酶片段，構(gòu) 建轉(zhuǎn)化載體，將ADI基因克隆到合適的宿主細胞，包括但不限于大腸桿菌、酵母、CHO細胞、 昆蟲細胞等。
[0007] 1.基因模板的提取將待克隆精氨酸脫亞氨基酶的菌群在精氨酸富集培養(yǎng)基上室 溫過夜富集培養(yǎng)，至合適菌體濃度，按照本領(lǐng)域一般技術(shù)人員熟悉的步驟、試劑和方法提取 群落菌體DNA作為基因獲取的模板。
[0008] 2.精氨酸脫亞氨基酶基因的克隆 H Pseudomonas putida 4359(Genbank登錄號：U07185)保守序列，設(shè)計帶有酶切位點的引物，按照本領(lǐng)域一般技 術(shù)人員熟悉的步驟、試劑和方法，通過PCR擴增精氨酸脫亞氨基酶基因。
[0009] 3.轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建、轉(zhuǎn)化和陽性克隆的篩選按照本領(lǐng)域一般技術(shù)人員熟悉的步 驟、試劑、完全可以從商業(yè)途徑獲得的載體、限制性內(nèi)切酶和方法，將目的基因克隆至載體， 轉(zhuǎn)化宿主細胞，并實現(xiàn)陽性克隆篩選。
[0010] 發(fā)明效果 利用本技術(shù)方案涉及的方法，構(gòu)建了基于精氨酸脫亞氨基酶實現(xiàn)以精氨酸為底物生產(chǎn) 瓜氨酸的微生物細胞模型，進行了陽性篩選，并進行了生物轉(zhuǎn)化。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0011] 圖I PCR產(chǎn)物的0. 8%瓊脂糖凝膠電泳分析。1，2, 3 :以環(huán)境DNA樣品為模板的ADI 基因PCR擴增產(chǎn)物，M :分子量標記（DL2000)。
[0012] 圖2表達載體#也I和III雙酶切分析（0· 8%瓊脂糖凝膠電泳）。l:pET-KSRD3-1 (SEQ ID No.l)，2:pET- KSRD3-2 (SEQ ID Νο·3)，Μ:分子量標記（DL10000)。
[0013] 圖3 SDS-PAGE分析。1 :未誘導(dǎo)的宿主菌細胞破碎后上清液，2 :IPTG誘導(dǎo)之后的 宿主菌（￡ cWpET- KSRD3-1)細胞破碎后上清液，3 :IPTG誘導(dǎo)之后的宿主菌（凡 PET-KSRD3-2)細胞破碎后上清液，4:IPTG誘導(dǎo)之后的宿主菌（Genbank:U01785)細胞破 碎后上清液，M :分子量標記（Premixed Protein Marker (Low ))。
[0014] 圖4轉(zhuǎn)化實驗分析。I :瓜氨酸和精氨酸混合液參照物；2 :重組菌0： cWpET-KSRD3-1)轉(zhuǎn)化后上清液樣品；3 :重組菌（凡cWpET- KSRD3-2)轉(zhuǎn)化后上清液樣品。
[0015] 附序列克隆到的環(huán)境微生物精氨酸脫亞氨基酶基因序列 具體實施方案
[0016] 試劑和材料 實驗菌株和載體 大腸桿菌co/i) DH5a、BL21，pMD18_T simple vector, pET28a載體均 由本實驗室保藏，亦可自商業(yè)途徑獲得。
[0017] 實驗試劑：DNA 聚合酶（Taq DNA Polymerase，PrimeSTAR? HS DNA Polymerase)， 限制性內(nèi)切酶 OWeI 和歷III)，T4DNA Ligase, dNTP，DNA marker DL10,000，Premixed Protein Marker (Low )均購自Takara公司；細菌基因組提取試劑盒、質(zhì)粒小量提取試劑 盒、DNA純化試劑盒購自北京鼎國生物技術(shù)有限公司；硫酸卡納霉素、氨芐青霉素、IPTG購 自Genview公司；其余化學試劑均為分析純。
[0018] 1.2實驗方法 細菌基因組提取、質(zhì)粒提取以及DNA純化回收等均按照試劑盒使用說明，大腸桿菌感 受態(tài)的制備、酶切、酶連、載體的轉(zhuǎn)化，瓊脂糖凝膠電泳和SDS-PAGE等常規(guī)分子生物學操作 參考《分子克隆實驗指南》第三版（科學出版社，2002)。
[0019] I. 2. 1攜帶精氨酸脫亞氨基酶細菌的富集培養(yǎng)及群落基因組的提取 在種植西瓜、或甜瓜等田地中收集部分土壤樣品，懸液稀釋后，取樣于含有2%精氨酸 的LB培養(yǎng)基500ml搖瓶，150rpm室溫培養(yǎng)20小時。
[0020] 離心收集菌體，并利用細菌基因組提取試劑盒獲取其基因組DNA。
[0021] 1. 2. 2目標基因精氨酸脫亞氨基酶編碼序列的擴增 根據(jù)Genbank登錄的Aewt/offioftas 編碼序列設(shè)計一對引物（上海英駿生物技 術(shù)有限公司合成），引物序列及其酶切位點如下： ADIPF :5'_ GGAATTCCATATGTCCGCTGAAAAACAGAAGTACG-3' (下劃線為 M/e I 酶切位點） ADIPR: 5, _ CCCAAGCTTAGTAATCGATCGGGTCAC-3,(下劃線為歷III 酶切位點）。
[0022] 1. 2. 3反應(yīng)體系及條件： PCR 反應(yīng)體系（50 μ?): 5XPCR buffer 10 μ?，dNTP 4 μ?，引物 ADIPF 和 ADIPR(K) μΜ)各 1 μ 1，模板 0· 5 μ l，PrimeSTAR? HS DNA Polymerase 0· 5 μ 1，水至 50 μ I。
[0023] PCR 反應(yīng)條件（Touch down PCR) :95°C 5min ;98°C 10 sec，60-51 °C 10 sec，10 個循環(huán)，72 °C 延伸 I min ;98 °C 10 sec，55 °C 10 sec，20 個循環(huán)，72 °C 延伸 I min; 72°C 10 min。0.8 %瓊脂糖凝膠電泳檢測及純化PCR產(chǎn)物。
[0024] PCR產(chǎn)物加A反應(yīng)體系（20 μ 1):取14. 5 μ I PCR產(chǎn)物，加入2μ I IOXTaq Buffer，3yl dNTP，2 U Taq DNA Polymerase，72 °C反應(yīng) 20?30 min 后直接純化回收。
[0025] 1. 2. 4目標基因克隆文庫的構(gòu)建與鑒定 按照PMD18-T simple vector試劑盒操作說明，連接目標基因與T載體，轉(zhuǎn)化萬. DH5ci，利用藍白斑篩選陽性轉(zhuǎn)化子，并選擇部分轉(zhuǎn)化子送至生工生物工程(上海）股份有限 公司測序。
[0026] 1. 2. 5目標基因克隆及鑒定 在克隆文庫的測序結(jié)果中，選擇攜帶興趣基因的轉(zhuǎn)化子，37 °C過夜搖瓶培養(yǎng)，提取重 組質(zhì)粒，利用和沒III雙酶切，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳純化回收興趣基因。
[0027] 同時利用和III雙酶切pET28a載體，并瓊脂糖凝膠回收載體產(chǎn)物。
[0028] 然后，利用T4連接酶16 °C過夜酶連pET28a載體和興趣基因，產(chǎn)物轉(zhuǎn)化凡 DH5 a (CaCl2法），選擇部分轉(zhuǎn)化子經(jīng)生工生物工程(上海）股份有限公司測序。
[0029] 選擇測序結(jié)果正確的轉(zhuǎn)化子，提取重組質(zhì)粒（pET-ADI)轉(zhuǎn)化凡co/i BL21(CaCl2 法）。
[0030] 1.2.6重組蛋白的表達 挑取重組菌凡co/i BL21接種于含有硫酸卡納霉素的LB培養(yǎng)基中，37 °C振蕩過夜 培養(yǎng)。將培養(yǎng)物接種于新鮮的含有硫酸卡納霉素的LB培養(yǎng)基中，接種量2%，500 mL搖瓶 37 °C振蕩培養(yǎng)至0D_=0. 6。30°C IPTG誘導(dǎo)（終濃度0. 6mM)，3h后離心收集細胞；20 mM Tris-Cl (pH8. 0)重懸細胞，超聲破碎，離心分別收集上清和沉淀。SDS-PAGE分析上清和沉 淀。帶有空載的萬.co/i BL21作為陰性對照。
[0031] L 2. 7酶法轉(zhuǎn)化生產(chǎn)瓜氨酸 無菌條件下，挑取一環(huán)菌體，接入到裝有50ml發(fā)酵液的250ml三角瓶中，37°C，200r/ min，培養(yǎng)3h。至細胞OD6tltl生長至0. 6,加IPTG至終濃度0. 2mM，25-37°C，200 r/min培養(yǎng) 3h。發(fā)酵完畢，5000r/min，離心IOmin收集菌體。取0. 2g濕菌體，經(jīng)生理鹽水洗漆兩次，轉(zhuǎn) 入20ml精氨酸底物濃度為10%的醋酸鹽緩沖液（pH 6. 0)，150r/min，37°C開始酶反應(yīng)。
[0032] 1. 2. 8瓜氨酸檢測方法 采用薄層層析（TLC)定性分析和紫外分光光度法結(jié)合分析的方法。TLC分析：流動相： V(甲醇）：V(氨水）為6:1，顯色劑為0.3%的茚三酮。L-瓜氨酸含量的測定(參考：中國醫(yī) 藥工業(yè)雜志，2007, 38 (7)，519-521):根據(jù)L-瓜氨酸在強酸性溶液中與二乙酰一肟的專一顯 色反應(yīng)及其反應(yīng)復(fù)合物在490nm處吸光度與L-瓜氨酸質(zhì)量濃度呈線性關(guān)系的特點，利用顯 色法定量瓜氨酸。L-精氨酸含量的測定（參考：中國食品學報，2007, 7 (4)，126-131 )，以百 里酚的次溴酸鈉溶液為顯色劑，用分光光度計比色測定。. 2實驗結(jié)果 2. 1以群落DNA為模板的精氨酸脫亞氨基酶基因的PCR擴增 以ADIPF和ADIPR為引物，以群落細菌基因組為模板，PCR擴增到約1260 bp DNA片段 (圖1)，結(jié)果與理論（1265bp)相符。
[0033] 2.2目標基因克隆文庫的構(gòu)建 將PCR產(chǎn)物與pMD18-T simple載體酶連，轉(zhuǎn)化萬.co/i DH5a，并利用藍白斑篩選陽 性克隆，收獲了大約500個左右的轉(zhuǎn)化子。
[0034] 2. 3目標基因的克隆及表達載體的構(gòu)建 選擇經(jīng)過測序的興趣基因轉(zhuǎn)化子，提取克隆載體，并雙酶切收獲目標基因，酶連雙酶消 化的pET28a載體，轉(zhuǎn)化凡co/i DH5a。選擇陽性克隆子，提取質(zhì)粒，并進行雙酶切驗證，結(jié) 果如圖2所示表明酶連成功。
[0035] 2.4重組蛋白的表達 重組大腸桿菌BL21 (pET-ADI)，在IPTG誘導(dǎo)后，表達產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳分析， 在大約46kDa處出現(xiàn)清晰的蛋白條帶（圖3)，即為精氨酸脫亞氨基酶；誘導(dǎo)后，菌體經(jīng)超聲 破碎后取樣上清SDS-PAGE電泳，可見該蛋白在上清中存在，具有良好的可溶性。
[0036] 2. 5酶法轉(zhuǎn)化生產(chǎn)瓜氨酸 按照1. 2. 7所述轉(zhuǎn)化方法，離心收集菌體，進行轉(zhuǎn)化實驗。經(jīng)4小時轉(zhuǎn)化，12000rpm離 心，毛細管取上清，利用薄層層析法定性鑒定（圖4)，檢測顯示精氨酸終濃度0. 3g/L，瓜氨 酸終濃度為99. 4g/L，結(jié)果表明重組菌具有良好的酶轉(zhuǎn)化活性。
【權(quán)利要求】
1. 一種含有精氨酸脫亞氨基酶的大腸桿菌基因工程菌的構(gòu)建方法及其用途，其特征 在于，包括將精氨酸脫亞氨基酶基因連接，構(gòu)建重組pET28a質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21感受 態(tài)細胞，以及利用重組酶或大腸桿菌基因工程菌用于生產(chǎn)L-瓜氨酸的方法。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述大腸桿菌基因工程菌為大腸桿菌 co7i)BL21 CGMCC No. 7491 和大腸桿菌co7i)BL21 CGMCC No.7492。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述精氨酸脫亞氨基酶基因含有核苷酸 序列 SEQ ID :No. 1 或 SEQ ID :Νο· 3,含有氨基酸序列 SEQ ID :Νο· 2 或 SEQ ID :Νο· 4。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述精氨酸脫亞氨基酶基因是通過 擴增獲得，以含有精氨酸脫亞氨基酶基因序列的環(huán)境微生物群落基因組為模板，在其上游 設(shè)計I酶切位點，在其下游設(shè)計III酶切位點，其引物為： ADIPF :5' _ GGAATTC^TArgTCCGCTGAAAAACAGAAGTACG~3' ADIPR: 5' _ CCG^KmGTAATCGATCGGGTCAC-3，。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述構(gòu)建重組pET28a質(zhì)粒中，以所述 擴增的精氨酸脫亞氨基酶基因經(jīng)加A反應(yīng)后用T4連接酶連接，導(dǎo)入大腸桿菌BL21感受態(tài) 細胞。
6. 根據(jù)根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述誘導(dǎo)表達：培養(yǎng)基因工程菌 細胞至對數(shù)期，加入誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)3-8小時，培養(yǎng)溫度25-37°C。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述生產(chǎn)L-瓜氨酸的方法，濕菌體用量 1%，精氨酸底物濃度在10%左右，精氨酸轉(zhuǎn)化率99%。
【文檔編號】C12R1/19GK104212753SQ201310210386
【公開日】2014年12月17日 申請日期:2013年5月31日 優(yōu)先權(quán)日:2013年5月31日
【發(fā)明者】馬承國, 程占冰, 王開成, 李金龍 申請人:上海凱圣生物科技有限公司