植物基因組的構建方法、新品種的選育方法及新品種的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明的植物基因組構建方法，是對每一個靶區(qū)設定DNA標記M1～M5，使DNA標記M2位于靶區(qū)的上游側(cè)末端或其上游、DNA標記M1位于所述DNA標記M2的上游、DNA標記M4位于所述靶區(qū)的下游側(cè)末端或其下游、DNA標記M5位于所述DNA標記M4的下游、DNA標記M3位于所述靶區(qū)中；并使含有所述靶區(qū)且被源自所述外源品種的染色體片段所置換的所述原品種染色體中的置換區(qū)成為其上游側(cè)末端位于所述DNA標記M1與所述DNA標記M2之間、所述置換區(qū)的下游側(cè)末端位于所述DNA標記M4與所述DNA標記M5之間的方式構建基因組。
【專利說明】植物基因組的構建方法、新品種的選育方法及新品種
[0001]本申請是申請?zhí)枮?00980126662.0、申請日為2009年7月7日、發(fā)明名稱為“植
物基因組的構建方法、新品種的選育方法及新品種”的分案申請。
【技術領域】
[0002]本發(fā)明涉及ー種適合于植物品種改良的、基于非基因重組法的植物基因組構建方法，本發(fā)明還涉及使用該基因組構建方法的植物新品種的選育方法、通過該選育方法選育的植物個體及新品種、以及植物品種的鑒別方法。
[0003]本申請基于2008年7月7日在日本提出申請的特愿2008-176934號日本專利申請主張優(yōu)先權，在此引用其內(nèi)容。
【背景技術】
[0004]將屬于同一種，但因遺傳結構不同而在某種性狀上具有與其他群體不同性狀的群體稱為品種。也就是說，即使是同種的植物，但由于品種的不同，其栽培的難易性、對病蟲害的抵抗性、產(chǎn)量和品質(zhì)等也有所不同。因此，對于農(nóng)作物，特別是水稻和麥類等主要作物中，為了得到更優(yōu)良的品種自古以來在不斷進行品種改良。近年來，不只是種苗公司等，國家和縣等官方機構也在積極地進行著這種品種改良。此外，為了適應近年來消費者喜好的多祥性，除食用作物外，在花草等園藝作物等中也很盛行開發(fā)具有多種顏色、形態(tài)的新品種。
[0005]并且，近年來，作為生物こ醇等的原料，植物類資源備受關注，人們期待著開發(fā)出資源效率更聞的新品種。
[0006]隨著近年來核酸分析技術等的進步，擬南芥、水稻、小麥等各種植物的基因已被破譯，并公開了由該破譯得到的基因信息。利用這些公開了的基因信息，人們廣泛進行了基于基因重組法的、將外源種的基因?qū)胗谠贩N中的品種改良。例如已公開有Hdl基因及導入該Hdl基因的轉(zhuǎn)基因植物的選育方法等，所述Hdl基因編碼有具有提高植物感光性功能的源自植物的蛋白質(zhì)(例如參考專利文獻1)。但是，基于基因重組法的品種改良，雖然通常具有能夠?qū)氩荒茈s交的遠緣種所具有的性狀的優(yōu)點，但存在對其安全性的驗證尚不夠充分的問題。
[0007]另ー方面，作為基于非基因重組法的植物品種改良方法，有基于雜交的育種法和突變法等。在常規(guī)的基于雜交的育種法中，有系統(tǒng)育種法、群體育種法及回交育種法等。此外，廣泛使用的還有將回交育種法與MAS (Marker Assisted Selection)法相結合,將革巴基因?qū)朐贩N的品種改良。這里所謂的MAS法是指，使用與編碼目的性狀的基因連鎖的DNA標記，從由自古進行的自然雜交或人工雜交所得到的雜交后代的群體中，篩選具有目的性狀的個體的方法。通過使用該DNA標記進行個體篩選，能夠在苗階段等早期階段篩選出具有目的性狀的個體，能夠謀求省力化和高效化。作為這種使用DNA標記篩選具有特定性狀個體的篩選方法，例如公開有:使用存在于水稻半矮生性基因sd-Ι基因周邊區(qū)的DNA標記，判別植物基因型的方法；以及使用該方法的植物半矮生性性狀的檢測方法等(例如，參考專利文獻2)。[0008]現(xiàn)有技術文獻
[0009]專利文獻1:日本國特許第3660967號公報
[0010]專利文獻2:國際公開第2003/070934號
【發(fā)明內(nèi)容】
[0011]但是，在使用MAS法的品種改良方法中，存在使用DNA標記篩選出的后代個體不只是具有目的性狀的個體、DNA標記的作用僅為輔助篩選的問題。這可能是由于DNA標記通常并不是存在于所導入的性狀基因上，該性狀基因與DNA標記之間存在長度、方向不明確的距離。因此，在MAS法中，雖然能夠縮小用于評價性狀的后代個體的群體規(guī)模，但是對于使用DNA標記篩選出的后代個體，仍然需要進ー步進行性狀評價。
[0012]此外，在采用MAS法的品種改良方法中，還存在雖然目的性狀被改良，但其他性狀變差的情況很多的問題。這可能 是因為，如上所述，導入的性狀基因與DNA標記之間存在長度和方向不明確的距離，無法控制被導入的染色體片段的區(qū)，許多靶基因以外的其他基因也被導入到該植物中而引起的。
[0013]本發(fā)明的目的之ー在于提供ー種基因組構建方法及新品種選育方法，其用來在通過非基因重組法進行植物品種改良吋，對由導入的源自外源品種染色體片段所構成的置換區(qū)進行控制，不改變原品種所具有的優(yōu)良性狀地選育具有目的性狀的新品種。
[0014]本發(fā)明人為了解決上述問題進行了深入研究，結果發(fā)現(xiàn):在對使用染色體片段置換系將原品種染色體中的祀?yún)^(qū)置換成了源自外源品種的同源染色體(homo-chromosome)片段的新品種進行選育時，通過滿足下述條件(I )、(11)而能夠控制被該同源染色體片段置換的原品種的染色體區(qū)，從而完成了本發(fā)明。
[0015]( I )在靶區(qū)的上游側(cè)末端或其上游設定DNA標記M2、在DNA標記M2的上游設定DNA標記Ml ;在靶區(qū)的下游側(cè)末端或其下游設定DNA標記M4、在DNA標記M4的下游設定DNA標記M5 ;在靶區(qū)中設定DNA標記M3。
[0016](II)篩選如下的后代個體:用導入的源自外源品種的染色體片段進行置換的、原品種染色體區(qū)的上游側(cè)末端位于DNA標記Ml與M2之間，該區(qū)的下游側(cè)末端位于DNA標記M4與M5之間。
[0017](1)本發(fā)明的植物基因組構建方法，該方法使用僅將原品種染色體的一部分置換成源自外源品種的染色體片段的染色體片段置換系，將原品種染色體中的靶區(qū)以源自所述外源品種的染色體片段置換從而構建植物基因組，其針對每ー個所述靶區(qū)設定DNA標記Ml-M5,使得DNA標記M2位于所述祀?yún)^(qū)的上游側(cè)末端或其上游、DNA標記Ml位于所述DNA標記M2的上游、DNA標記M4位于所述靶區(qū)的下游側(cè)末端或其下游、DNA標記M5位于所述DNA標記M4的下游、DNA標記M3位于所述靶區(qū)中；構建基因組，使得含有所述靶區(qū)且被源自所述外源品種的染色體片段所置換的所述原品種染色體中的置換區(qū)，其上游側(cè)末端位于所述DNA標記Ml與所述DNA標記M2之間、所述置換區(qū)的下游側(cè)末端位于所述DNA標記M4與所述DNA標記M5之間。
[0018](2)本發(fā)明的新品種選育方法，該方法使用僅將原品種染色體的一部分置換成源自外源品種的染色體片段的染色體片段置換系選育新品種，該方法包括:(1-1)在所述原品種染色體的靶區(qū)的上游側(cè)末端或其上游設定DNA標記M2的步驟、在所述DNA標記M2的上游設定DNA標記Ml的步驟、在所述靶區(qū)的下游側(cè)末端或其下游設定DNA標記M4的步驟、在所述DNA標記M4的下游設定DNA標記M5的步驟及在所述靶區(qū)中設定DNA標記M3的步驟；(1-2)使所述染色體片段置換系與所述原品種雜交，得到后代個體的步驟，所述后代個體的所述DNA標記M3為源自所述原品種的等位基因與源自所述外源品種的等位基因的非同源(hetero-chromosome)染色體區(qū)；(1-3)將所述步驟(1-2)中得到的所述后代個體自交,得到后代個體的步驟；(1-4)從所述步驟(1-3)中得到的所述后代個體或從所述步驟(1-3)中得到的所述后代個體回交得到的后代個體中，篩選出所述DNA標記Ml為源自所述原品種的等位基因的同源染色體區(qū)、所述DNA標記M2及所述DNA標記M3為源自所述原品種的等位基因與源自所述外源品種的等位基因的非同源染色體區(qū)的后代個體的步驟；(1-5)通過將所述步驟(1-4)中篩選出的所述后代個體自交，從而得到后代個體的步驟；以及(1-6)從所述步驟(1-5)中得到的所述后代個體或從所述步驟(1-5)中得到的所述后代個體自交得到的后代個體中，篩選出所述DNA標記Ml及所述DNA標記M5為源自所述原品種的等位基因的同源染色體區(qū)、所述DNA標記M2、所述DNA標記M3及所述DNA標記M4為源自所述外源品種的等位基因的同源染色體區(qū)的后代個體的步驟；并且，針對所述原品種的所述染色體中的ー個或多個所述靶區(qū)，對每ー個所述靶區(qū)實施所述(1-1)-(1-6)的步驟。
[0019](3)本發(fā)明的新品種選育方法，該方法使用僅將原品種染色體的一部分置換成源自外源品種的染色體片段的染色體片段置換系選育新品種，該方法包括:(2-1)在所述原品種染色體的靶區(qū)的上游側(cè)末 端或其上游設定DNA標記M2的步驟、在所述DNA標記M2的上游設定DNA標記Ml的步驟、在所述靶區(qū)的下游側(cè)末端或其下游設定DNA標記M4的步驟、在所述DNA標記M4的下游設定DNA標記M5的步驟及在所述靶區(qū)中設定DNA標記M3的步驟；(2-2)使所述染色體片段置換系與所述原品種雜交，得到后代個體的步驟，所述后代個體的所述DNA標記M3為源自所述原品種的等位基因與源自所述外源品種的等位基因的非同源染色體區(qū)；(2-3)將所述步驟(2-2)中得到的所述后代個體自交，得到后代個體的步驟；(2-4 )從所述步驟(2-3 )中得到的所述后代個體或從所述步驟(2-3 )中得到的所述后代個體回交得到的后代個體中，篩選出所述DNA標記M5為源自所述原品種的等位基因的同源染色體區(qū)、所述DNA標記M3及所述DNA標記M4為源自所述原品種的等位基因與源自所述外源品種的等位基因的非同源染色體區(qū)的后代個體的步驟；(2-5)通過將所述步驟(2-4)中篩選出的所述后代個體自交，從而得到后代個體的步驟；以及(2-6)從所述步驟(2-5)中得到的所述后代個體或從所述步驟(2-5)中得到的所述后代個體自交得到的后代個體中，篩選出所述DNA標記Ml及所述DNA標記M5為源自所述原品種的等位基因的同源染色體區(qū)、所述DNA標記M2、所述DNA標記M3及所述DNA標記M4為源自所述外源品種的等位基因的同源染色體區(qū)的后代個體的步驟；并且，針對所述原品種的所述染色體中的ー個或多個所述靶區(qū)，對每ー個所述靶區(qū)實施所述(2-1)-(2-6)的步驟。
[0020](4)本發(fā)明的新品種選育方法，該方法使用僅將原品種染色體的一部分置換成源自外源品種的染色體片段的染色體片段置換系選育新品種，該方法包括:(3-1)在所述原品種染色體的靶區(qū)的上游側(cè)末端或其上游設定DNA標記M2的步驟、在所述DNA標記M2的上游設定DNA標記Ml的步驟、在所述靶區(qū)的下游側(cè)末端或其下游設定DNA標記M4的步驟、在所述DNA標記M4的下游設定DNA標記M5的步驟及在所述靶區(qū)中設定DNA標記M3的步驟；(3-2)使所述染色體片段置換系與所述原品種雜交，得到后代個體的步驟，所述后代個體的所述DNA標記M3為源自所述原品種的等位基因與源自所述外源品種的等位基因的非同源染色體區(qū)；(3-3)將所述步驟(3-2)中得到的所述后代個體自交，得到后代個體的步驟；(3-4 )從所述步驟(3-3 )中得到的所述后代個體或從所述步驟(3-3 )中得到的所述后代個體回交得到的后代個體中，篩選出DNA標記Ml及所述DNA標記M5中的任意一個為源自所述原品種的等位基因的同源染色體區(qū)、另ー個為源自所述原品種的等位基因與源自所述外源品種的等位基因的非同源染色體區(qū)的后代個體的步驟；(3-5)通過將所述步驟(3-4)中篩選出的所述后代個體自交，從而得到后代個體的步驟；以及(3-6)從所述步驟(3-5)中得到的所述后代個體或從所述步驟(3-5)中得到的所述后代個體自交得到的后代個體中，篩選出所述DNA標記Ml及所述DNA標記M5為源自所述原品種的等位基因的同源染色體區(qū)、所述DNA標記M2、所述DNA標記M3及所述DNA標記M4為源自所述外源品種的等位基因的同源染色體區(qū)的后代個體的步驟；并且，針對所述原品種的所述染色體中的ー個或多個所述靶區(qū)，對每ー個所述靶區(qū)實施所述(3-1)-(3-6)的步驟。
[0021](5)上述(4)所述的新品種選育方法，還可以在所述步驟(3-4)之后、所述步驟(3-5)之前，實施(3-7-1)及(3-7-2)步驟:(3-7-1)通過將所述步驟(3_4)中篩選出的所述后代個體自交，從而得到后代個體的步驟；(3-7-2)從所述步驟(3-7-1)中得到的所述后代個體或從所述步驟(3-7-1)中得到的所述后代個體回交得到的后代個體或從所述步驟(3-7-1)中得到的所述后代個體自交得到的后代個體再進行回交得到的后代個體中，篩選出(i1-1)所述DNA標記Ml為源自所述原品種的等位基因的同源染色體區(qū)、且所述DNA標記M2及所述DNA標記M3為源自所述原品種的等位基因與源自所述外源品種的等位基因的非同源染色體區(qū)的后代個體；或者篩選出 (? -2)所述DNA標記M5為源自所述原品種的等位基因的同源染色體區(qū)、且所述DNA標記M3及DNA標記M4為源自所述原品種的等位基因與源自所述外源品種的等位基因的非同源染色體區(qū)的后代個體的步驟；所述步驟(3-5)為(3-5’)通過將所述步驟(3-7-2)中篩選出的所述后代個體自交，從而得到后代個體的步驟；所述步驟(3-6 )為(3-6 ’)從所述步驟(3-5 ’)中得到的所述后代個體或從所述步驟(3-5 ’)中得到的所述后代個體自交得到的后代個體中，篩選出所述DNA標記Ml及所述DNA標記M5為源自所述原品種的等位基因的同源染色體區(qū)；所述DNA標記M2、DNA標記M3及DNA標記M4為源自所述外源品種的等位基因的同源染色體區(qū)的后代個體的步驟。
[0022](6)上述(2)-(4)所述的新品種選育方法，還可以是所述DNA標記M2為所述靶區(qū)的上游側(cè)末端或其附近的DNA標記；所述DNA標記Ml為所述DNA標記M2附近的DNA標記；所述DNA標記M4為所述靶區(qū)的下游側(cè)末端或其附近的DNA標記；所述DNA標記M5為所述DNA標記M4附近的DNA標記。
[0023](7)上述(2)-(4)所述的新品種選育方法，所述靶區(qū)可以為ー個基因區(qū)。
[0024](8)上述(2)-(4)所述的新品種選育方法，所述靶區(qū)可以為兩個以上的基因區(qū)。
[0025](9)上述(2)-(4)所述的新品種選育方法，所述原品種可以為自花授粉植物或常異花授粉植物。
[0026](10)上述(2)-(4)所述的新品種選育方法,所述原品種可以為禾本科植物品種。
[0027](11)上述(2)-(4)所述的新品種選育方法，所述原品種可以為水稻品種。
[0028](12)上述(11)所述的新品種選育方法，所述水稻品種可以為越光。
[0029](13)本發(fā)明的品種，其為使用上述(2)-(4)中之任一所述的新品種選育方法選育得到的品種，所述原品種染色體中的靶區(qū)被源自所述外源品種的同源染色體片段置換。
[0030](14)本發(fā)明的后代個體，其為由上述(13)所述品種的個體與上述(13)所述品種個體的后代個體所組成的群體中選擇兩個個體，使其雜交得到的。
[0031](15)上述(14)所述的后代個體，所述原品種染色體中的多個所述靶區(qū)可以被源自所述外源品種的所述同源染色體片段置換。
[0032](16)上述(14)所述的后代個體，所述兩個個體各自的靶區(qū)可以不同。
[0033](17)本發(fā)明的后代個體，其為將由上述(13)所述品種的個體和上述(13)所述品種的個體之后代個體所組成的群體中選擇的個體，作為母本或父本使用，通過所述母本或所述父本的雜交得到的。
[0034](18)本發(fā)明的新品種選育方法，其包括:(4-1)以上述(13)所述品種或上述(15)所述后代個體為母本，以所述靶區(qū)與所述母本不同的上述(13)所述品種或上述(15)所述后代個體為父本，將所述母本與所述父本雜交，得到后代個體的步驟；(4-2)通過將所述步驟(4-1)中得到的所述后代個體自交，從而得到后代個體的步驟；以及(4-3)從所述步驟(4-2)中得到的所述后代個體中，篩選出所述原品種染色體中、所述母本所具有的所述靶區(qū)及所述父本所具有的所述靶區(qū) 均被源自所述外源品種的所述同源染色體片段置換的后代個體的步驟。
[0035](19)上述(18)所述的新品種選育方法，在所述步驟(4-3)之后還可以包括:(4-4)從上述(13)所述品種或上述(15)所述后代個體及所述步驟(4-3)中篩選出的個體所組成的群體中，選擇所述靶區(qū)相互不同的兩個個體作為母本及父本，使其雜交得到后代個體的步驟；(4-5)通過將所述步驟(4-4)中得到的所述后代個體自交，從而得到后代個體的步驟；(4-6)從所述步驟(4-5)中得到的所述后代個體中，篩選出所述原品種染色體中、所述母本所具有的所述靶區(qū)及所述父本所具有的所述靶區(qū)均被源自所述外源品種的所述同源染色體片段置換的后代個體的步驟；以及(4-7)將所述步驟(4-4)-(4-6)重復一次以上的步驟。
[0036](20)本發(fā)明的植物品種鑒別方法，其用于鑒別某種植物個體是否為使用上述
(2)-(4)中之任一所述的新品種選育方法選育得到的特定品種，通過所述植物個體的基因組分析，將選自所述DNA標記Ml-M5中的ー種以上的所述DNA標記進行分型；當?shù)玫降姆中徒Y果與所述特定品種的結果一致時，鑒定所述植物個體為所述特定品種。
[0037](21)本發(fā)明的新品種，其為染色體的一部分被源自外源品種的染色體片段置換的染色體片段置換系的后代品種；染色體區(qū)的一個或多個靶區(qū)被源自所述外源品種的所述染色體片段置換；所述染色體片段的長度通過設定在所述靶區(qū)上游的DNA標記與設定在所述靶區(qū)下游的DNA標記進行控制。
[0038](22)本發(fā)明的越光為國際保藏號為FERM BP-11140的水稻品種(Oryza sativaL.cultivar)越光桿 4 號(Koshihikari kazusa4go)。
[0039](23)本發(fā)明的后代個體，其為由上述(22)所述品種的個體及上述(17)所述后代個體所組成的群體中選擇的兩個個體雜交得到的。
[0040](24)本發(fā)明的植物品種鑒別方法，其用于鑒別某種植物個體是否為特定品種；將SP-4009作為DNA標記Ml、將G2003作為DNA標記M2、將G2002作為DNA標記M3、將SP-462作為DNA標記M4、將SP-1259作為DNA標記M5 ;通過所述植物個體的基因組分析，將選自所述DNA標記Ml-M5中的ー種以上的所述DNA標記進行分型；當?shù)玫降姆中徒Y果與水稻品種越光H4號(Koshihikari eichi4go)或水稻品種越光籽4號的結果一致時,鑒定所述植物個體為水稻品種越光H4號或水稻品種越光籽4號。
[0041](25)本發(fā)明的植物品種鑒別方法，其用于鑒別某種植物個體是否為特定品種；將SP-2032作為DNA標記Ml、將SP-170作為DNA標記M2、將SP-4028作為DNA標記M3、將SP-4038作為DNA標記M4、將SP-4030作為DNA標記M5，通過所述植物個體的基因組分析，將選自所述DNA標記Ml-M5中的ー種以上的所述DNA標記進行分型；當?shù)玫降姆中徒Y果與水稻品種越光H2號(Koshihikari eichi2go)或水稻品種越光籽4號的結果一致時,鑒定所述植物個體為水稻品種越光H2號或水稻品種越光籽4號。
[0042](26)本發(fā)明的植物品種鑒別方法，其用于鑒別某種植物個體是否為特定品種；將SP-2513作為DNA標記Ml、將SP-586作為DNA標記M2、將SP-2254作為DNA標記M3、將SP-1603作為DNA標記M4、將SP-604作為DNA標記M5 ;通過所述植物個體的基因組分析，將選自所述DNA標記Ml-M5中的ー種以上的所述DNA標記進行分型；當?shù)玫降姆中徒Y果與水稻品種越光H3號(Koshihikari eichi3go)或水稻品種越光籽4號的結果一致時,鑒定所述植物個體為水稻品種越光H3號或水稻品種越光籽4號。
[0043]發(fā)明效果
[0044]通過使用本發(fā)明的植物基因組構建方法、以及使用該植物基因組構建方法的本發(fā)明的新品種選育方法，能夠控制被源自外源品種的同源染色體片段置換的原品種染色體區(qū)。因此，能夠?qū)⑿誀罨蛞酝獾墓δ懿幻鞯钠渌虼罅勘粚朐贩N染色體的問題以及損害原品種所具有的優(yōu)良 性狀的問題抑制在最小限度，同時將目的性狀導入原品種中。
[0045]此外，用本發(fā)明的新品種選育方法選育新品種或以其后代個體為親本選育新品種，能夠得到完全遺傳了母本和父本所分別具有的、源自外源品種的同源染色體片段的后代個體。其結果能夠?qū)p害原品種所具有的優(yōu)良性狀的問題抑制在最小限度，同時能夠簡便且安全地改良原品種的多種性狀。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0046]圖1為表示原品種染色體G上的靶區(qū)T、導入至該染色體G的源自外源品種的染色體片段し及DNA標記Ml-M5的示意圖。
[0047]圖2A為表示在本發(fā)明第一新品種選育方法的步驟(1-3)中得到的后代個體中，步驟(1-4)中優(yōu)選的后代個體的染色體區(qū)的示意圖；圖中，反白的粗線表示源自原品種的等位基因，涂黑的粗線表示源自外源品種的等位基因。
[0048]圖2B為表示在該選育方法的步驟(1-3)中得到的后代個體中，步驟(1-4)中優(yōu)選的后代個體的染色體區(qū)的示意圖；圖中，反白的粗線表示源自原品種的等位基因，涂黑的粗線表示源自外源品種的等位基因。
[0049]圖2C為表示在該選育方法的步驟(1-3)中得到的后代個體中，步驟(1-4)中優(yōu)選的后代個體的染色體區(qū)的示意圖；圖中，反白的粗線表示源自原品種的等位基因，涂黑的粗線表示源自外源品種的等位基因。
[0050]圖2D為表示在該選育方法的步驟(1-5)中得到的后代個體中，步驟(1-6)中優(yōu)選的后代個體的染色體區(qū)的示意圖；圖中，反白的粗線表示源自原品種的等位基因，涂黑的粗線表示源自外源品種的等位基因。
[0051]圖2E為表示在該選育方法的步驟(1-5)中得到的后代個體中，步驟(1-6)中優(yōu)選的后代個體的染色體區(qū)的示意圖；圖中，反白的粗線表示源自原品種的等位基因，涂黑的粗線表示源自外源品種的等位基因。
[0052]圖2F為表示在該選育方法的步驟(1-5)中得到的后代個體中，步驟(1-6)中優(yōu)選的后代個體的染色體區(qū)的示意圖；圖中，反白的粗線表示源自原品種的等位基因，涂黑的粗線表示源自外源品種的等位基因。
[0053]圖3A為表示在本發(fā)明第二新品種選育方法的步驟(2-3)中得到的后代個體中，步驟(2-4)中優(yōu)選的后代個體的染色體區(qū)的示意圖；圖中，反白的粗線表示源自原品種的等位基因，涂黑的粗線表示源自外源品種的等位基因。
[0054]圖3B為表示在該選育方法的步驟(2-3)中得到的后代個體中，步驟(2_4)中優(yōu)選的后代個體的染色體區(qū)的示意圖；圖中，反白的粗線表示源自原品種的等位基因，涂黑的粗線表示源自外源品種的等位基因。
[0055]圖3C為表示在該選育方法的步驟(2-3)中得到的后代個體中，步驟(2-4)中優(yōu)選的后代個體的染色體區(qū)的示意圖；圖中，反白的粗線表示源自原品種的等位基因，涂黑的粗線表示源自外源品種的等位基因。
[0056]圖3D為表示在該選育方法的步驟(2-5)中得到的后代個體中，步驟(2_6)中優(yōu)選的后代個體的染色體區(qū)的示意圖；圖中，反白的粗線表示源自原品種的等位基因，涂黑的粗線表示源自外源品種的等位基因。
[0057]圖3E為表示在該選育方法的步驟(2-5)中得到的后代個體中，步驟(2_6)中優(yōu)選的后代個體的染色體區(qū)的示意圖；圖中，反白的粗線表示源自原品種的等位基因，涂黑的粗線表示源自外源品種的等位基因。
[0058]圖3F為表示在該選育方法的步驟(2-5)中得到的后代個體中，步驟(2_6)中優(yōu)選的后代個體的染色體區(qū)的示意圖；圖中，反白的粗線表示源自原品種的等位基因，涂黑的粗線表示源自外源品種的等位基因。
[0059]圖4A為表示在本發(fā)明第三新品種選育方法的步驟(3-3)中得到的后代個體中，步驟(3-4)中優(yōu)選的后代個體的染色體區(qū)的示意圖；圖中，反白的粗線表示源自原品種的等位基因，涂黑的粗線表示源自外源品種的等位基因。
[0060]圖4B為表示在該選育方法的步驟(3-3)中得到的后代個體中，在步驟(3-4)中優(yōu)選的后代個體的染色體區(qū)的示意圖；圖中，反白的粗線表示源自原品種的等位基因，涂黑的粗線表示源自外源品種的等位基因。
[0061]圖4C為表示在該選育方法的步驟(3-3)中得到的后代個體中，步驟(3-4)中優(yōu)選的后代個體的染色體區(qū)的示意圖；圖中，反白的粗線表示源自原品種的等位基因，涂黑的粗線表示源自外源品種的等位基因。
[0062]圖4D為表示在該選育方法的步驟(3-3)中得到的后代個體中，步驟(3_4)中優(yōu)選的后代個體的染色體區(qū)的示意圖；圖中，反白的粗線表示源自原品種的等位基因，涂黑的粗線表示源自外源品種的等位基因。[0063]圖4E為表示在該選育方法的步驟(3-3)中得到的后代個體中，步驟(3_4)中優(yōu)選的后代個體的染色體區(qū)的示意圖；圖中，反白的粗線表示源自原品種的等位基因，涂黑的粗線表示源自外源品種的等位基因。
[0064]圖4F為表示在該選育方法的步驟(3-3)中得到的后代個體中，步驟(3_4)中優(yōu)選的后代個體的染色體區(qū)的示意圖；圖中，反白的粗線表示源自原品種的等位基因，涂黑的粗線表示源自外源品種的等位基因。
[0065]圖5A為表示在本發(fā)明第三新品種選育方法的步驟(3-5)中得到的后代個體中，步驟(3-6)中優(yōu)選的后代個體的染色體區(qū)的示意圖；圖中，反白的粗線表示源自原品種的等位基因，涂黑的粗線表示源自外源品種的等位基因。
[0066]圖5B為表示在該選育方法的步驟(3-5)中得到的后代個體中，步驟(3_6)中優(yōu)選的后代個體的染色體區(qū)的示意圖；圖中，反白的粗線表示源自原品種的等位基因，涂黑的粗線表示源自外源品種的等位基因。
[0067]圖5C為表示在該選育方法的步驟(3-5)中得到的后代個體中，步驟(3-6)中優(yōu)選的后代個體的染色體區(qū)的示意圖；圖中，反白的粗線表示源自原品種的等位基因，涂黑的粗線表示源自外源品種的等位基因。
[0068]圖?為表示在該選育方法的步驟(3-5)中得到的后代個體中，步驟(3-6)中優(yōu)選的后代個體的染色體區(qū)的示 意圖；圖中，反白的粗線表示源自原品種的等位基因，涂黑的粗線表示源自外源品種的等位基因。
[0069]圖5E為表示在該選育方法的步驟(3-5)中得到的后代個體中，步驟(3_6)中優(yōu)選的后代個體的染色體區(qū)的示意圖；圖中，反白的粗線表示源自原品種的等位基因，涂黑的粗線表示源自外源品種的等位基因。
[0070]圖5F為表示在該選育方法的步驟(3-5)中得到的后代個體中，步驟(3-6)中優(yōu)選的后代個體的染色體區(qū)的示意圖；圖中，反白的粗線表示源自原品種的等位基因，涂黑的粗線表示源自外源品種的等位基因。
[0071]圖6A為表示在步驟(3-7-1)得到的后代個體中，步驟(3-7-2)中較為優(yōu)選的后代個體的染色體區(qū)的示意圖；圖中，反白的粗線表示源自原品種的等位基因，涂黑的粗線表示源自外源品種的等位基因。
[0072]圖6B為表示在步驟(3-7-1)得到的后代個體中，步驟(3-7-2 )中較為優(yōu)選的后代個體的染色體區(qū)的示意圖；圖中，反白的粗線表示源自原品種的等位基因，涂黑的粗線表示源自外源品種的等位基因。
[0073]圖6C為表示在步驟(3-7-1)得到的后代個體中，步驟(3-7-2)中較為優(yōu)選的后代個體的染色體區(qū)的示意圖；圖中，反白的粗線表示源自原品種的等位基因，涂黑的粗線表示源自外源品種的等位基因。
[0074]圖6D為表示在步驟(3-7-1)得到的后代個體中，步驟(3-7-2 )中較為優(yōu)選的后代個體的染色體區(qū)的示意圖；圖中，反白的粗線表示源自原品種的等位基因，涂黑的粗線表示源自外源品種的等位基因。
[0075]圖7A為表示在步驟(3-7-1)得到的后代個體中，步驟(3-7-2 )中較為優(yōu)選的后代個體的染色體區(qū)的示意圖；圖中，反白的粗線表示源自原品種的等位基因，涂黑的粗線表示源自外源品種的等位基因。
[0076]圖7B為表示在步驟(3-7-1)得到的后代個體中，步驟(3-7-2)中較為優(yōu)選的后代個體的染色體區(qū)的示意圖；圖中，反白的粗線表示源自原品種的等位基因，涂黑的粗線表示源自外源品種的等位基因。
[0077]圖7C為表示在步驟(3-7-1)得到的后代個體中，步驟(3-7-2)中較為優(yōu)選的后代個體的染色體區(qū)的示意圖；圖中，反白的粗線表示源自原品種的等位基因，涂黑的粗線表示源自外源品種的等位基因。
[0078]圖7D為表示在步驟(3-7-1)得到的后代個體中，步驟(3-7-2)中較為優(yōu)選的后代個體的染色體區(qū)的示意圖；圖中，反白的粗線表示源自原品種的等位基因，涂黑的粗線表示源自外源品種的等位基因。
[0079]圖7E為表示在步驟(3-7-1)得到的后代個體中，步驟(3-7-2)中較為優(yōu)選的后代個體的染色體區(qū)的示意圖；圖中，反白的粗線表示源自原品種的等位基因，涂黑的粗線表示源自外源品種的等位基因。
[0080]圖7F為表示在步驟(3-7-1)得到的后代個體中，步驟(3-7-2 )中較為優(yōu)選的后代個體的染色體區(qū)的示意圖；圖中，反白的粗線表示源自原品種的等位基因，涂黑的粗線表示源自外源品種的等位基因。
[0081 ] 圖7G為表示在步驟(3-7-1)得到的后代個體中，步驟(3-7-2 )中較為優(yōu)選的后代個體的染色體區(qū)的示意圖；圖中，反白的粗線表示源自原品種的等位基因，涂黑的粗線表示源自外源品種的等位基因。
[0082]圖8A為表示在步驟(3-7-1)得到的后代個體中，步驟(3-7-2)中較為優(yōu)選的后代個體的染色體區(qū)的示意圖；圖中，反白的粗線表示源自原品種的等位基因，涂黑的粗線表示源自外源品種的等位基因。
[0083]圖8B為表示在步驟 (3-7-1)得到的后代個體中，步驟(3-7-2 )中較為優(yōu)選的后代個體的染色體區(qū)的示意圖；圖中，反白的粗線表示源自原品種的等位基因，涂黑的粗線表示源自外源品種的等位基因。
[0084]圖8C為表示在步驟(3-7-1)得到的后代個體中，步驟(3-7-2)中較為優(yōu)選的后代個體的染色體區(qū)的示意圖；圖中，反白的粗線表示源自原品種的等位基因，涂黑的粗線表示源自外源品種的等位基因。
[0085]圖8D為表示在步驟(3-7-1)得到的后代個體中，步驟(3-7-2 )中較為優(yōu)選的后代個體的染色體區(qū)的示意圖；圖中，反白的粗線表示源自原品種的等位基因，涂黑的粗線表示源自外源品種的等位基因。
[0086]圖9A為表示在步驟(3-7-1)得到的后代個體中，步驟(3-7-2)中較為優(yōu)選的后代個體的染色體區(qū)的示意圖；圖中，反白的粗線表示源自原品種的等位基因，涂黑的粗線表示源自外源品種的等位基因。
[0087]圖9B為表示在步驟(3-7-1)得到的后代個體中，步驟(3-7-2 )中較為優(yōu)選的后代個體的染色體區(qū)的示意圖；圖中，反白的粗線表示源自原品種的等位基因，涂黑的粗線表示源自外源品種的等位基因。
[0088]圖9C為表示在步驟(3-7-1)得到的后代個體中，步驟(3-7-2)中較為優(yōu)選的后代個體的染色體區(qū)的示意圖；圖中，反白的粗線表示源自原品種的等位基因，涂黑的粗線表示源自外源品種的等位基因。
[0089]圖9D為表示在步驟(3-7-1)得到的后代個體中，步驟(3-7-2 )中較為優(yōu)選的后代個體的染色體區(qū)的示意圖；圖中，反白的粗線表示源自原品種的等位基因，涂黑的粗線表示源自外源品種的等位基因。
[0090]圖9E為表示在步驟(3-7-1)得到的后代個體中，步驟(3-7-2 )中較為優(yōu)選的后代個體的染色體區(qū)的示意圖；圖中，反白的粗線表示源自原品種的等位基因，涂黑的粗線表示源自外源品種的等位基因。
[0091]圖9F為表示在步驟(3-7-1)得到的后代個體中，步驟(3-7-2)中較為優(yōu)選的后代個體的染色體區(qū)的示意圖；圖中，反白的粗線表示源自原品種的等位基因，涂黑的粗線表示源自外源品種的等位基因。
[0092]圖9G為表示在步驟(3-7-1)得到的后代個體中，步驟(3-7-2)中較為優(yōu)選的后代個體的染色體區(qū)的示意圖；圖中，反白的粗線表示源自原品種的等位基因，涂黑的粗線表示源自外源品種的等位基因。
[0093]圖10A為表示將原品種染色體中的三個靶區(qū)(祀?yún)^(qū)A、B、C)置換成源自外源品種的染色體片段的品種選育方法的模式圖。
[0094]圖10B為表示將原品種染色體中的三個靶區(qū)(靶區(qū)A、B、C)置換成源自外源品種的染色體片段的品種選育方法的模式圖。
[0095]圖11A為表示將原品種染色體中的四個靶區(qū)(靶區(qū)A、B、C、D)置換成源自外源品種的染色體片段的品種選育方法的模式圖。
[0096]圖11B為表示將原品種染色體中的四個靶區(qū)(靶區(qū)A、B、C、D)置換成源自外源品種的染色體片段的品種選育方法的模式圖。
[0097]圖11C為表示將原品種染色體中的四個靶區(qū)(靶區(qū)A、B、C、D)置換成源自外源品種的染色體片段的品種選育方法的模式圖。
[0098]圖12A為表示將原品 種染色體中的五個靶區(qū)(靶區(qū)A、B、C、D、E)置換成源自外源品種的染色體片段的品種選育方法的模式圖。
[0099]圖12B為表示將原品種染色體中的五個靶區(qū)(靶區(qū)A、B、C、D、E)置換成源自外源品種的染色體片段的品種選育方法的模式圖。
[0100]圖12C為表示將原品種染色體中的五個靶區(qū)(靶區(qū)A、B、C、D、E)置換成源自外源品種的染色體片段的品種選育方法的模式圖。
[0101]圖12D為表示將原品種染色體中的五個靶區(qū)(靶區(qū)A、B、C、D、E)置換成源自外源品種的染色體片段的品種選育方法的模式圖。
[0102]圖13A為表示將原品種染色體中的六個靶區(qū)(靶區(qū)A、B、C、D、E、F)置換成源自外源品種的染色體片段的品種選育方法的模式圖。
[0103]圖13B為表示將原品種染色體中的六個靶區(qū)(靶區(qū)A、B、C、D、E、F)置換成源自外源品種的染色體片段的品種選育方法的模式圖。
[0104]圖13(:為表示將原品種染色體中的六個靶區(qū)(靶區(qū)ム、8、(:、0』、？)置換成源自外源品種的染色體片段的品種選育方法的模式圖。
[0105]圖13D為表示將原品種染色體中的六個靶區(qū)(靶區(qū)A、B、C、D、E、F)置換成源自外源品種的染色體片段的品種選育方法的模式圖。
[0106]圖13E為表示將原品種染色體中的六個靶區(qū)(靶區(qū)A、B、C、D、E、F)置換成源自外源品種的染色體片段的品種選育方法的模式圖。
[0107]圖14A為表示將一次篩選群體中的目的后代個體的存在概率設為1/64-1/16而選育品種P6 (AB⑶EF)的方法的模式圖。
[0108]圖14B為表示將一次篩選群體中的目的后代個體的存在概率設為1/64-1/16而選育品種P6 (AB⑶EF)的方法的模式圖。
[0109]圖14C為表示將一次篩選群體中的目的后代個體的存在概率設為1/64-1/16而選育品種P6 (AB⑶EF)的方法的模式圖。
[0110]圖15為表不用于制成越光H4號的DNA標記的不意圖。
[0111]圖16為模擬表不越光H4號基因組的不意圖。
[0112]圖17為越光H4號與越光的抗倒伏性的比較圖；前面的田地為越光，里面的田地為越光H4號。
[0113]圖18為表不用于制成越光H2號的DNA標記的不意圖。
[0114]圖19為ネ旲擬表不越光H2號基因組的不意圖。
[0115]圖20為表不用于制成越光H3號的DNA標記的不意圖。
[0116]圖21為模擬表不越光H3號基因組的不意圖。
[0117]圖22為模擬表示越光籽4號基因組的示意圖。
【具體實施方式】
[0118]本發(fā)明中，所謂染色體片段置換系是指僅將原品種染色體的一部分置換成源自外源品種的染色體片段的體系。
[0119]外源品種為原品種以外的品種即可，沒有特別限定，可以是與原品種同種的植物品種，也可以是與原品種不同種的植物品種，還可以是動物等除植物以外的品種。
[0120]本發(fā)明中所謂品種是指，屬于同種植物，但由于基因結構不同而在某種性狀上明顯區(qū)別于同種內(nèi)的其他品種的群體。
[0121]本發(fā)明中，所謂靶區(qū)是指屬于原品種染色體中的區(qū)且與源自外源品種的染色體片段進行置換的目標區(qū)。例如，在水稻、小麥、擬南芥等基因信息已被充分破譯的植物品種中，通過將含有目的性狀基因的特定的染色體區(qū)，與源自外源品種的染色體片段進行置換，從而能夠選育出改良了原品種性狀的新品種。在此，原品種的靶區(qū)只要是與在用作親本的染色體片段置換系的染色體中被源自外源品種的染色體片段置換的部分區(qū)相對應的區(qū)即可，沒有特別限定，可以是ー個基因區(qū)，也可以是含有兩個以上基因的區(qū)。例如，在外源品種是與原品種不同種的品種的情況等時，靶區(qū)優(yōu)選為ー個基因區(qū)。此外，外源品種為與原品種同種的其他品種的情況等的、外源品種為原品種的近緣種時，靶區(qū)可以是ー個基因區(qū)，也可以是含有兩個以上基因的區(qū)。
[0122]該基因區(qū)，可以只是翻譯區(qū)，也可以在翻譯區(qū)之上還包括內(nèi)含子等非翻譯區(qū)、啟動子區(qū)或終止子區(qū)等控制區(qū)等的區(qū)。
[0123]在本發(fā)明中，DNA標記只要能識別源自原品種的染色體與源自外源品種的染色體，即，能檢測出原品種與外源品種染色體上的DNA序列差異即可，沒有特別限制，可以使用在基因分析領域中常用的DNA標記。作為該DNA標記，例如可以是能檢測出SNP (SingleNucleotide Polymorphism,單核苷酸多態(tài)性)、SSR(Simple Sequence Repeats,簡單重復序列)的不同重復數(shù)等的基因多態(tài)性的標記，也可以是RFLP (Restriction Fragment LengthPolymorphism,限制酶片段長度多態(tài)性)標記。[0124]使用這些DNA標記對源自原品種的等位基因與源自外源品種的等位基因進行識別時，可以通過常規(guī)方法進行。例如，以從各個體中提取的DNA為模型，使用能與特定的SNP或SSR進行特異性雜交的引物等進行PCR。然后，使用電泳方法等檢測是否有PCR產(chǎn)物，從而能夠在原品種和外源品種中識別SNP或SSR的各多態(tài)性。并且，將從各個體中提取的DNA經(jīng)限制酶處理后，用電泳方法等檢測是否有PCR產(chǎn)物，同樣能夠識別各多態(tài)性。能與特定的SNP或SSR進行特異性雜交的引物等可以根據(jù)SNP或SSR的堿基序列，采用通用的引物設計工具等，以常規(guī)方法來設計。此外，可以使用在本【技術領域】中已知的任意方法合成設計出的引物等。
[0125]這些DNA標記可以適當使用公知的DNA標記。此外，也可以為新制備的DNA標記。例如，使用關于水稻的公知DNA標記時，可以使用專利文獻2等中公開的SNP標記、由Rice benome Resear ch Program khttp://rgp.dna.affrc.g0.jp/publicdata.htm丄ノ公開的DNA標記。使用關于大麥的公知DNA標記時，可以使用由GrainGenes:ADatabase forTriticeae and Avena(http://wheat, pw.usda.gov/GG2/inde x.shtml)>CR-EST:The IPKCrop EST Database (http://pgrc.1pk-g atersleben.de/est/index.php)等公開的 DNA標記。使用關于高粱的公知DNA標記時，可以使用由GRAMENE (http://www.gramene.0rg/d b/markers/marker_view)等公開的DNA標記。使用關于小麥的公知DNA標記時,可以使用由 GrainGenes:A Database for Triticeae and Avena>WHEAT CAP (http://maswheat.ucdavis.edu/)等公開的DNA標記。使用關于 玉米的公知DNA標記時，可以使用MaizaGDB(htt p://www.maizegdb.0rg/)等公開的DNA標記。此外,GRAMENE中也公開了其他谷物的DNA標記，還可以使用這些標記。
[0126]首先，對本發(fā)明的植物基因組構建方法進行說明。
[0127]本發(fā)明的植物基因組構建方法，其使用僅將原品種染色體的一部分置換成源自外源品種的染色體片段的染色體片段置換系，構建將原品種染色體中的ー個或多個靶區(qū)以源自所述外源品種的染色體片段置換的植物基因組。該方法針對每ー個所述靶區(qū)設定滿足下述必要條件(i )的DNA標記Ml-M5。此時，使含該靶區(qū)且被源自外源品種的染色體片段置換的原品種染色體中的置換區(qū)，其上游側(cè)末端位于DNA標記Ml與M2之間、其下游側(cè)末端位于DNA標記M4與M5之間，如此構建基因組。
[0128]( i ) DNA標記M2位于靶區(qū)的上游側(cè)末端或其上游；DNA標記Ml位于DNA標記M2的上游；DNA標記M4位于靶區(qū)的下游側(cè)末端或其下游；DNA標記M5位于DNA標記M4的下游；DNA標記M3位于靶區(qū)中。
[0129]本發(fā)明中，上游側(cè)是指染色體的短臂側(cè)；下游側(cè)是指染色體的長臂側(cè)。
[0130]通過以滿足上述必要條件(i )的方式設定各DNA標記Ml-M5，能夠控制導入到原品種染色體中的源自外源品種的染色體片段的長度，即能夠控制被該染色體片段置換的原品種染色體中的置換區(qū)。因此，通過使用本發(fā)明的植物基因組構建方法，能夠使除靶基因以外的多個其他基因大量被導入原品種染色體的問題以及存在于靶區(qū)附近的除靶基因以外的基因被源自外源品種的染色體所置換的問題抑制在最小限度的，同時使源自外源品種的靶基因?qū)氲皆贩N染色體中，如此構建基因組。
[0131]DNA標記Ml-M5可根據(jù)各品種所屬植物的種的公知基因信息等進行設定。各品種的基因信息等，例如可以在國際堿基序列數(shù)據(jù)庫NCBI (National center forBiotechnology Information)和 DDBJ (DNA Data Bank of Japan)等中獲得。尤其是水稻各品種的基因信息，可以在 KOME (Knowledge-based Oryza Molecular biologicalEncyclopedia、http://cdna01.dna.affrc.g0.jp/cDNA/)等中獲得。
[0132]圖1為原品種染色體G上的靶區(qū)T、置換的源自外源品種的染色體片段L及DNA標記Ml-M5的示意圖。源自外源品種的染色體片段L的上游側(cè)末端，即，被源自外源品種的染色體片段L置換的原品種染色體中的置換區(qū)的上游側(cè)末端，位于DNA標記Ml與DNA標記M2之間。另ー方面，源自外源品種的染色體片段L的下游側(cè)末端，即，被源自外源品種的染色體片段L置換的原品種染色體中的置換區(qū)的下游側(cè)末端，位于DNA標記M4與M5之間。因此，若以DNA標記Ml與M2之間的距離為dl、DNA標記M2與M4之間的距離為d2、DNA標記M4與M5之間的距離為d3，則源自外源品種的染色體片段L的長度(置換區(qū)的長度)如下述式(1)所示。
[0133]式(1) d2≤源自外源品種染色體片段L的長度≤dl+d2+d3
[0134]通過將DNA標記M2設定在原品種染色體G的上游側(cè)(遠離靶區(qū)T的方向)，使源自外源品種的染色體片段L的長度延長。另ー方面，通過將DNA標記M2設定在原品種染色體G的下游側(cè)(靠近靶區(qū)T的方向)，使源自外源品種的染色體片段L的長度縮短。同樣地，通過將DNA標記M4設定在原品種染色體G的下游側(cè)，使源自外源品種的染色體片段L的長度延長；通過將其設定在原品種染色體G的上游側(cè)，使源自外源品種的染色體片段L的長度縮短。
[0135]此外，若DNA標記Ml與M2之間的距離dl延長，則源自外源品種的染色體片段L的上游側(cè)末端能夠存在的范圍擴大。因此，被導入的源自外源品種的染色體片段L的長度難以確定。另ー方面，若該距離dl縮短，則源自外源品種的染色體片段L的上游側(cè)末端能夠存在的范圍縮小。因此，被導入的源自外源品種的染色體片段L的長度變得容易確定。
[0136]同樣地，若DNA標記M4與M5之間的距離d3延長，則源自外源品種的染色體片段L的下游側(cè)末端能夠存在的范圍擴大，難以確定被導入的源自外源品種的染色體片段L的長度。若該距離d3縮短，則源自外源品種的染色體片段L的下游側(cè)末端能夠存在的范圍縮小，容易確定被導入的源自外源品種的染色體片段L的長度。
[0137]源自外源品種的染色體片段L的長度越長，則存在于靶區(qū)T兩側(cè)的基因與存在于靶區(qū)T的靶基因一同被導入原品種的可能性越高。除靶基因以外的基因也被導入到原品種染色體，這將導致存在于原品種的除靶基因以外的基因也被源自外源品種的染色體片段L所置換。其結果可能會導致無意中損害原品種所具有的優(yōu)異性狀。被導入原品種染色體的除靶基因以外的基因越少，即源自外源品種的染色體片段L的長度越接近靶區(qū)T的長度，越能夠抑制原品種的優(yōu)良性狀被置換的可能性，因此優(yōu)選。
[0138]DNA標記M2及Ml越接近祀?yún)^(qū)T的上游側(cè)末端，并且DNA標記M4及M5越接近革巴區(qū)T的下游側(cè)末端，則源自外源品種的染色體片段L的長度越短。其結果能夠縮短被導入到原品種染色體中的、源自外源品種的染色體片段L的除靶區(qū)T以外的染色體區(qū)。因此，DNA標記M2優(yōu)選為靶區(qū)T上游側(cè)末端附近的DNA標記，更優(yōu)選為與靶區(qū)T的上游側(cè)末端同一部位。并且，DNA標記Ml優(yōu)選為DNA標記M2的上游側(cè)附近的DNA標記。另ー方面，DNA標記M4優(yōu)選為靶區(qū)T下游側(cè)末端附近的DNA標記，更優(yōu)選為與靶區(qū)T的下游側(cè)末端同一部位。并且，DNA標記M5優(yōu)選為DNA標記M4的下游側(cè)附近的DNA標記。[0139]但是，若DNA標記Ml與M2之間的距離dl、DNA標記M2與M4之間的距離d2、及DNA標記M4與M5之間的距離d3各自過短的話，染色體的重組頻率將會減小。因此，若不擴大篩選后代個體的群體規(guī)模，就難以獲得目的后代個體(發(fā)生了染色體重組的后代個體)。
[0140]外源品種為原品種的近緣種時，兩品種染色體的DNA序列的同源性高。因此，即使是源自外源品種的染色體片段L的長度長，與靶基因(祀?yún)^(qū)T)一起，其附近的基因一同被源自外源品種的基因所置換的情況，也存在不損害原品種優(yōu)良性狀的可能性。
[0141]據(jù)此，上述0嫩標記M1M2M4M5的設定，優(yōu)選為從靶區(qū)T的長度、原品種與外源品種為近緣種還是遠緣種、篩選群體規(guī)模等方面考慮，做出適當?shù)臎Q定。
[0142]現(xiàn)在，大量存在基因序列信息已經(jīng)確定但其功能尚不明確的基因。此外，即使是功能已知的基因，也有不少因在后的分析而發(fā)現(xiàn)未知新功能的情況。理論上，通過將編碼上述功能未知的基因的染色體片段，導入原本不具有該基因的原品種染色體中，對得到的品種所具有的生理活性等生物學性狀與原品種進行比較研究，能夠闡明該基因的功能。但是，在使用MAS法等現(xiàn)有方法的品種改良方法中，難以嚴密控制被導入原品種的源自外源品種的染色體片段。因此，在被導入的染色體片段中，除靶基因以外還有何種基因被編碼，或者在被該染色體片段置換而缺失的原品種的染色體區(qū)中曾編碼何種基因等信息不明確的情況很多。因此，在具有按現(xiàn)有方法構建成導入源自外源品種染色體片段的基因組的品種中，對與原品種不同的生物學性質(zhì)是否是由導入靶基因而呈現(xiàn)出的功能，極難進行正確地評價。此外，即使是在能夠?qū)肽康男誀畹那闆r下，當其他性狀也發(fā)生改變時，也難以判斷這種改變是由導入的靶基因的未知功能引起的、還是由與該基因不同的其他基因引起的。
[0143]與此相對，根據(jù)本發(fā)明的植物基因組構建方法構建出的基因組，對源自外源品種的染色體片段L的長度、與該源自外源品種染色體片段L進行置換的原品種染色體G的置換區(qū)，能夠進行以往所沒有的更為嚴格的規(guī)定。因此，在具有使用本發(fā)明的植物基因組構建方法構建成導入源自外源品種的染色體片段L的基因組的品種中，能夠?qū)Ρ辉撛醋酝庠雌贩N的染色體片段L導入到原品種中的性狀，進行以往所沒有的高精度的評價。因此，本發(fā)明的植物基因組構建方法，也能夠很好地適用于基因的功能分析等中。
[0144]接下來對本發(fā)明的新品種選育方法進行說明。本發(fā)明的新品種選育方法利用本發(fā)明的植物基因組構建方法選育新品種。具體地說，有以下4種(第一~第四)選育方法。
[0145]在本發(fā)明的新品種選育方法中，原品種只要是植物品種即可，沒有特別限制，但優(yōu)選為禾本科、豆科、十字花科、蕓香科、錦葵科、菊科、莧科、大戟科、旋花科、百合科等品種。禾本科植物例如優(yōu)選有水稻、玉米、高粱、小麥、大麥、裸麥、稗子、甜高粱(Sorghumbicolor)等。此外，豆科植物，例如優(yōu)選有花生、鷹嘴豆、大豆、菜豆、百脈根、南苜蓿等。十字花科植物，例如優(yōu)選有擬南芥、油菜、薺菜、蘿卜、結球甘藍、山葵等。蕓香科植物，例如優(yōu)選有柑桔等。錦葵科植物，例如優(yōu)選有棉等。菊科植物，例如優(yōu)選有向日葵、萵苣、百日草、番茄、馬鈴薯、辣椒、煙草等。莧科植物，例如優(yōu)選有甜菜等。大戟科植物，例如優(yōu)選有大戟、木薯等。旋花科植物，例如優(yōu)選有牽牛等。百合科植物，例如優(yōu)選有洋蔥等。
[0146]在本發(fā)明的新品種選育方法中，作為染色體片段置換系，尤其優(yōu)選為自花授粉植物或常異花授粉植物的體系。這是由于其能減少在基因組構建中的不確定因素。在此，所謂自花授粉是指以自己本身作為配偶進行交配。具體地說，當為雌雄同株的植物時，通過自花授粉使胚珠受精并發(fā)育成種子，即自交。[0147]特別地，本發(fā)明的新品種選育方法，不使用基因重組法，能夠較安全且穩(wěn)定地選育新品種。因此，本發(fā)明中所使用的染色體片段置換系，優(yōu)選以食用植物為原品種，更優(yōu)選以水稻、小麥、玉米、大豆等為原品種，進ー步優(yōu)選水稻。作為水稻品種，優(yōu)選有越光、哈巴達克(Habataki)、IR64等,尤其優(yōu)選越光。
[0148]本發(fā)明中所使用的染色體片段置換系，可以是用常規(guī)方法選育得到的體系，也可以是能夠從獨立行政法人農(nóng)業(yè)生物資源研究所水稻基因組資源中心等機構獲得的體系。
[0149]本發(fā)明的第一新品種選育方法，使用僅將原品種染色體的一部分置換成源自外源品種的染色體片段的染色體片段置換系，對于原品種染色體中的ー個或多個靶區(qū)，針對每一個靶區(qū)進行下述步驟(1-1)-(1-6)。
[0150](1-1)在靶區(qū)的上游側(cè)末端或其上游設定DNA標記M2的步驟；在DNA標記M2的上游設定DNA標記Ml的步驟；在靶區(qū)的下游側(cè)末端或其下游設定DNA標記M4的步驟；在DNA標記M4的下游設定DNA標記M5的步驟；及在靶區(qū)中設定DNA標記M3的步驟。
[0151](1-2)使染色體片段置換系與原品種雜交，得到后代個體的步驟，所述后代個體的DNA標記M3為源自原品種的等位基因與源自外源品種的等位基因的非同源染色體區(qū)。
[0152](1-3)將步驟(1-2)中得到的后代個體自交，得到后代個體的步驟。
[0153](1-4)從步驟(1-3)中得到的后代個體或從步驟(1-3)中得到的后代個體回交得到的后代個體中，篩選出DNA標記Ml為源自原品種的等位基因的同源染色體區(qū)、DNA標記M2及M3為源自原品種的等位基因與源自外源品種的等位基因的非同源染色體區(qū)的后代個體的步驟。
[0154](1-5)通過將步驟(1-4)中篩選出的后代個體自交，從而得到后代個體的步驟。
[0155](1-6)從步驟(1-5)中得到的所述后代個體或從步驟(1-5)中得到的后代個體自交得到的后代個體中，篩選出 DNA標記Ml及M5為源自所述原品種的等位基因的同源染色體區(qū)；DNA標記M2、M3及M4為源自外源品種的等位基因的同源染色體區(qū)的后代個體的步驟。
[0156]以下，對每個步驟進行說明。
[0157]首先，作為步驟(1-1)，在原品種染色體中的靶區(qū)的上游側(cè)末端或其上游設定DNA標記M2、在DNA標記M2的上游設定DNA標記Ml。另ー方面，在該靶區(qū)的下游側(cè)末端或其下游設定DNA標記M4、在DNA標記M4的下游設定DNA標記M5。并且在該靶區(qū)中設定DNA標記M3。即，設定DNA標記M1、M2、M4、M5，使得通過置換而被導入到原品種染色體區(qū)(含有靶區(qū)的區(qū))中的源自外源品種的染色體片段，其上游側(cè)末端在DNA標記Ml與M2之間，其下游側(cè)末端在DNA標記M4與M5之間。
[0158]具體地說，各DNA標記Ml-M5的設定，與本發(fā)明的植物基因組構建方法相同。
[0159]如此設定DNA標記Ml-M5，能夠在新品種的選育中，控制導入原品種染色體的源自外源品種的染色體片段的長度。結果能夠有效地抑制除靶基因以外的基因被導入到原品種染色體中。進而，能夠有效地抑制存在于靶區(qū)附近的、除靶基因以外的基因，被源自外源品種的染色體置換。
[0160]其次，作為步驟(1-2)，將染色體片段置換系與原品種進行雜交，得到DNA標記M3為源自原品種的等位基因與源自外源品種的等位基因的非同源染色體區(qū)的后代個體。可以將染色體片段置換系作為母本、將原品種作為父本進行雜交；也可以將原品種作為母本、將染色體置換系作為父本進行雜交。
[0161]一般來說，在雜交中，親本個體所具有的基因被隨機分配到配子上。因此，盡管通過DNA標記篩選出的后代個體具有編碼目的性狀的基因，但其他基因區(qū)從親本個體中會發(fā)生怎樣地變化卻不明確。因此，對獲得的后代個體的表現(xiàn)性狀，難以判定其是由與DNA標記連鎖的染色體區(qū)引起的、還是由存在于其他染色體區(qū)的基因的影響引起的。
[0162]在本發(fā)明中，使用染色體片段置換系與該染色體片段置換系的原品種作為親本。該染色體片段置換系的、除源自外源品種的染色體片段以外的其他染色體區(qū)，全部具有與原品種相同的基因。因此，獲得的后代個體的染色體區(qū)，除源自外源品種的染色體片段以外的染色體區(qū)，全部為與原品種相同的基因。因此，能夠容易地判定該后代個體中由源自外源品種的染色體片段帶來的影響。
[0163]在本發(fā)明的新品種選育方法中，雜交可以是自然雜交，但由于人工雜交能夠確切地指定母本和父本，因此優(yōu)選人工雜交。在此，人工雜交方法只要是能夠用從父本上采集的花粉給母本的雌蕊授粉使其受精的方法即可，沒有特別限定，可以通過常規(guī)方法進行。
[0164]作為步驟(1-3)，將步驟(1-2)中得到的后代個體自交，得到后代個體。然后，作為步驟(1-4)，從步驟(1-3)中得到的后代個體或從步驟(1-3)中得到的后代個體回交得到的后代個體中，篩選出DNA標 記Ml為源自原品種的等位基因的同源染色體區(qū)、DNA標記M2及M3為源自原品種的等位基因與源自外源品種的等位基因的非同源染色體區(qū)的后代個體。
[0165]圖2A-圖2C為表示在步驟(1-3)中得到的后代個體中，步驟(1-4)中優(yōu)選的后代個體的染色體區(qū)的示意圖。圖中，反白的粗線表示源自原品種的等位基因，涂黑的粗線表示源自外源品種的等位基因。首先，從步驟(1-3)中得到的后代個體中，分別篩選DNA標記Ml為源自原品種的等位基因的同源染色體區(qū)、DNA標記M2及M3為非同源染色體區(qū)的后代個體(la);以及DNA標記Ml為源自非同源染色體區(qū)、DNA標記M2及M3為源自外源品種的等位基因的同源染色體區(qū)的后代個體(lb);以及DNA標記Ml為源自原品種的等位基因的同源染色體區(qū)、DNA標記M2及M3為源自外源品種的等位基因的同源染色體區(qū)的后代個體(lc)。在此，后代個體(la)為步驟(1-4)中最終篩選出的后代個體。還可以將后代個體(lb)及后代個體(lc)分別與原品種個體回交，從所得到的后代個體中，篩選后代個體(la)。
[0166]其次，作為步驟(1-5)，通過將上述步驟(1-4)中篩選出的后代個體自交，從而得到后代個體。然后，作為步驟(1-6)，從所述步驟(1-5)中得到的所述后代個體或從步驟(1-5)中得到的后代個體自交得到的后代個體中，篩選出DNA標記Ml及M5為源自所述原品種的等位基因的同源染色體區(qū)、DNA標記M2、M3及M4為源自外源品種的等位基因的同源染色體區(qū)的后代個體。
[0167]圖2D-圖2F為表示在步驟(1-5)中得到的后代個體中，步驟(1_6)中優(yōu)選的后代個體的染色體區(qū)的示意圖。圖中，反白的粗線表示源自原品種的等位基因，涂黑的粗線表示源自外源品種的等位基因。首先，從步驟(1-5)中得到的后代個體中，分別篩選DNA標記Ml及M5為源自原品種的等位基因的同源染色體區(qū)、DNA標記M2、M3及M4為非同源染色體區(qū)的后代個體(Id);以及DNA標記Ml及M5為源自原品種的等位基因的同源染色體區(qū)、DNA標記M2、M3及M4為源自外源品種的等位基因的同源染色體區(qū)的后代個體(le);以及DNA標記Ml為源自原品種的等位基因的同源染色體區(qū)、DNA標記M2、M3及M4為源自外源品種的等位基因的同源染色體區(qū)、DNA標記M5為非同源染色體區(qū)的后代個體(If)。在此，后代個體(le)為通過本發(fā)明的第一新品種選育方法選育得到的目的新品種，其源自外源品種的染色體片段し的上游側(cè)末端在DNA標記Ml與M2之間、下游側(cè)末端在DNA標記M4與M5之間。還可以將后代個體(Id)及后代個體(If)分別進行自交，從得到的后代個體中，篩選后代個體(le)。
[0168]此外，對靶區(qū)兩端的確定，可以像本發(fā)明的第一新品種選育方法這樣，在確定導入的源自外源品種的染色體片段的上游側(cè)末端之后，再確定下游側(cè)末端；也可以像下述本發(fā)明的第二新品種選育方法那樣，在確定下游側(cè)末端之后，再確定上游側(cè)末端。
[0169]本發(fā)明的第二新品種選育方法，使用僅將原品種染色體的一部分置換成源自外源品種的染色體片段的染色體片段置換系，對于原品種染色體中的ー個或多個靶區(qū)，針對每一個靶區(qū)進行下述步驟(2-1)-(2-6)。
[0170](2-1)在靶區(qū)的上游側(cè)末端或其上游設定DNA標記M2的步驟；在DNA標記M2的上游設定DNA標記Ml的步驟；在靶區(qū)的下游側(cè)末端或其下游設定DNA標記M4的步驟；在DNA標記M4的下游設定DNA標記M5的步驟；及在靶區(qū)中設定DNA標記M3的步驟。
[0171](2-2)使染色體片段置換系與原品種雜交，得到后代個體的步驟，所述后代個體的DNA標記M3為源自原品種的等位基因與源自外源品種的等位基因的非同源染色體區(qū)。
[0172](2-3)將步驟(2-2)中得到的后代個體自交，得到后代個體的步驟。
[0173](2-4)從步驟(2-3)中得到的后代個體或從步驟(2_3)中得到的后代個體回交得到的后代個體中，篩選出DNA標記M5為源自原品種的等位基因的同源染色體區(qū)、DNA標記M3及M4為源自原品種的等位基因與源自外源品種的等位基因的非同源染色體區(qū)的后代個體的步驟。
[0174](2-5)通過將步驟 (2-4)中篩選出的所述后代個體自交，從而得到后代個體的步驟。
[0175](2-6)從步驟(2-5)中得到的后代個體或從步驟(2_5)中得到的后代個體自交得到的后代個體中，篩選出DNA標記Ml及M5為源自原品種的等位基因的同源染色體區(qū)；DNA標記M2、M3及M4為源自外源品種的等位基因的同源染色體區(qū)的后代個體的步驟。
[0176]步驟(2-1)-(2-3)分別與本發(fā)明的第一新品種選育方法的步驟(1-1)-(1_3)相同。
[0177]圖3A-圖3C為表示在步驟(2-3)中得到的后代個體中，步驟(2_4)中優(yōu)選的后代個體的染色體區(qū)的示意圖。圖中，反白的粗線表示源自原品種的等位基因，涂黑的粗線表示源自外源品種的等位基因。首先，從步驟(2-3)中得到的后代個體中，分別篩選DNA標記M5為源自原品種的等位基因的同源染色體區(qū)、DNA標記M4及M3為非同源染色體區(qū)的后代個體(2a);以及DNA標記M5為非同源染色體區(qū)、DNA標記M4及M3為源自外源品種的等位基因的同源染色體區(qū)的后代個體(2b);以及DNA標記M5為源自原品種的等位基因的同源染色體區(qū)、DNA標記M4及M3為源自外源品種的等位基因的同源染色體區(qū)的后代個體(2c)。在此，后代個體(2a)為步驟(2-4)中最終篩選出的后代個體。還可以將后代個體(2b)及后代個體(2c)分別與原品種個體回交，從所得到的后代個體中，篩選后代個體(2a)。
[0178]圖3D-圖3F為表示在步驟(2-5)中得到的后代個體中，步驟(2_6)中優(yōu)選的后代個體的染色體區(qū)的示意圖。圖中，反白的粗線表示源自原品種的等位基因，涂黑的粗線表示源自外源品種的等位基因。首先，從步驟(2-5)中得到的后代個體中，分別篩選DNA標記Ml及M5為源自原品種的等位基因的同源染色體區(qū)、DNA標記M2、M3及M4為非同源染色體區(qū)的后代個體(2d);以及DNA標記Ml及M5為源自原品種的等位基因的同源染色體區(qū)、DNA標記M2、M3及M4為源自外源品種的等位基因的同源染色體區(qū)的后代個體(2e);以及DNA標記M5為源自原品種的等位基因的同源染色體區(qū)、DNA標記M2、M3及M4為源自外源品種的等位基因的同源染色體區(qū)、DNA標記Ml為非同源染色體區(qū)的后代個體(2f)。在此，后代個體(2e)為通過本發(fā)明的第二新品種選育方法選育得到的目的新品種，其源自外源品種的染色體片段し的上游側(cè)末端在DNA標記Ml與M2之間、下游側(cè)末端在DNA標記M4與M5之間。還可以從后代個體(2d)及后代個體(2f )分別自交得到的后代個體中，篩選后代個體(2e)。
[0179]此外，對靶區(qū)兩端的確定，可以像本發(fā)明的第一或第二新品種選育方法這樣，在確定導入的源自外源品種的染色體片段的單側(cè)末端之后，再確定另ー側(cè)末端；也可以像下述本發(fā)明的第三新品種選育方法那樣，首先確定兩側(cè)末端。
[0180]本發(fā)明的第三新品種選育方法，使用僅將原品種染色體的一部分置換成源自外源品種的染色體片段的染色體片段置換系，對于原品種染色體中的ー個或多個靶區(qū)，針對每一個靶區(qū)進行下述步驟(3-1)-(3-6)。
[0181](3-1)在靶區(qū)的上游側(cè)末端或其上游設定DNA標記M2的步驟；在DNA標記M2的上游設定DNA標記Ml的步驟；在靶區(qū)的下游側(cè)末端或其下游設定DNA標記M4的步驟；在DNA標記M4的下游設定DNA標記M5的 步驟；及在靶區(qū)中設定DNA標記M3的步驟。
[0182](3-2)使染色體片段置換系與原品種雜交，得到后代個體的步驟，所述后代個體的DNA標記M3為源自原品種的等位基因與源自外源品種的等位基因的非同源染色體區(qū)。
[0183](3-3)將步驟(3-2)中得到的后代個體自交，得到后代個體的步驟。
[0184](3-4)從步驟(3-3)中得到的后代個體或從步驟(3_3)中得到的后代個體回交得到的后代個體中，篩選出DNA標記Ml及M5中的任意ー個為源自原品種的等位基因的同源染色體區(qū)、另ー個為源自原品種的等位基因與源自外源品種的等位基因的非同源染色體區(qū)的后代個體的步驟。
[0185](3-5)通過將步驟(3-4)中篩選出的后代個體自交，從而得到后代個體的步驟。
[0186](3-6)從步驟(3-5)中得到的后代個體或從步驟(3_5)中得到的后代個體自交得到的后代個體中，篩選出DNA標記Ml及M5為源自原品種的等位基因的同源染色體區(qū)；DNA標記M2、M3及M4為源自外源品種的等位基因的同源染色體區(qū)的后代個體的步驟。
[0187]步驟(3-1)-(3-3)分別與本發(fā)明的第一新品種選育方法的步驟(1-1)-(1_3)相同。
[0188]作為步驟(3-4)，從步驟(3-3)中得到的后代個體中、或從步驟(3_3)中得到的后代個體回交得到的后代個體中，篩選出DNA標記Ml及M5的任意ー個為源自原品種的等位基因的同源染色體區(qū)、另ー個為源自原品種的等位基因與源自外源品種的等位基因的非同源染色體區(qū)的后代個體。即，可以從步驟(3-3)中得到的后代個體中，篩選目的后代個體；此外，還可以從步驟(3-3)中得到的后代個體中，篩選出在至少任意ー個等位基因中，源自原品種的等位基因區(qū)與源自外源品種的等位基因區(qū)進行重組的位點存在于DNA標記Ml及M5之間的后代個體,然后使該后代個體回交得到后代個體,從該后代個體中篩選目的后代個體。
[0189]圖4A-圖4F為表示步驟(3-3)中得到的后代個體中，在步驟(3_4)中優(yōu)選的后代個體的染色體區(qū)的示意圖。圖中，反白的粗線表示源自原品種的等位基因，涂黑的粗線表示源自外源品種的等位基因。首先，從步驟(3-3)中得到的后代個體中，分別篩選DNA標記Ml為源自原品種的等位基因的同源染色體區(qū)、DNA標記M5為非同源染色體區(qū)的后代個體(3a);以及DNA標記Ml為非同源染色體區(qū)、DNA標記M5為源自外源品種的等位基因的同源染色體區(qū)的后代個體(3b);以及DNA標記Ml為源自原品種的等位基因的同源染色體區(qū)、DNA標記M5為源自外源品種的等位基因的同源染色體區(qū)的后代個體(3c);以及DNA標記Ml為非同源染色體區(qū)、DNA標記M5為源自原品種的等位基因的同源染色體區(qū)的后代個體(3d)；以及DNA標記Ml為源自外源品種的等位基因的同源染色體區(qū)、DNA標記M5為非同源染色體區(qū)的后代個體(3e)；以及DNA標記Ml為源自外源品種的等位基因的同源染色體區(qū)、DNA標記M5為源自原品種的等位基因的同源染色體區(qū)的后代個體(3f)。在此，后代個體(3a)或(3d)為步驟(3-4)中最終篩選出的后代個體。還可以將后代個體(3b)、(3c)、(3e)或(3f)分別與原品種個體回交，從所得到的后代個體中篩選后代個體(3a)或(3d)。
[0190]其次，作為步驟(3-5)，通過將上述步驟(3-4)中篩選出的后代個體(3a)或(3d)自交，從而得到后代個體。然后，作為步驟(3-6)，從步驟(3-5)中得到的后代個體或從步驟(3-5)中得到的后代個體自交而得到的后代個體中，篩選出DNA標記Ml及M5為源自原品種的等位基因的同源染色體區(qū)、DNA標記M2、M3及M4為源自外源品種的等位基因的同源染色體區(qū)的后代個體。
[0191]圖5A-圖5C為表示在步驟(3-4)中得到的后代個體為(3a)時，步驟(3_6)中優(yōu)選的后代個體的染色體區(qū)的示意圖。圖中，反白的粗線表示源自原品種的等位基因，涂黑的粗線表示源自外源品種的等位基因。首先，從步驟(3-5)中得到的后代個體中，分別篩選DNA標記Ml及M5為源自原品種的等位基因的同源染色體區(qū)、DNA標記M2、M3及M4為非同源染色體區(qū)的后代個體(3g)；以及DNA標記Ml及M5為源自原品種的等位基因的同源染色體區(qū)、DNA標記M2、M3及M4為源自外源品種的等位基因的同源染色體區(qū)的后代個體(3h)；以及DNA標記Ml為源自原品種的等位基因的同源染色體區(qū)、DNA標記M2、M3及M4為源自外源品種的等位基因的同源染色體區(qū)、DNA標記M5為非同源染色體區(qū)的后代個體(3i)。在此，后代個體(3h)為通過本發(fā)明的第三新品種選育方法選育得到的目的新品種，其源自外源品種的染色體片段L的上游 側(cè)末端在DNA標記Ml與M2之間、下游側(cè)末端在DNA標記M4與M5之間。還可以從后代個體(3g)及后代個體(3i)分別自交得到的后代個體中，篩選后代個體(3h)。
[0192]圖?-圖5F為表示在步驟(3-4)中得到的后代個體為(3d)時，步驟(3_6)中優(yōu)選的后代個體的染色體區(qū)的示意圖。圖中，反白的粗線表示源自原品種的等位基因，涂黑的粗線表示源自外源品種的等位基因。首先，從步驟(3-5)中得到的后代個體中，分別篩選DNA標記Ml及M5為源自原品種的等位基因的同源染色體區(qū)、DNA標記M2、M3及M4為非同源染色體區(qū)的后代個體(3j);以及DNA標記Ml及M5為源自原品種的等位基因的同源染色體區(qū)、DNA標記M2、M3及M4為源自外源品種的等位基因的同源染色體區(qū)的后代個體(3k)；以及DNA標記M5為源自原品種的等位基因的同源染色體區(qū)、DNA標記M2、M3及M4為源自外源品種的等位基因的同源染色體區(qū)、DNA標記Ml為非同源染色體區(qū)的后代個體(31)。在此，后代個體(3k)為通過本發(fā)明的第三新品種選育方法選育得到的目的新品種，其源自外源品種的染色體片段L的上游側(cè)末端在DNA標記Ml與M2之間、下游側(cè)末端在DNA標記M4與M5之間。還可以從后代個體(3j)及后代個體(31)分別自交得到的后代個體中，篩選后代個體(3k)。
[0193]本發(fā)明的第三新品種選育方法，在步驟(3-4)中，即使在篩選出了圖4A-圖4F所表示的后代個體(3a)-(3f )的所有個體的情況下，也能夠通過在步驟(3-5)之前進行下述步驟(3-7-1)及(3-7-2)，得到DNA標記Ml及M5為源自原品種的等位基因的同源染色體區(qū)且DNA標記M2、M3及M4為源自外源品種的等位基因的同源染色體區(qū)的目的后代個體。
[0194](3-7-1)通過將步驟(3-4)中篩選出的后代個體自交，從而得到后代個體的步驟；
[0195](3-7-2)從步驟(3-7-1)中得到的后代個體或從步驟(3_7_1)中得到的后代個體回交得到的后代個體或從步驟(3-7-1)中得到的后代個體自交得到的后代個體再進行回交而得到的后代個體中，篩選出(ii _1)DNA標記Ml為源自原品種的等位基因的同源染色體區(qū)、DNA標記M2及M3為源自原品種的等位基因與源自外源品種的等位基因的非同源染色體區(qū)的后代個體；或者，篩選出(ii _2)DNA標記M5為源自原品種的等位基因的同源染色體區(qū)、DNA標記M3及M4為源自原品種的等位基因與源自外源品種的等位基因的非同源染色體區(qū)的后代個體的步驟。
[0196]在步驟(3-7-2)中篩選出的個體中，(ii _1)DNA標記Ml為源自原品種的等位基因的同源染色體區(qū)且DNA 標記M2及M3為源自原品種的等位基因與源自外源品種的等位基因的非同源染色體區(qū)的后代個體，其相當于本發(fā)明的第一新品種選育方法的步驟(1-4)中所最終篩選出的后代個體(la)。另ー方面，在步驟(3-7-2)中篩選出的個體中，(i1-2)DNA標記M5為源自原品種的等位基因的同源染色體區(qū)且DNA標記M3及M4為源自原品種的等位基因與源自外源品種的等位基因的非同源的后代個體，其相當于本發(fā)明第二新品種選育方法的步驟(2-4)中所最終篩選出的后代個體(2a)。因此，步驟(3-7-2)中篩選出的個體，通過進行與本發(fā)明的第一新品種選育方法(1-5)及(1-6)相同的、或與本發(fā)明的第二新品種選育方法的步驟(2-5)及(2-6)相同的步驟(3-5’)及(3-6’)，從而使其為源自外源品種的染色體片段L的上游側(cè)末端在DNA標記Ml與M2之間、下游側(cè)末端在DNA標記M4與M5之間的后代個體。即，通過步驟(3-7-2)中的篩選，能夠得到用本發(fā)明的第三新品種選育方法選育得到的目的新品種。
[0197]圖6A-圖9G為表示步驟(3-7-1)中得到的后代個體中，較為優(yōu)選的后代個體的染色體區(qū)的示意圖。圖中，反白的粗線表示源自原品種的等位基因，涂黑的粗線表示源自外源品種的等位基因。DNA標記Ml為源自原品種的等位基因的同源染色體區(qū)、DNA標記M2-M5為非同源染色體區(qū)的后代個體(3a-a);以及DNA標記Ml及M2為源自原品種的等位基因的同源染色體區(qū)、DNA標記M3-M5為非同源染色體區(qū)的后代個體(3a-b)，均為由后代個體(3a)自交得到的后代個體(參見圖6A及圖6B)。
[0198]DNA標記Ml及M2為非同源染色體區(qū)、DNA標記M3-M5為源自外源品種的等位基因的同源染色體區(qū)的后代個體(3b-a);以及DNA標記Ml為非同源染色體區(qū)、DNA標記M2-M5為源自外源品種的等位基因的同源染色體區(qū)的后代個體(3b-b)，均為由后代個體(3b)自交得到的后代個體(參見圖6C及圖6D)。
[0199]DNA標記Ml為源自原品種的等位基因的同源染色體區(qū)、DNA標記M2-M4為非同源染色體區(qū)、DNA標記M5為源自外源品種的等位基因的同源染色體區(qū)的后代個體(3c-a)；以及DNA標記Ml為源自原品種的等位基因的同源染色體區(qū)、DNA標記M2-M5為源自外源品種的等位基因的同源染色體區(qū)的后代個體(3c-b);以及DNA標記Ml為源自原品種的等位基因的同源染色體區(qū)、DNA標記M2為非同源染色體區(qū)、DNA標記M4及M5為源自外源品種的等位基因的同源染色體區(qū)的后代個體(3c-c);以及DNA標記Ml為源自原品種的等位基因的同源染色體區(qū)、DNA標記M2及M3為非同源染色體區(qū)、DNA標記M4及M5為源自外源品種的等位基因的同源染色體區(qū)的后代個體(3c-d);以及DNA標記Ml為源自原品種的等位基因的同源染色體區(qū)、DNA標記M2-M4為非同源染色體區(qū)、DNA標記M5為源自外源品種的等位基因的同源染色體區(qū)的后代個體(3c-e);以及DNA標記Ml及M2為源自原品種的等位基因的同源染色體區(qū)、DNA標記M3為非同源染色體區(qū)、DNA標記M4及M5為源自外源品種的等位基因的同源染色體區(qū)的后代個體(3c-f);以及DNA標記Ml及M2為源自原品種的等位基因的同源染色體區(qū)、DNA標記M3及M4為非同源染色體區(qū)、DNA標記M5為源自外源品種的等位基因的同源染色體區(qū)的后代個體(3c-g)，均為由后代個體(3c)自交得到的后代個體(參見圖7A-圖7G)。
[0200]DNA標記Ml-M4為非同源染色體區(qū)、DNA標記M5為源自原品種的等位基因的同源染色體區(qū)的后代個體(3d-a);以及DNA標記Ml-M3為非同源染色體區(qū)、DNA標記M4及M5為源自原品種的等位基因的同源染色體區(qū)的后代個體(3d-b)，均為由后代個體(3d)自交得到的后代個體(參見圖8A及圖8B)。
[0201]DNA標記Ml-M4為源自外源品種的等位基因的同源染色體區(qū)、DNA標記M5為非同源染色體區(qū)的后代個體(3e-a);以及DNA標記Ml-M3為源自外源品種的等位基因的同源染色體區(qū)、DNA標記M4及M5為非同源染色體區(qū)的后代個體(3e-b)，均為由后代個體(3e)自交得到的后代個體(參見圖8C及圖8D)。
[0202]DNA標記Ml為源自原品種的等位基因的同源染色體區(qū)、DNA標記M2-M4為非同源染色體區(qū)、DNA標記M5為源自外源品種的等位基因的同源染色體區(qū)的后代個體(3f-a)；以及DNA標記Ml-M4為源自外源品種的等位基因的同源染色體區(qū)、DNA標記M5為源自原品種的等位基因的同源染色體區(qū)的后代個體(3f-b);以及DNA標記Ml及M2為源自外源品種的等位基因的同源染色體區(qū)、DNA標記M4為非同源染色體區(qū)、DNA標記M5為源自原品種的等位基因的同源染色體區(qū) 的后代個體(3f-c);以及DNA標記Ml及M2為源自外源品種的等位基因的同源染色體區(qū)、DNA標記M3及M4為非同源染色體區(qū)、DNA標記M5為源自原品種的等位基因的同源染色體區(qū)的后代個體(3f-d);以及DNA標記Ml為源自外源品種的等位基因的同源染色體區(qū)、DNA標記M2-M4為非同源染色體區(qū)、DNA標記M5為源自原品種的等位基因的同源染色體區(qū)的后代個體(3f-e);以及DNA標記Ml及M2為源自外源品種的等位基因的同源染色體區(qū)、DNA標記M3為非同源染色體區(qū)、DNA標記M4及M5為源自原品種的等位基因的同源染色體區(qū)的后代個體(3f-f);以及DNA標記Ml為源自外源品種的等位基因的同源染色體區(qū)、DNA標記M2及M3為非同源染色體區(qū)、DNA標記M4及M5為源自原品種的等位基因的同源染色體區(qū)的后代個體(3f-g)，均為由后代個體(3f)自交得到的后代個體(參見圖9A-圖9G)。
[0203]在步驟(3-7-2)中得到的上述后代個體中，后代個體(3a_a)相當于圖2A所示的后代個體(la);后代個體(3d_a)相當于圖3A所示的后代個體(2a)。因此，可以篩選出這些后代個體，進入下ー步驟(3-5’)。
[0204]此外,若使后代個體(3b-b)、(3c_a)、(3c_b)、(3c_c)、(3c_d)及(3c_e)分別自交，則在該自交所得的后代個體中，將包括染色體區(qū)相當于后代個體(la)的個體。同樣地，若使后代個體(3e_a)、(3f_a)、(3f_b)、(3f_c)、(3f_d)及(3f_e)分別自交，則在該自交所得的后代個體中，將包括染色體區(qū)相當于后代個體(2a)的個體。因此，可以篩選出這些后代個體，進入下ー步驟(3-5’)。
[0205]另ー方面，若使后代個體(3b_a)自交，則在該自交所得的后代個體中，可含有染色體區(qū)相當于后代個體(3b_b)的個體。同樣地，若使后代個體(3e_b)自交，則在該自交所得到后代個體中，將包括染色體區(qū)相當于后代個體(3e_a)的個體。因此，可以篩選出這些后代個體，使其進ー步自交，從該自交得到的后代個體中，篩選出染色體區(qū)相當于后代個體(la)或后代個體(2a)的個體,進入下ー步驟(3-5’)。
[0206]在步驟(3-4)中篩選出的后代個體中，包括源自原品種的等位基因的區(qū)與源自外源品種的等位基因的區(qū)進行重組的位點位置不明確，靶區(qū)沒有被源自外源品種的染色體片段置換的后代個體、以及只有部分靶區(qū)被源自外源品種的染色體片段置換的后代個體。因此，可以從步驟(3-4)中篩選出的后代個體中，篩選出靶區(qū)被源自外源品種的等位基因的染色體片段置換的后代個體，將其用于步驟(3-5 )。
[0207]在此，對靶區(qū)被源自外源品種的染色體片段置換的后代個體的篩選，可以使用DNA標記進行篩選，也可以通過性狀檢測 進行篩選。在使用DNA標記進行篩選時,篩選DNA標記M3為源自原品種的等位基因與源自外源品種的等位基因的非同源染色體區(qū)的后代個體。在通過性狀檢測進行篩選時，篩選具有因置換了源自外源品種的染色體片段而被導入的目的性狀的后代個體。在步驟(3-3)中得到的后代個體數(shù)少的時候，可以通過性狀檢測進行篩選。
[0208]優(yōu)選對步驟(1-6)、(2-6)或(3-6)中篩選出的后代個體，即通過本發(fā)明的第一-第三新品種選育方法選育得到的新品種，確認其是否具有目的性狀。例如，從新品種個體上采集自花授粉的種子，對每個種子分別栽培成為群體。通過對該栽培群體進行恰當?shù)挠^察或分析等，確認其是否具有目的性狀以及群體整體沒有分離。
[0209]此外，在本發(fā)明的第一-第三新品種的選育方法中，靶區(qū)可以是ー個，也可以是多個。在為多個的情況下，對每個靶區(qū)重復進行上述步驟，能夠得到所有靶區(qū)都被源自外源品種的同源染色體置換的后代個體。
[0210]通過本發(fā)明的第一-第三新品種選育方法，能夠控制導入原品種染色體的源自外源品種染色體片段的區(qū)，能夠有效地抑制除靶基因區(qū)以外的其他基因被導入原品種染色體中。因而能夠選育出不改變原品種所具有的優(yōu)良性狀、且具有目的性狀的新品種。因此，通過本發(fā)明的第一-第三新品種選育方法選育得到的品種，能夠判定由導入該染色體中的染色體片段引起的、對原品種性狀的改良效果，具有非常高的可靠性。
[0211]本發(fā)明的第一-第三新品種選育方法，通過進行步驟(1-1)-(1-6)等特定步驟，能夠選育出以編碼靶基因的區(qū)作為靶區(qū)、僅將不含有除該靶基因外的其他基因的較短的區(qū)置換成源自外源品種的染色體片段的品種。
[0212]以水稻基因組為例，理論上，染色體的交叉若不是因交叉干涉而平均為12Mbp以上的區(qū)，則兩點同時發(fā)生交叉，不能得到將該區(qū)進行重組的重組體。因而，僅將較短的特定區(qū)進行置換的后代個體的存在概率非常小。因此，在進行僅對所希望的區(qū)設定DNA標記、以該DNA標記作為指標進行篩選的現(xiàn)有MAS法吋，需要有大規(guī)模的篩選群體。因此，篩選時所需的勞動カ和成本過大。而且，從ー個水稻中能夠收獲的種子量也有限，因而即使多次反復進行篩選也無法得到所希望的后代個體的可能性很高。
[0213]與此相對，本發(fā)明的第一-第三新品種選育方法，通過進行特定步驟，能夠從一般規(guī)模的篩選群體中，選育出僅置換構建好的染色體片段區(qū)的后代個體。
[0214]此外，本發(fā)明的第一-第三新品種選育方法中，針對靶區(qū)設定的各DNA標記Ml-M5為，根據(jù)該方法選育得到的品種中所特有的基因組信息。因此，能夠使用這些DNA標記鑒定通過本發(fā)明的第一-第三新品種選育方法選育得到的新品種。
[0215]具體地說，本發(fā)明的植物品種鑒別方法，其用于鑒別某種植物個體是否為使用本發(fā)明的第一-第三新品種選育方法選育得到的特定品種，通過該植物個體的基因組分析，將選自DNA標記Ml-M5中的ー種以上的DNA標記進行分型，當?shù)玫降姆中徒Y果與特定品種的結果一致吋，鑒定該植物個體為特定品種。
[0216]在此，對每ー個靶區(qū)設定5個DNA標記Ml-M5 ;但在品種鑒定中，可以使用所有上述DNA標記Ml-M5，也可以使用上述DNA標記中的幾個。例如，可以僅使用作為靶區(qū)上游側(cè)重組位點的DNA標記Ml和M2 ;也可以僅使用作為靶區(qū)下游側(cè)重組位點的DNA標記M4和M5 ;還可以僅使用將靶區(qū)包含在其間的DNA標記M2和M4。此外，當有多個靶區(qū)的時候，還可以將各靶區(qū)的DNA標記進行適當組合。通過將多個DNA標記進行適當組合，能夠更嚴格地鑒定品種。
[0217]通過本發(fā)明的第一-第三新品種選育方法選育得到的品種(以下，有時稱為本發(fā)明的第一品種)的個體，與用于選育該個體的原品種的個體相同，能夠雜交并獲得后代個體。尤其優(yōu)選為從本發(fā)明第一品種個體和該第一品種個體的后代個體中選擇兩個個體進行雜交，并獲得后代個體。在本發(fā)明中，作為上述2個個體，優(yōu)選為至少ー個靶區(qū)互不相同的兩個個體。此外，雜交得到的后代個體，優(yōu)選為原品種染色體中的多個靶區(qū)被源自外源品種的同源染色體片段置換的個體。
[0218]下面，對本發(fā)明的第四新品種選育方法進行說明。本發(fā)明的第四新品種選育方法，其是在通過本發(fā)明的第一-第三新品種選育方法選育得到的本發(fā)明第一品種的個體中，以至少ー個靶區(qū)互不相同的兩個個體為親本進行雜交。據(jù)此，能夠選育出具有下述基因組的新品種，所述基因組完全遺傳了親本所分別具有的、被源自外源品種的同源染色體片段所置換的區(qū)。
[0219]即，本發(fā)明的第四新品種選育方法，其包括:(4-1)以本發(fā)明第一品種的個體為母本，以至少一個靶區(qū)與該母本不同的本發(fā)明第一品種的個體為父本，將母本與父本雜交，得到后代個體的步驟；(4-2)通過將步驟(4-1)中得到的后代個體自交，從而得到后代個體的步驟；以及(4-3)從步驟(4-2)中得到的后代個體中，篩選出原品種染色體中、母本所具有的靶區(qū)及父本所具有的靶區(qū)均被源自外源品種的同源染色體片段置換的后代個體的步驟。[0220]此外，本發(fā)明的第四新品種選育方法，還可以在步驟(4-3)之后進ー步包括:(4-4)從本發(fā)明第一品種的個體和在步驟(4-3)中篩選出的個體所組成的群體中，選擇至少一個靶區(qū)互不相同的兩個個體作為母本及父本，使其雜交得到后代個體的步驟；(4-5)通過將步驟(4-4)中得到的后代個體自交，從而得到后代個體的步驟；(4-6)從步驟(4-5)中得到的后代個體中，篩選出原品種染色體中、母本所具有的靶區(qū)及父本所具有的靶區(qū)均被源自外源品種的同源染色體片段置換的后代個體的步驟；和(4-7)將步驟(4-4)-(4-6)重復一次以上的步驟。
[0221]并且，對于由本發(fā)明第四新品種選育方法得到的各后代個體，各靶區(qū)是否為源自外源品種的純合體片段，可以用本發(fā)明第一新品種選育方法中所使用的DNA標記Ml-M5進行識別。
[0222]如前所述，在基于回交和MAS法的現(xiàn)有品種改良方法不能控制導入到原品種染色體中的染色體片段的長度。因此，除靶基因之外的很多功能不明的基因也被一同導入到原品種染色體中。導入的染色體片段的數(shù)量越多，隨之導入的功能不明的基因數(shù)量也相應增カロ。因此，想要通過雜交改良多個性狀，就會產(chǎn)生除改良的目的性狀以外的性狀變差等問題。并且，如上所述，由于導入大量不明基因的可能性很高，因此不一定能通過有意導入的染色體片段(含有靶區(qū)的染色體片段)改良目的性狀。因而，即使是具有靶區(qū)的染色體片段的后代個體，也會得到大量目的性狀沒有被改良的個體。進ー步地，用于篩選的DNA標記只不過是與原品種中靶區(qū)染色體片段進行連鎖。因此，由于植物個體的多次雜交使染色體被隨機分配，結果會出現(xiàn)DNA標記沒有與靶區(qū)的染色體片段連鎖的情況。因此，也有很多使用該DNA標記不能篩選出具有靶區(qū)染色體片段的后代個體的情況。
[0223]例如，將通過現(xiàn)有雜交方法使源自外源品種的靶區(qū)A的同源染色體片段導入到原品種染色體中的個體PI (A)，與通過現(xiàn)有雜交方法使源自外源品種靶區(qū)B的同源染色體片段導入到原品種染色體中的個體PI (B)雜交，將得到的后代個體自交。由此得到在原品種染色體中、源自外源品種的靶區(qū)A和B均為源自外源品種的純合體的個體P2 (AB)。此時，在靶區(qū)A與B相互獨立、且遵循孟德爾遺傳定律的情況下，理論上能夠以1/16的概率，從自交得到的后代個體中篩選出個體P2 (AB)。但是，篩選出的個體P2 (AB)大多存在不一定是兩個目標性狀被改良，或就算目標性狀被改良但其它性狀變差的情況。導入靶區(qū)的數(shù)量越多，上述問題越嚴重；實際上，改良三個以上性狀是非常困難的。
[0224]與此相對，用本發(fā)明的第一-第三新品種選育方法選育得到的品種個體及其后代個體，能夠盡可能地抑制導入靶區(qū)以外的染色體區(qū)。因此，與原品種不同的性狀極為可能是由被導入的源自外源品種的靶區(qū)的染色體片段所引起的效果。因此，如同本發(fā)明的第四新品種選育方法，例如，將 用本發(fā)明的第一-第三新品種選育方法使源自外源品種的靶區(qū)A的同源染色體被導入到原品種染色體中的個體PI (A)，與用同樣方法導入了源自外源品種的靶區(qū)B的同源染色體片段的個體PI (B)雜交，得到源自外源品種的靶區(qū)A與B均為源自外源品種的純合體的個體P2 (AB)的情況下，能夠充分期待在該個體P2 (AB)中不改變原品種所具有的優(yōu)良性狀就使改良個體PI (A)后所具有的性狀A和改良個體PI (B)后所具有的性狀B這兩種性狀均被改良。由此，通過使用本發(fā)明的第四新品種選育方法，能夠?qū)⒏牧嫉男誀钔ㄟ^雜交依次遺傳，能夠簡便且高精度地改良三個以上性狀。
[0225]并且，用于篩選的DNA標記Ml-M5為靶區(qū)內(nèi)或接近該靶區(qū)的DNA標記。因此，就像使用本發(fā)明的第四新品種選育方法那樣，即使反復進行多次雜交，也能夠用上述DNA標記Ml-M5，充分篩選出具有靶區(qū)染色體片段的后代個體。
[0226]例如，以本發(fā)明第一品種個體、即將源自外源品種的靶區(qū)A的同源染色體片段導入到原品種染色體中的個體P1(A)為父本，以本發(fā)明第一品種個體、即將源自外源品種靶區(qū)B的同源染色體片段導入到原品種染色體中的個體PI (B)為母本。然后，將PI (A)與P1(B)雜交，將得到的后代個體自交，從而得到后代個體；然后，從該自交得到的后代個體中，篩選出在原品種的染色體中、靶區(qū)A與B均被源自外源品種的同源染色體片段置換的個體P2(AB)。據(jù)此，能夠選育出新品種。在此，在靶區(qū)A與B沒有相互連鎖而各自獨立、且遵循孟德爾定律的情況下，能夠以1/16的概率、從自交得到的后代個體中篩選出個體P2 (AB)。
[0227]并且，由上述過程得到的后代個體P2 (AB)，與將源自外源品種的靶區(qū)C的同源染色體片段導入到原品種染色體中的個體Pi (C)雜交，得到后代個體。然后，將其得到的后代個體自交，從該自交得到的后代個體中，篩選出在原品種染色體中、靶區(qū)A、B、C均被源自外源品種的同源染色體片段置換的個體P3(ABC)。據(jù)此，能夠選育出新品種。在此，在靶區(qū)A、B、C沒有相互連鎖而是各自獨立、且在遵循孟德爾定律的情況下，能夠以1/64的概率、從自交得到的后代個體中篩選出個體P3 (ABC)。
[0228]靶區(qū)A、B、C均被源自外源品種的同源染色體片段置換的個體P3 (ABC)，例如還可以通過以下方法選育得到。首先、將PI (B)與PI (C)雜交得到后代個體，然后將得到的后代個體自交。從通過該自交得到的后代個體中，篩選出在原品種的染色體中、靶區(qū)B及C被源自外源品種的同源染色體片段置換的個體P2(BC)。在此，在靶區(qū)B和C沒有相互連鎖而各自獨立、且在遵循孟德爾定律的情況下，能夠以1/16的概率，從自交得到的后代個體中篩選出個體P2 (BC)。然后，將P2 (AB)與P2 (BC)雜交得到后代個體，然后從該后代個體自交得到的后代個體中篩選出P3 (ABC)，從而能夠選育得到P3 (ABC)。P2 (AB)與P2 (BC)均為靶區(qū)B是源自外源品種的純合體。因此，在靶區(qū)A、B、C沒有相互連鎖而各自獨立、且在遵循孟德爾定律的情況 下，能夠以1/16的概率、從通過自交得到的后代個體中篩選出個體P3 (ABC)。
[0229]圖10A及圖10B為表示將原品種染色體中的三個靶區(qū)(靶區(qū)A、B、C)置換成源自外源品種的染色體片段的品種選育方法的模式圖。圖中，方形表示各個個體、方形中的字母表示各靶區(qū)被置換成源自外源品種的染色體片段。在方形堆積成的金字塔中，ー個方形被堆積在兩個方形的上層。這表明下層的兩個方形表示親本、上層的ー個方形表示通過雜交得到的后代個體。并且，方形堆積成的金字塔的左側(cè)的數(shù)值表示在各靶區(qū)沒有相互連鎖而各自獨立、且在遵循孟德爾定律的情況下，得到各后代個體的概率。
[0230]圖10A表示將上述P2 (AB)與PI (C)雜交，選育P3 (ABC)的方法。圖10B表示將上述P2 (AB)與P2 (BC)雜交，選育P3 (ABC)的方法。這樣，通過將用本發(fā)明的第一-第三新品種選育方法選育得到的品種及其后代個體中、至少ー個靶區(qū)互不相同的個體之間依次雜交，從而在后代個體中，將多個用源自外源品種的染色體片段置換了的靶區(qū)遺傳下去。因此，也能夠選育出原品種染色體中四個以上靶區(qū)被源自外源品種的染色體片段置換的品種。
[0231]在此，記述了選育原品種染色體中4個靶區(qū)(靶區(qū)A、B、C、D)被源自外源品種的染色體片段置換的品種P4 (AB⑶)的情況。首先，例如將靶區(qū)A及B被置換成源自外源品種的同源染色體片段的個體P2(AB)、與靶區(qū)C及D被置換成源自外源品種的同源染色體片段的個體P2 (CD)雜交,得到后代個體。然后,從通過該后代個體自交得到的后代個體中，篩選出P4 (AB⑶)，從而能夠選育得到P4 (AB⑶)。此時，在靶區(qū)A、B、C、D沒有相互連鎖而各自獨立、且在遵循孟德爾定律的情況下，能夠以1/256的概率、從自交得到的后代個體中篩選出個體P4 (AB⑶)。同樣地，在選育5個靶區(qū)(靶區(qū)A、B、C、D、E)被置換成源自外源品種的染色體片段的品種P5 (ABCDE)時，首先，例如將靶區(qū)A、B、C被置換成源自外源品種的同源染色體片段的個體P3 (ABC)、與靶區(qū)DIE被置換成源自外源品種的同源染色體片段的個體P2 (DE)雜交,得到后代個體。然后,從通過該后代個體自交得到的后代個體中篩選出P5 (ABCDE)，從而能夠選育得到P5 (ABCDE)。此時，在靶區(qū)A、B、C、D、E沒有相互連鎖而各自獨立、且在遵循孟德爾定律的情況下，能夠以1/1024的概率、從自交得到的后代個體中篩選出個體P5 (ABCDE)。
[0232]但是，在得到常規(guī)目的后代個體時，按目的后代個體存在概率的幾倍-10倍左右，設定篩選群體(自交得到的后代個體群)的規(guī)模。如果篩選群體的規(guī)模不夠充足，則得不到目的后代個體的可能性高。另ー方面，通常情況下，從ー個個體上采集得到的種子數(shù)是有限的。例如，水稻中，從ー個個體上只能確保1000粒左右的種子。并且，水稻植物體本身就很脆弱，有時也有ー個植物體只得到幾十粒種子的情況。并且，篩選群體的規(guī)模越大，所需的時間、勞動力及成本等越大。因此，可以認為目的后代個體的存在概率在1/1024以上的選育方法，在現(xiàn)實中是非常難以實施的。
[0233]本發(fā)明的第四新品種選育方法中，通過將篩選出的后代個體依次雜交，能夠在其后代個體中，遺傳被源自外來染色體片段置換的靶區(qū)。因此，能夠以一次篩選群體中的目的后代個體的存在概率為1/256-1/16選育新品種。
[0234]對例如在靶區(qū)A、B、C、D沒有相互連鎖而各自獨立、且在遵循孟德爾遺傳定律的情況下，選育P4 (AB⑶)的方法(參考圖11A-圖11C)進行說明。首先，用與上述P2 (AB)的選育方法相同的方法選育得到P2 (AB)和P2 (⑶)。然后，將P2 (AB)與P2 (⑶)雜交，得到后代個體。然后，從通過該后代個體自交得到的后代個體中，篩選出P4(ABCD),從而能夠選育得到P4 (AB⑶)(參考圖11A)。這種情況下，理論上能夠從篩選群體以1/256的概率篩選出P4 (ABCD)。
[0235]并且，也可以將P2 (AB)與用上述P3 (ABC)的選育方法相同的方法選育得到的P3(BCD)雜交,得到后代個體；然后，將上述后代個體自交；從該自交得到的后代個體中，篩選出P4 (ABCD)(參考圖11B)。P2 (AB)與P3 (BCD)均為靶區(qū)B為源自外源品種的純合體。因此，理論上能夠從篩選群體中以1/64的概率篩選出P4 (AB⑶)。
[0236]還可以用與選育P3 (BCD)相同的方法選育得到P3 (ABC)和P3 (BCD)，將其雜交得到后代個體；然后，從通過該后代個體自交得到的后代個體中，篩選出P4 (ABCD)(參考圖11C)。P3 (ABC)與P3 (B⑶)均為靶區(qū)B及C為源自外源品種的純合體。因此，理論上能夠從篩選群體中以1/16的概率篩選出P4 (AB⑶)。
[0237]即根據(jù)本發(fā)明的新品種選育方法，即使是靶區(qū)為4個的情況下，也能夠以比現(xiàn)有技術更高的概率篩選出目的新品種。
[0238]并且，對例如在靶區(qū)A、B、C、D、E沒有相互連鎖而各自獨立、且在遵循孟德爾遺傳定律的情況下，選育P5 (AB⑶E)的方法(參考圖12A-圖12D)進行說明。首先，將P2 (AB)與P3 (CDE)雜交，得到后代個體。然后，從通過該后代個體自交得到的后代個體中，篩選出P5 (AB⑶E)，從而能夠選育得到P5 (AB⑶E)(參考圖12A)。這種情況下，理論上能夠從篩選群體中篩選出P5 (ABCDE)的概率為1/1024。
[0239]對此，下述情況會提高篩選出P5 (AB⑶E)的概率。
[0240]用與上述P3 (ABC)的選育方法相同的方法，分別選育得到P3 (ABC)和P3 (CDE)。然后，使上述P3 (ABC)與P3 (⑶E)雜交，得到后代個體。進而，從通過該后代個體自交得到的后代個體中，篩選出P5 (ABCED)，從而能夠選育得到P5 (ABCED)(參考圖12B)。P3 (ABC)與P3 (⑶E)均為靶區(qū)C為源自外源品種的純合體。因此，這種情況下，理論上能夠從篩選群體中以1/256的概率篩選出P5 (ABCDE)。
[0241]并且，也可以用與上述P3 (ABC)的選育方法相同的方法，選育P3 (ABC)、用與上述P4 (AB⑶)的選育方法相同的方法，選育P4 (B⑶E);然后，將上述P3 (ABC)與P4 (B⑶E)雜交，得到后代個體；從通過該后代個體自交得到的后代個體中，篩選出P5 (ABCDE)(參考圖12C)。P3 (ABC)和P4 (B⑶E)均為靶區(qū)B及C為源自外源品種的純合體。因此，理論上能夠從篩選群體中以1/64的概率篩選出P5 (AB⑶E)。
[0242]此外，還可以用與上述P4 (AB⑶)的選育方法相同方法，分別選育得到P4 (AB⑶)和P4 (B⑶E);然后將上述P4 (AB⑶)與P4 (B⑶E)雜交，得到后代個體；從通過該后代個體自交得到的后代個體中，篩選出P5 (ABCED)(參考圖12D)。P4 (AB⑶)與P4 (B⑶E)均為靶區(qū)B、C、D為源自外源品種的純合體。因此，在這種情況下，理論上能夠從篩選群體以1/16的概率篩選出P5 (ABCDE)。
[0243]即，根據(jù)本發(fā)明的新品種選育方法，即使是靶區(qū)為5個的情況下，也能夠以比現(xiàn)有技術更高的概率篩選出目的新品種。
[0244]并且，還記述了例如在靶區(qū)A、B、C、D、E、F沒有相互連鎖而各自獨立、且在遵循孟德爾遺傳定律的情況下，選育P6(AB⑶EF)的方法(參考圖13A-圖13E)。例如，將P3(ABC)與P3 (DEF)雜交，得到后代個體；然后將該后代個體自交。從該自交得到的后代個體中，篩選出P6 (AB⑶EF)，從而能夠選育得到P6 (AB⑶EF)(參考圖13A)。這種情況下，理論上能夠從篩選群體中篩選出P6 (AB⑶EF)的概率為1/4096。
[0245]此外，也可以使P3 (ABC)與P4 (⑶EF)雜交，得到后代個體；然后，從通過該后代個體自交得到的后代個體中，篩選出P6 (AB⑶EF)，從而能夠選育得到P6 (AB⑶EF)(參考圖13B)。這種情況下，理論上能夠從篩選群體中篩選出P6 (AB⑶EF)的概率為1/1024。
[0246]對此，下述情況會提高篩選出P6 (AB⑶EF)的概率。
[0247]首先，用與上述P4 (AB⑶)的選育方法相同的方法，分別選育出P4 (AB⑶)和P4(⑶EF)。然后，將這些P4 (AB⑶)與P4 (⑶EF)雜交，得到后代個體。進而，從通過該后代個體自交得到的后代個體中，篩選出P6 (AB⑶EF)，從而能夠選育得到P6 (AB⑶EF)(參考圖13C)。這時，理論上能夠從篩選群體中以1/256的概率篩選出P6 (AB⑶EF)。這是因為P4 (AB⑶)與P4 (⑶EF)均為靶區(qū)C及D為源自外源品種的純合體。
[0248]此外，也可以用與上述P4 (AB⑶)的選育方法相同的方法選育得到P4 (AB⑶);用與上述P5 (AB⑶E)的選育方法相同的方法選育得到P5 (B⑶EF);然后將上述P4 (AB⑶)與P5 (BCDEF)雜交，得到后代個體；然后將該后代個體自交；從該自交得到的后代個體中，篩選出 P6 (ABCDEF)，從而能夠選育得到 P6 (ABCDEF)(參考圖 13D)。P4 (ABCD)與 P5 (BCDEF)均為靶區(qū)B、C、D為源自外源品種的純合體。因此，在這種情況下，理論上能夠從篩選群體中以1/64的概率篩選出P6 (ABCDEF)。
[0249]此外，還可以用與上述P5 (AB⑶E)的選育方法相同的方法，分別選育得到P5(ABCDE)和P5 (BCDEF);然后將上述P5 (ABCDE)與P5 (BCDEF)雜交，得到后代個體；然后，從通過該后代個體自交得到的后代個體中，篩選出P6 (ABCDEF),從而能夠選育得到P6(ABCDEF)(參考圖13E)。P5 (ABCDE)與P5 (BCDEF)均為靶區(qū)B、C、D、E為源自外源品種的純合體。因此，在這種情況下，理論上能夠從篩選群體中以1/16的概率篩選出P6(AB⑶EF)。
[0250]即根據(jù)本發(fā)明的新品種選育方法，即使是靶區(qū)為6個的情況下，也能夠以比現(xiàn)有技術更高的概率篩選出目的新品種。
[0251]如上所述，在像水稻等由一次雜交所得到的后代個體數(shù)比較少的植物時，優(yōu)選使一次篩選群體中的目的后代個體的存在概率為1/64-1/16，選育新品種。即，通過將染色體中不同靶區(qū)之和為三個以下的個體進行組合，使其彼此之間依次雜交，從而能夠穩(wěn)定地選育出原品種染色體中的、多個靶區(qū)被置換成源自外源品種的染色體片段的品種。
[0252]圖14A-14C為表示將一次篩選群體中的目的后代個體的存在概率設為1/64-1/16，選育品種P6 (ABCDEF)的選育方法的模式圖。圖14A為將所有篩選群體中的概率設為1/16時的選育方法的示意圖。圖14B及圖14C為將所有篩選群體中的概率設為1/16或1/64時的選育方法的示意圖。即使是靶區(qū)數(shù)在7個以上吋，同樣能夠選育得到一次篩選群體中的目的后代的存在概率為1/64-1/16的品種，。
[0253]在各靶區(qū)沒有相互連鎖而各自獨立、且在遵循孟德爾遺傳定律的情況下，如何規(guī)定目的后代個體在一個 篩選群體中存在的概率，可以對通過一次雜交得到的后代個體數(shù)、直至最終得到目的品種個體的時間等方面進行考慮，做出適當決定。當通過雜交得到的后代個體數(shù)充足時，可以將存在目的后代個體的概率設定為像1/64等這種低的值。此時，一次篩選群體的規(guī)模比較大，一次篩選所需的時間、勞動力及成本提高，但能夠通過較少的篩選次數(shù)，得到目的數(shù)量的靶區(qū)被源自外源品種的染色體片段置換的品種。另ー方面，當通過一次雜交得到的后代個體數(shù)比較少時，不得不縮小一次篩選群體的規(guī)模。此時，會抑制一次篩選所需的時間及成本等，但篩選次數(shù)增多，延長直至最終得到目的品種個體的時間。例如，圖11A-圖11C所示，當選育P4 (AB⑶)時，圖11A的方法中，通過如下三次篩選選育得到P4 (ABCD)，將PI (A)與PI (B)雜交，篩選出P2 (AB);將PI (C)與PI (D)雜交，篩選出P2 (⑶);以及將P2 (AB)與P2 (⑶)雜交，篩選出P4 (AB⑶)。另ー方面，在圖11C的方法中，通過至少如下5次篩選出P4 (AB⑶)，例如將PI (A)與PI (B)雜交，篩選出P2 (AB)；將PI (C)與PI (D)雜交，篩選出P2 (CD);將P2 (AB)與PI (C)雜交，篩選出P3 (ABC)；將 PI (B)與 P2 (CD)篩選出 P3 (BCD);將 P3 (ABC)與 P3 (BCD)雜交，篩選出 P4 (ABCD)。在圖11A的方法中，雜交的親本所具有的、被源自外源品種染色體片段置換的靶區(qū)在各自的親本上不同。因此，與圖11C的方法相比，還需要擴大一次篩選群體的規(guī)模，但能夠用更少的篩選次數(shù)選育得到P4 (AB⑶)。
[0254]如上所述，本發(fā)明所選育得到的新品種，其為染色體的一部分被源自外源品種的染色體片段置換的染色體片段置換系的后代品種。該新品種的ー個或多個靶區(qū)被置換成源自外源品種的染色體片段，染色體片段的長度通過設定在靶區(qū)上游的DNA標記和設定在靶區(qū)下游的DNA標記進行控制。在本發(fā)明中，通過適當設定靶區(qū)，能夠得到后述實施例中記載的新品種，特別是能夠得到水稻品種越光籽4號(Oryza sativa L.cultivar Koshihikarikazusa4go)等有用的新品種。
[0255]此外，能夠選育出在親本所具有的、被源自外源品種的染色體片段置換的多個區(qū)中，至少ー個區(qū)被置換成源自原品種的染色體片段的新品種。首先，對用本發(fā)明的第一-第四新品種選育方法選育得到的品種、且原品種染色體中的兩個以上靶區(qū)被置換成源自外源品種的染色體片段的品種，將其個體或該個體的后代個體、與原品種個體雜交。然后將該雜交得到的后代個體自交，從該自交得到的后代個體中篩選出至少ー個區(qū)被源自原品種的染色體片段置換的個體。
[0256]例如，以下描述用本發(fā)明的第一-第四新品種選育方法，選育出在原品種的染色體中、靶區(qū)A、B、C均被置換成源自外源品種的同源染色體片段的個體P3 (ABC)的情況。首先，將該P3 (ABC)與原品種個體雜交。然后，通過將該雜交得到的后代個體自交，篩選出僅使靶區(qū)A及B被源自外源品種的同源染色體片段置換、靶區(qū)C被源自原品種的染色體片段置換的個體P2 (AB);和僅將靶區(qū)B被源自外源品種的同源染色體片段置換、靶區(qū)A及C被源自原品種的染色體片段置換的個體P2 (B)等。如上所述，能夠選育得到親本所具有的、被源自外源品種的染色體片段置換的多個區(qū)中，至少ー個區(qū)被置換成源自原品種的染色體片段的新品種個體。
[0257]下面通過實施例對本發(fā)明進行更詳細地說明，但本發(fā)明并不限于以下實施例。
[0258]實施例1
[0259]使用本發(fā)明選育改良了水稻品種越光的抗倒伏性的新品種。
[0260]首先，將半矮桿的水稻品種哈巴達克和水稻品種越光雜交，在分離群體中進行了QTL(Quantitative Trait Locus)分析。結果表明:在第一染色體的Sdl區(qū),存在多個QTL。推測出若將越光的該區(qū)改為源自哈巴達克的基因區(qū)，會使越光的植株(桿長)變矮、抗倒伏性增強。因此，針對哈巴達克，用越光進行回交，選育得到越光的Sdl區(qū)被源自哈巴達克的基因片段置換的染色體片段置換系。
[0261]然后，按照本發(fā)明的植物基因組構建方法，對制得的染色體片段置換系中源自哈巴達克的染色體片段區(qū)的長度進行調(diào)整，構建基因組。具體地說，將位于Sdl區(qū)的DNA標記SP-4009作為DNA標記Ml (Sdl),將DNA標記G2003作為DNA標記M2 (Sdl)、將DNA標記G2002作為DNA標記M3 (Sdl )、將DNA標記SP-462作為DNA標記M4 (Sdl )，將DNA標記SP-1259作為DNA標記M5 (Sdl)。上述DNA標記如圖15及表1所示。DNA標記Ml (Sdl)與M2 (Sdl)之間的距離dl約為1.6kbp、DNA標記M2 (Sdl)-M4 (Sdl)之間的距離d2約為90kbp、DNA標記M4 (Sdl)與M5 (Sdl)之間的距離d3約為750kbp。據(jù)此，在越光的染色體中，源自哈巴達克的染色體片段U的長度為90kbp〈L1〈842kbp。
[0262]表1
【權利要求】
1.ー種植物品種的鑒別方法，該方法用于鑒別某種植物個體是否為特定品種，其特征在于:將SP-2513作為DNA標記Ml、將SP-586作為DNA標記M2、將SP-2254作為DNA標記M3、將SP-1603作為DNA標記M4、將SP-604作為DNA標記M5，通過所述植物個體的基因組分析，將選自所述DNA標記Ml-M5中的ー種以上的所述DNA標記進行分型； 當?shù)玫降姆中徒Y果與水稻品種越光H3號(Koshihikari eichi3go)或水稻品種越光籽4號的結果一致時，鑒定 所述植物個體為水稻品種越光H3號或水稻品種越光籽4號。
【文檔編號】C12Q1/68GK103451277SQ201310220583
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2009年7月7日 優(yōu)先權日:2008年7月7日
【發(fā)明者】林少揚 申請人:本田技研工業(yè)株式會社