檢測彎曲菌23SrRNA基因突變位點的引物及方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種檢測彎曲菌23SrRNA基因突變位點的引物及方法。本發(fā)明提供了檢測或輔助檢測彎曲菌23S rRNA基因突變位點的引物組，由特異片段擴增引物對和測序引物組成；所述特異片段擴增引物對由序列表中序列1所示的單鏈DNA分子和序列表中序列2所示的單鏈DNA分子組成；所述測序引物為序列表中序列2所示的單鏈DNA分子。本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明提供的用于焦磷酸測序法的引物組及方法，應用簡單、反應快速，且可以通過直接測序結果是否有突變而判斷待測菌株是否耐紅霉素。
【專利說明】檢測彎曲菌23SrRNA基因突變位點的引物及方法

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物【技術領域】，尤其涉及一種檢測彎曲菌23S rRNA基因突變位點的引 物及方法。

【背景技術】
[0002] 嗜熱彎曲菌是引起人急性胃腸炎的最重要的食源性致病菌之一，臨床上95%以上 的彎曲菌性腸炎都是由空腸彎曲菌和結腸彎曲菌引起?？漳c/結腸彎曲菌可通過食物鏈傳 播給人，污染的禽肉、牛奶和飲用水都是主要的傳播途徑。紅霉素是典型的大環(huán)內酯類藥 物，同時也是臨床上針對彎曲菌感染的一線治療藥物，而耐藥彎曲菌的出現(xiàn)導致臨床上彎 曲菌病病程遷延不愈和治療失敗，極大的威脅人類健康，耐藥菌株也導致治療成本增加等 問題，造成巨大的經濟損失。彎曲菌對紅霉素表現(xiàn)耐藥主要是由核糖體23S rRNA肽酰轉移 酶活性中心基因突變所介導。由于彎曲菌含有3個拷貝的核糖體23S rRNA，因此有必要對 耐紅霉素彎曲菌核糖體23S rRNA基因的2075位點定量檢測。
[0003] 目前用于檢測彎曲菌耐藥的方法主要有傳統(tǒng)的藥物敏感性試驗法和基因型突變 檢測法，基因型突變檢測法主要有聚合酶鏈式反應線性探針法，聚合酶鏈式反應限制性片 段長度多態(tài)性分析法，錯配擴增突變聚合酶鏈反應法，及熒光定量聚合酶鏈式反應法等方 法。傳統(tǒng)的彎曲菌藥物敏感性試驗需要進行彎曲菌培養(yǎng)，要求較高的培養(yǎng)條件，需要花費大 量的時間，不滿足急性傳染病緊急疫情防治工作的需要；以聚合酶鏈式反應為基礎的其他 基因型突變檢測方法成本較高，不適宜對大量樣品進行檢測，而且僅是定性試驗，無法進行 點突變基因拷貝數的定量試驗。
[0004] 焦磷酸測序技術是近年發(fā)展起來的一種依靠生物發(fā)光進行脫氧核苷酸（DNA)序列 分析新技術，它是目前唯一得到定量序列結果的突變檢測技術，可達到實時測定DNA的序 列的目的，此技術不需要熒光標記的引物或核酸探針，具有分析結果快速、準確和極高的準 確性，重現(xiàn)性佳，和自動化的特點。是一種通用型技術平臺，功能多樣，應用領域廣泛，具有 高通量、低成本的特點，聚合酶鏈式反應（PCR)產物即可直接用于測序，不需進行產物二次 處理，操作簡便，所需樣品量小的特點。在焦磷酸測序檢測突變的過程中，對目的片段很好 的擴增和對待測位點的確定是整個實驗的關鍵。


【發(fā)明內容】

[0005] 本發(fā)明的一個目的是提供檢測或輔助檢測彎曲菌23S rRNA基因突變位點的引物 組。
[0006] 本發(fā)明提供的檢測或輔助檢測彎曲菌23S rRNA基因突變位點的引物組，由特異片 段擴增引物對和測序引物組成；
[0007] 所述特異片段擴增引物對為能特異擴增含有所述彎曲菌23S rRNA基因突變位點 的片段的引物對；
[0008] 所述測序引物為由15個核苷酸組成的單鏈DNA分子，所述單鏈DNA分子的5'端 的3-10個核苷酸與所述彎曲菌23S rRNA基因突變位點前3-10核苷酸相同或互補。
[0009] 上述引物組中，所述特異片段擴增引物對由序列表中序列1所示的單鏈DNA分子 和序列表中序列2所示的單鏈DNA分子組成；
[0010] 所述測序引物為序列表中序列3所示的單鏈DNA分子。
[0011] 上述引物組中，所述特異片段擴增引物對中序列表中序列2所示的單鏈DNA分子 的5'末端標記生物素；
[0012] 所述23S rRNA基因突變位點為23S rRNA基因的第2075位堿基，所述23S rRNA 基因的第2075位堿基為突變堿基G或野生型堿基A ;
[0013] 所述彎曲菌為空腸彎曲菌或結腸彎曲菌。
[0014] 本發(fā)明的另一個目的是提供檢測或輔助檢測彎曲菌23S rRNA基因突變位點的 PCR試劑或PCR試劑盒。
[0015] 本發(fā)明提供的PCR試劑，由PCR試劑A和PCR試劑B組成；所述PCR試劑A由上述 的引物組中的特異片段擴增引物對、PCR擴增緩沖液A和水組成；
[0016] 上述 PCR 擴增緩沖液 A 為 TAKARA 公司的 Premix Ex Taq?Version2. 0 (Loading dye mix, TAKARA 公司，貨號是 D336A ;
[0017] 所述PCR試劑B由上述的引物組中的測序引物、PCR擴增緩沖液B和水組成；
[0018] 所述引物組中的特異片段擴增引物對中的各條引物在所述PCR試劑A中的終濃度 均為10ρΜ-1 μ M，所述引物組中的特異片段擴增引物對中的各條引物在所述PCR試劑A中的 終濃度均具體為10pM ;
[0019] 上述 PCR 擴增緩沖液 B 為 annealing buffer (BI0TAGE 公司， Ref40-00361ot610018)。
[0020] 本發(fā)明提供的PCR試劑盒，包括上述的引物組或所述PCR試劑；
[0021] 所述23S rRNA基因突變位點為23S rRNA基因的第2075位堿基，所述23S rRNA 基因的第2075位堿基為突變堿基G或野生型堿基A ;
[0022] 所述彎曲菌為空腸彎曲菌或結腸彎曲菌。
[0023] 上述的引物組或上述PCR試劑或試劑盒在制備檢測和/或輔助檢測待測彎曲菌 23S rRNA基因突變位點產品中的應用也是本發(fā)明保護的范圍；
[0024] 或上述的引物組或上述的PCR試劑或試劑盒在制備檢測和/或輔助檢測待測彎曲 菌耐藥性中的應用也是本發(fā)明保護的范圍；
[0025] 所述23S rRNA基因突變位點具體為23S rRNA基因的第2075位堿基，所述23S rRNA基因的第2075位堿基具體為突變堿基G或野生型堿基A ;所述耐藥性具體為耐紅霉 素；所述彎曲菌具體為空腸彎曲菌或結腸彎曲菌。
[0026] 上述產品為試劑盒。
[0027] 本發(fā)明的第三個目的是提供一種檢測待測彎曲菌23S rRNA基因突變位點的方法。
[0028] 本發(fā)明提供的檢測待測彎曲菌23S rRNA基因突變位點的方法，包括如下步驟：
[0029] 1)用上述的引物組或上述PCR試劑或試劑盒中的所述特異片段擴增引物對對待 測彎曲菌進行PCR擴增，得到生物素標記的PCR產物；
[0030] 2)所述生物素標記的PCR產物和抗生物素蛋白的瓊脂糖凝膠磁珠（以抗生物素 蛋白的瓊脂糖凝膠磁珠的溶液形式存在，每50ul溶液為3 μ L抗生物素蛋白的瓊脂糖凝膠 磁珠和47ul的binding buffer的混合溶液）震蕩混合(體積比為1:1，25°C)下震蕩混合 lOmin)，得到混合產物；抓取所述混合產物中結合瓊脂糖磁珠的PCR產物，再進行變性(依 次在70%無水乙醇、0. 2M的NaOH水溶液、10mM的Tris-醋酸中放置)，得到焦磷酸測序單鏈 模板；
[0031] 3)將所述焦磷酸測序單鏈模板與測序引物在測序緩沖液中混勻，經80°C反應 2min后冷卻，使單鏈模板與測序引物結合，設定反應順序為AGACGATCGATCGATC進行測序， 得到測序產物，實現(xiàn)檢測待測彎曲菌23S rRNA基因突變位點；
[0032] 所述23S rRNA基因突變位點為23S rRNA基因的第2075位堿基，所述23S rRNA 基因的第2075位堿基為突變堿基G或野生型堿基A。
[0033] 本發(fā)明的第四個目的是提供一種檢測和/或輔助檢測待測彎曲菌是否耐紅霉素 的方法。
[0034] 本發(fā)明提供的檢測和/或輔助檢測待測彎曲菌是否耐紅霉素的方法，包括如下步 驟：
[0035] 1)用檢測待測彎曲菌23S rRNA基因突變位點的方法對待測彎曲菌23S rRNA基因 突變位點進行測序，得到測序產物；
[0036] 2)檢測測序產物，若所述測序產物中23S rRNA基因的第2075位堿基為突變堿基 G，則所述待測彎曲菌為或候選為耐紅霉素；若所述測序產物中的23S rRNA基因的第2075 位堿基均為野生型堿基A，則所述待測彎曲菌不為或候選不為耐紅霉素。
[0037] 本發(fā)明的第五個目的是提供一種檢測和/或輔助檢測待測彎曲菌是否耐紅霉素 的方法。
[0038] 本發(fā)明提供的檢測和/或輔助檢測待測彎曲菌是否耐紅霉素的方法，包括如下步 驟：
[0039] 1)用檢測待測彎曲菌23S rRNA基因突變位點的方法對待測彎曲菌23S rRNA基因 突變位點進行測序，得到測序產物；
[0040] 2)若所述測序產物中的至少一個23S rRNA基因拷貝的第2075位堿基為突變堿基 G，則所述待測彎曲菌為或候選為耐紅霉素；若所述測序產物中的3個23S rRNA基因拷貝的 第2075位堿基均為野生型堿基A，則所述待測彎曲菌不為或候選不為耐紅霉素；
[0041] 所述待測彎曲菌中含有3個23S rRNA基因拷貝。
[0042] 上述各方法中，所述待測彎曲菌為空腸彎曲菌或結腸彎曲菌；
[0043] 步驟1)中，所述PCR產物的模板為基因組DNA。
[0044] 本發(fā)明的第六個目的是提供一種引物對。
[0045] 本發(fā)明提供的引物對，由序列表中序列1所示的單鏈DNA分子和序列表中序列2 所示的單鏈DNA分子組成。
[0046] 本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明提供的引物組及方法，具體如下優(yōu)點：
[0047] 1、特異引物對擴增的目的條帶亮度高、條帶單一、無非特異性結合，說明本發(fā)明提 供的PCR引物擴增效率高、特異性強；
[0048] 2、從測序結果可以看出，本發(fā)明提供的測序引物能很好的檢測待測突變位點，靈 敏度高，單核苷酸突變即可檢測；
[0049] 3、本發(fā)明所應用的焦磷酸測序法檢測耐紅霉素彎曲菌核糖體23S rRNA基因突變， 聚合酶鏈式反應（PCR)產物即可直接用于測序，不需進行產物二次處理，所需樣品量小；從 測序圖可看出，本發(fā)明應用的焦磷酸測序方法檢測突變位點，可直接獲得突變拷貝數的定 量分析數據。
[0050] 總之，本發(fā)明提供的引物組和方法，應用簡單、反應快速，且可以通過直接測序結 果是否有突變而判斷待測菌株是否耐紅霉素。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0051] 圖1為對彎曲菌樣本的23S rRNA基因擴增圖譜
[0052] 圖2為對彎曲菌標準敏感菌株樣本23S rRNA基因的2075位點焦磷酸測序結果
[0053] 圖3為對彎曲菌臨床分離紅霉素耐藥菌株樣本23S rRNA基因的2075位點突變焦 磷酸測序結果

【具體實施方式】
[0054] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0055] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0056] 為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的主要原理是利用PCR制備待測序模板，PCR的引物之 一是用生物素標記的。當PCR產物和偶聯(lián)抗生物素蛋白的瓊脂糖凝膠磁珠孵育，DNA雙鏈 經堿變性分開。純化得到含有生物素標記的待測序單鏈，測序引物與待測序單鏈模板相結 合。然后將其與DNA聚合酶、腺嘌呤核苷三磷酸（ATP)硫酸化酶、熒光素酶和腺苷三磷酸雙 磷酸酶，以及底物腺苷酰硫酸（APS)和熒光素一起孵育。四種三磷酸堿基脫氧核苷酸dNTP (dATP，dTTP，dCTP，dGTP)之一被加入反應體系，如與模板配對（A- T，C一G)，此dNTP與引 物的末端形成共價鍵，dNTP的焦磷酸基團（PPi )釋放出來。而且釋放出來的PPi的量與和 模板結合的dNTP的量成正比。硫酸化酶催化APS和PPi形成ΑΤΡ，ATP驅動熒光素酶介導 的熒光素向氧化熒光素的轉化，氧化熒光素發(fā)出與ATP量成正比的可見光信號。光信號由 CCD攝像機檢測并反應為峰。每個光信號的峰高與反應中摻入的核苷酸數目成正比。ATP 和未摻入的dNTP由腺苷三磷酸雙磷酸酶降解，淬滅光信號，并再生反應體系。然后加入下 一種dNTP。最終待樣品中耐紅霉素23S rRNA基因的2075位點突變和突變發(fā)生的拷貝數， 即可從反應光強的信號峰中讀出。
[0057] 實施例1、用于檢測彎曲菌標準敏感菌株樣本中是否含有23S rRNA基因2075位點 突變的引物組的獲得
[0058] 1、特異性PCR引物和設計
[0059] 通過在美國國立生物信息中心（NCBI)，查詢檢索彎曲菌公布序列，以PSQ assay design program軟件設計針對彎曲菌23S rRNA基因(序列4)特異性引物，擴增目的片段長 度為227bp。
[0060] 用于擴增目的片段PCR引物包括：
[0061] 上游引物：5' TTAAATACCGACCTGCATGAATG3'（序列 1);
[0062] 下游引物：5' TGGTATCTCAACAATGGCTCATAT3'（序列 2)。
[0063] 上述下游引物(序列2 )的5 '末端用生物素進行標記。
[0064] 2、焦磷酸測序引物設計
[0065] 選取紅霉素耐藥突變位點（彎曲菌23S rRNA基因的第2075突變位點）前10個左 右喊基設計測序引物，測序引物如下：
[0066] 用于檢測突變位點的測序引物：5' CTCCTACCCGCGGCA3'（序列3)。
[0067]因此上游引物、下游引物和測序引物可以組成用于檢測彎曲菌標準敏感菌株樣本 中是否含有23S rRNA基因2075位點突變的引物組。
[0068] 上述引物組可為檢測彎曲菌標準敏感菌株樣本中是否含有23S rRNA基因2075位 點突變的試劑盒的組分。
[0069] 實施例2、引物組在檢測樣本中是否含有23S rRNA基因2075位點突變中的應用
[0070] -、檢測彎曲菌標準敏感菌株樣本中是否含有23S rRNA基因2075位點突變中的 應用
[0071] 1、基因組DNA的提取
[0072] 提取彎曲菌標準敏感菌株（Campylobacter jejuni subsp. jejuni ATCC33560 美 國菌種保藏中心該彎曲菌標準敏感菌株不耐紅霉素，其23S rRNA基因序列為序列4,且 2075位點的核苷酸為A，空腸彎曲菌。）樣本的基因組DNA。
[0073] 2、PCR 擴增
[0074] 1)、反應體系的確定
[0075] PCR反應體系為50 μ L :25 μ LPCR擴增緩沖液（TAKARA公司的Premix Ex Taq?Version2.0(Loading dye mix,貨號是 0336六)）、100叩/以1^的0嫩模板1以1^、上下游 引物各1 μ L、雙蒸水22 μ L，上游引物和上游引物在反應體系中的終濃度均分別均為1 μ Μ、 0· 1 μ Μ、ΙΟηΜ、1ηΜ、0· InM 和 ΙΟρΜ、1 μ L 基因組 DNA 作為模板。
[0076] 2)、PCR反應條件
[0077] 將上述PCR反應體系按照如下PCR反應條件進行擴增：95°C 5min，l個循環(huán)， 95°C lmin，6(TC 45sec，72°C 45sec，45 個循環(huán)，72°C 10min，l 個循環(huán)。
[0078] 結果如圖1所示，M :DL2000,1-6 :引物濃度依次10倍進行稀釋的PCR電泳，引物 濃度分別為1 μ M、0. 1 μ Μ、ΙΟηΜ、1ηΜ、0. InM和10pM，可以看出，在低濃度10pM仍然可以獲得 亮度很高的目的條帶，得到227bp生物素標記的PCR產物。
[0079] 出于成本和實驗效果在雙重考慮，選擇引物終濃度為10pM。
[0080] 上述反應體系除去模板為其他組分組成PCR試劑。
[0081] 上述PCR試劑均可為檢測彎曲菌標準敏感菌株樣本中是否含有23S rRNA基因 2075位點突變的試劑盒的一種組分。
[0082] 3、制備焦磷酸測序單鏈模板
[0083] 將50 μ L上述2得到的生物素標記的PCR產物與50ul抗生物素蛋白的瓊脂糖凝 膠磁珠的溶液（3 μ L抗生物素蛋白的瓊脂糖凝膠磁珠和47ul的binding buffer (BI0TAGE 公司，ref40-00331ot580020)組成）按照1:1體積震蕩混合，使得總體積達到100ul (GE Healthcarel7-5113-01)在室溫（25°C)下震蕩混合10min，使得抗生物素蛋白的瓊脂糖凝 膠磁珠與生物素充分結合。
[0084] 抓取所述混合產物中結合瓊脂糖磁珠的PCR產物：
[0085] 在workstat ion(工作站，儀器的組成部分沖，4個對應的樣品板內依次加入180ml 高純水、70% 無水乙醇、washing buffer 和 120ml Denaturation buffer。將 PSQ96MA 測序 儀器反應面板上的抽真空開關置于on狀態(tài)，vacuum prep tool (抓取磁珠的96孔探頭)先 在高純水中清洗30s，之后將tool移到已完成震蕩的混合產物中，抓取結合瓊脂糖磁珠的 PCR產物，在震蕩結束后3分鐘內完成抓取工作；
[0086] 變性：再依次將vacuum prep tool放入70%無水乙醇中l(wèi)Osec ;然后Denaturation buffer(0. 2M 的 NaOH 水溶液，ΡΗ=13· 3)中 lOsec ;再移到 washing buffer( 10mM 的 Tris-醋 酸，PH=7. 6)中清洗lOsec,此時已得到含有焦磷酸測序單鏈模板，該單鏈模板吸附于vacuum prep tool 上。
[0087] 4、焦磷酸測序
[0088] 將帶有焦磷酸測序單鏈模板的vacuum prep tool置于裝有40ul測序體系的96 孔板的相應位置的正上方，40ul測序體系如下：38.5ul annealing buffer(BI0TAGE公司， Ref40-00361ot610018)，1. 5ul測序引物(測序引物在測序體系中的終濃度為0. 3uM);對準 位置后，再把工作面板的抽真空開關置于off狀態(tài)，將tool放入測序體系中，輕輕搖動，釋 放結合瓊脂糖磁珠的單鏈產物。
[0089] 再將96孔板置于80°C烘箱，放置2min后，再取出任其自動冷卻到室溫。
[0090] 軟件中設置反應程序，進入SQA系統(tǒng)后選擇SQA Entries，從左往右的第二欄里， 設定反應順序為AGACGATCGATCGATC，并根據軟件提示加好試劑艙，進行焦磷酸測序反應。引 物鏈隨著不同dNTP的加入延伸。
[0091] 焦磷酸測序結果見圖2,讀取的序列為AGACGGAAAGACCCCGT (該片段為序列表中序 列4的自5'末端第2068至2084位堿基)，其中2075位點為未突變堿基A，其與該菌株的經 過測序的23S rRNA基因序列對應的位置一致。
[0092] 可以看出，彎曲菌標準敏感菌株23S rRNA基因擴增目的片段長度為227bp，與 NCBI公布敏感彎曲菌23S rRNA2075位點一致。
[0093] 同時定量測序反應顯示，2075位點堿基結合A為100%，G為0%，因此判定該彎曲菌 樣本23S rRNA基因3個拷貝中無2075位點堿基突變。
[0094] 可以看出，該彎曲菌樣本23S rRNA基因3個拷貝中均無2075位點堿基突變，因此， 該彎曲菌樣本不耐紅霉素，這與鑒定一致，說明本發(fā)明的方法正確。
[0095] 二、焦磷酸測序檢測彎曲菌臨床分離紅霉素耐藥菌株樣本中是否含有23S rRNA基 因2075位點突變
[0096] 1、基因組DNA的提取
[0097] 提取耐紅霉素彎曲菌菌株空腸彎曲菌SX122 (Xia Chen*，Gao_Wa Naren氺，Cong-Ming Wu，Yang Wang, Lei Dai，Li-Ning Xia Peng-Jie Luo, Qi jing Zhang，Jian-Zhong Shen. Prevalence and antimicrobial resistance of Campylobacter isolates in broilers from China. Vet Microbioll44(2010) 133 - 139.公眾可從中國農 業(yè)大學獲得。通過藥物敏感性試驗(即MIC)，鑒定該菌株耐紅霉素；該耐紅霉素彎曲菌菌株 的23S rRNA基因的核苷酸序列為將序列4第2075位點變?yōu)镚，空腸彎曲菌)的基因組DNA。
[0098] 2、PCR 擴增
[0099] 按照一的2的方法進行PCR擴增。
[0100] 3、制備焦磷酸測序單鏈模板
[0101] 按照一的3的方法制備焦磷酸測序單鏈模板。
[0102] 4、焦磷酸測序
[0103] 按照一的4的方法焦磷酸測序。
[0104] 焦磷酸測序結果見圖3，讀取的序列為AGACGGAGAGACCCCGT。
[0105] 耐紅霉素彎曲菌菌株的23S rRNA基因擴增目的片段長度為227bp，與標準一致； 經過焦磷酸測序，測定的序列片段與23S rRNA基因未突變的2075位點堿基對應的序列顯 示不一致：為AGACGGAGAGACCCCGT (與該菌株的經過測序的23S rRNA基因序列對應的位置 一致，第2075位點為突變堿基G);同時定量測序反應顯示，目的位點堿基結合A為1. 4%，G 為98. 6%，因此判定該彎曲菌樣本23S rRNA基因中3個拷貝均發(fā)生2075位點堿基A - G突 變。
[0106] 由于耐紅霉素的彎曲菌核糖體23S rRNA基因的2075位點發(fā)生突變如（A - G)，因 此，該彎曲菌樣本耐紅霉素，這與鑒定一致，說明本發(fā)明的方法正確。
[0107] 從上述實驗可以看出，可以用本發(fā)明的引物組或PCR試劑或試劑盒，采用本發(fā)明 的方法鑒定待測彎曲菌的23S rRNA基因的2075位點是否發(fā)生突變，從而判斷該待測彎曲 菌是否耐紅霉素，具體如下：
[0108] 若測序產物中23S rRNA基因的第2075位堿基為突變堿基G，則待測彎曲菌為或候 選為耐紅霉素；若測序產物中的23S rRNA基因的第2075位堿基均為野生型堿基A，則待測 彎曲菌不為或候選不為耐紅霉素。
[0109] 為了更準確判斷該待測彎曲菌是否耐紅霉素：待測彎曲菌中含有3個23S rRNA基 因拷貝；若測序產物中的至少一個23S rRNA基因拷貝的第2075位堿基為突變堿基G，則待 測彎曲菌為或候選為耐紅霉素；若測序產物中的3個23S rRNA基因拷貝的第2075位堿基 均為野生型堿基A，則待測彎曲菌不為或候選不為耐紅霉素。
[0110] 上述待測彎曲菌可以為空腸彎曲菌或結腸彎曲菌。
[0111] 實施例3、引物組在檢測樣本中是否含有23S rRNA基因2075位點突變中的應用
[0112] 選取待測菌株：敏感菌株編號為 PL12 (Xia Chen*, Gao-Wa Naren*，Cong-Ming Wu,Yang Wang, Lei Dai，Li-Ning Xia Peng-Jie Luo, Qi jing Zhang，Jian-Zhong Shen. Prevalence and antimicrobial resistance of Campylobacter isolates in broilers from China. Vet Microbioll44(2010) 133 - 139.公眾可從中國農業(yè)大學獲得。通過藥物敏 感性試驗(即MIC)，鑒定該菌株不耐紅霉素；空腸彎曲菌；該菌株的23S rRNA基因序列為序 列表中的序列4)。
[0113] 1、基因組DNA的提?。悍椒ㄍ瑢嵤├?的一 1 ;
[0114] 2、PCR擴增：方法同實施例2的一 2 ;
[0115] 3、制備焦磷酸測序單鏈模板：方法同實施例2的一 3 ;
[0116] 4、焦磷酸測序：方法同實施例2的一 4 ;
[0117] 結果如下：PL12菌株所測得的序列同ATCC33560標準菌株，與NCBI公布敏感彎曲 菌23S rRNA2075位點一致。同時定量測序反應顯示，2075位點堿基結合A為100%，G為0%， 因此判定該彎曲菌樣本23S rRNA基因3個拷貝中無2075位點堿基突變。
[0118] 可以看出，該彎曲菌樣本23S rRNA基因3個拷貝中均無2075位點堿基突變，因此， 該彎曲菌樣本不耐紅霉素，這與鑒定一致，說明本發(fā)明的方法正確。
【權利要求】
1. 檢測或輔助檢測彎曲菌23S rRNA基因突變位點的引物組，由特異片段擴增引物對 和測序引物組成； 所述特異片段擴增引物對為能特異擴增含有所述彎曲菌23S rRNA基因突變位點的片 段的引物對； 所述測序引物為由15個核苷酸組成的單鏈DNA分子，所述單鏈DNA分子的5'端的3-10 個核苷酸與所述彎曲菌23S rRNA基因突變位點前3-10核苷酸相同或互補。
2. 根據權利要求1所述的引物組，其特征在于： 所述特異片段擴增引物對由序列表中序列1所示的單鏈DNA分子和序列表中序列2所 示的單鏈DNA分子組成； 所述測序引物為序列表中序列3所示的單鏈DNA分子。
3. 根據權利要求1或2所述的引物組，其特征在于： 所述特異片段擴增引物對中序列表中序列2所示的單鏈DNA分子的5'末端標記生物 素； 所述23S rRNA基因突變位點為23S rRNA基因的第2075位堿基，所述23S rRNA基因 的第2075位堿基為突變堿基G或野生型堿基A ; 所述彎曲菌為空腸彎曲菌或結腸彎曲菌。
4. 檢測或輔助檢測彎曲菌23S rRNA基因突變位點的PCR試劑或PCR試劑盒： 所述PCR試劑，由PCR試劑A和PCR試劑B組成；所述PCR試劑A由權利要求1-3中任 一所述的引物組中的特異片段擴增引物對、PCR擴增緩沖液A和水組成； 所述PCR試劑B由權利要求1-3中任一所述的引物組中的測序引物、PCR擴增緩沖液B 和水組成； 所述引物組中的特異片段擴增引物對中的各條引物在所述PCR試劑A中的終濃度均為 10ρΜ-1 μ M，所述引物組中的特異片段擴增引物對中的各條引物在所述PCR試劑A中的終濃 度均具體為10pM ; 所述PCR試劑盒，包括權利要求1-3中任一所述的引物組或所述PCR試劑； 所述23S rRNA基因突變位點為23S rRNA基因的第2075位堿基，所述23S rRNA基因 的第2075位堿基為突變堿基G或野生型堿基A ; 所述彎曲菌為空腸彎曲菌或結腸彎曲菌。
5. 權利要求1-3中任一所述的引物組或權利要求4所述PCR試劑或試劑盒在制備檢測 和/或輔助檢測待測彎曲菌23S rRNA基因突變位點產品中的應用； 或權利要求1-3中任一所述的引物組或權利要求4所述PCR試劑或試劑盒在制備檢測 和/或輔助檢測待測彎曲菌耐藥性中的應用； 所述23S rRNA基因突變位點具體為23S rRNA基因的第2075位堿基，所述23S rRNA 基因的第2075位堿基具體為突變堿基G或野生型堿基A ;所述耐藥性具體為耐紅霉素；所 述彎曲菌具體為空腸彎曲菌或結腸彎曲菌。
6. -種檢測待測彎曲菌23S rRNA基因突變位點的方法，包括如下步驟： 1)用權利要求1-3中任一所述的引物組或權利要求4所述PCR試劑或試劑盒中的所述 特異片段擴增引物對對待測彎曲菌進行PCR擴增，得到生物素標記的PCR產物； 2 )所述生物素標記的PCR產物和抗生物素蛋白的瓊脂糖凝膠磁珠震蕩混合，得到混合 產物；抓取所述混合產物中結合瓊脂糖磁珠的PCR產物，再進行變性，得到焦磷酸測序單鏈 模板； 3)將所述焦磷酸測序單鏈模板與測序引物在測序緩沖液中混勻，經80°C反應2min后 冷卻，使單鏈模板與測序引物結合，得到測序產物，實現(xiàn)檢測待測彎曲菌23SrRNA基因突變 位點； 所述23S rRNA基因突變位點為23S rRNA基因的第2075位堿基，所述23S rRNA基因 的第2075位堿基為突變堿基G或野生型堿基A。
7. -種檢測和/或輔助檢測待測彎曲菌是否耐紅霉素的方法，包括如下步驟： 1) 用權利要求6的方法對待測彎曲菌23S rRNA基因突變位點進行測序，得到測序產 物； 2) 檢測測序產物，若所述測序產物中23S rRNA基因的第2075位堿基為突變堿基G，則 所述待測彎曲菌為或候選為耐紅霉素；若所述測序產物中的23S rRNA基因的第2075位堿 基均為野生型堿基A，則所述待測彎曲菌不為或候選不為耐紅霉素。
8. -種檢測和/或輔助檢測待測彎曲菌是否耐紅霉素的方法，包括如下步驟： 1) 用權利要求6的方法對待測彎曲菌23S rRNA基因突變位點進行測序，得到測序產 物； 2) 若所述測序產物中的至少一個23S rRNA基因拷貝的第2075位堿基為突變堿基G， 則所述待測彎曲菌為或候選為耐紅霉素；若所述測序產物中的3個23S rRNA基因拷貝的第 2075位堿基均為野生型堿基A，則所述待測彎曲菌不為或候選不為耐紅霉素； 所述待測彎曲菌中含有3個23S rRNA基因拷貝。
9. 根據權利要求6或7或8所述的方法，其特征在于： 所述待測彎曲菌為空腸彎曲菌或結腸彎曲菌； 步驟1)中，所述PCR產物的模板為基因組DNA。
10. -種引物對，由序列表中序列1所示的單鏈DNA分子和序列表中序列2所示的單鏈 DNA分子組成。
【文檔編號】C12R1/01GK104232740SQ201310222703
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2013年6月6日 優(yōu)先權日:2013年6月6日
【發(fā)明者】吳聰明, 汪洋, 娜仁高娃, 沈建忠, 鄧鳳如 申請人:中國農業(yè)大學