ckmb在畢赤酵母中的表達(dá)和制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了ckmb在畢赤酵母中的表達(dá)和高效制備方法，其特征為，通過在畢赤酵母宿主細(xì)胞中進(jìn)行含m基因和b基因在同一載體中串聯(lián)表達(dá)的載體和工程菌的構(gòu)建、發(fā)酵、純化，制備重組CKmb。用該方法制備的ckmb可用于體外診斷試劑。
【專利說明】ckmb在畢赤酵母中的表達(dá)和制備

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明是屬于基因工程領(lǐng)域，涉及到利用重組基因工程技術(shù)在畢赤酵母中表達(dá)和 高效制備ckmb。

【背景技術(shù)】
[0002] 肌酸激酶（creatine kinase，EC2, 7, 3, 2,簡(jiǎn)稱CK)有3種同工酶，分別由B、Μ亞 基兩兩組合而成：CK-MM、CK-MB、CK-BB。ΜΜ型主要存在于各種肌肉細(xì)胞中，ΒΒ型主要存在 于腦細(xì)胞中，MB型主要存在于心肌細(xì)胞中。C Κ-Μ Β免疫化學(xué)檢測(cè)方法的建立具有重要意 義。CKMB是臨床上診斷急性心肌梗死和推定梗死面積的有效指標(biāo)物。
[0003] 生化提取CKMB原料來源受到限制。原核表達(dá)不能正確折疊，沒有糖基化修飾，沒 有活性；動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)生產(chǎn)成本太高。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明公開了 ckmb在畢赤酵母中的表達(dá)和高效制備方法，其特征為，通過在畢赤 酵母宿主細(xì)胞中進(jìn)行含m基因和b基因在同一載體中串聯(lián)表達(dá)的載體和工程菌的構(gòu)建、發(fā) 酵、純化，制備重組CKmb。本發(fā)明制備的CKmb成本低，質(zhì)量好，為ckmb在體外診斷試劑方面 的應(yīng)用提供了原料和質(zhì)控品。
[0005] m基因和b基因在同一載體中串聯(lián)表達(dá)載體構(gòu)建過程如附圖圖.1所示。
[0006] 以人肌肉cDNA文庫(kù)為模板per得到Μ基因，編碼ckb亞基的基因克隆到pPICZa 上的EcoRI和Notl之間，構(gòu)建以ΑΧΟΙ為啟動(dòng)子a因子為分泌信號(hào)的重組質(zhì)粒，命名為 pPICZ a A-ckbo
[0007] 以人腦cDNA文庫(kù)為模板pci*得到B基因，編碼ckb亞基的基因克隆到pPICZ a 上的EcoRI和Notl之間，構(gòu)建以ΑΧΟΙ為啟動(dòng)子a因子為分泌信號(hào)的重組質(zhì)粒，命名為 pPICZ a A_ckb。
[0008] 以BamHl和Bgl II雙切pPICZ a A-ckb，凝膠回收表達(dá)框，命名為AOXl-ckb ;將表 達(dá)框AOXl-ckb克隆到pPICZ a A-ckm的BamHl ;篩選ckm和ckb同一方向串聯(lián)表達(dá)的重組 質(zhì)粒，命名為pPICZ a A-ckm-ckb ;重組質(zhì)粒pPICZ a A-ckm-ckb轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115,用不 同濃度G418篩選出不同拷貝重組質(zhì)粒的畢赤酵母GS115,篩選出表達(dá)量最高的一株命名為 pPICZ a A-ckm-ckb。
[0009] 分離純化ckmb :濃縮，硫酸銨分級(jí)沉淀，phenyl疏水層析和Q離子交換，得到高純 度的ckmb。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0010] 圖l.m基因和b基因在同一載體中串聯(lián)表達(dá)載體構(gòu)建過程

【具體實(shí)施方式】
[0011] 實(shí)施例1編碼ckm亞基基因的克隆
[0012] 通過化學(xué)合成所需引物（上游引物：SEQ. ID No. 1 :5' -GGAATTCATGCATCATCATCAT CATCATCCATTCGGTAACACCCAC-3 下游引物：：5 ' -CATGCggccgcCTTCTGGGCGGGGATCAT-3)，以 人肌肉cDNA為模板，利用PCR獲得ckm基因 SEQ. ID No. 3。
[0013] 實(shí)施例2編碼ckb亞基基因的克隆
[0014] 通過化學(xué)合成所需引物（上游引物：SEQ. ID No. 4 :5^ -GGAATTCATGCATCATCATCAT CATCATCCCTTCTCCAACA GCCAC-3下游引物：SEQ. ID No. 5 :5，-CATGCggccgcTTTCTGGGCAGGCA TGAG)，以人腦cDNA為模板，利用PCR獲得ckb基因 SEQ. ID No. 6。
[0015] 實(shí)施例3ckm基因和ckb基因在同一載體中串聯(lián)表達(dá)載體和工程菌的構(gòu)建以BamHl 和Bgl II雙切pPICZaA-ckb，凝膠回收表達(dá)框，命名為AOXl-ckb ;
[0016] 將表達(dá)框 AOXl-ckb 克隆到 pPICZ a A-ckm 的 BamHl ;
[0017] 篩選ckm和ckb同一方向串聯(lián)表達(dá)的重組質(zhì)粒，命名為pPICZ a A-ckm_ckb ;
[0018] 重組質(zhì)粒pPICZ a A-ckm-ckb轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115,用不同濃度G418篩選出不同拷 貝重組質(zhì)粒的畢赤酵母GS115,篩選出表達(dá)量最高的一株命名為pPICZaA-ckm-ckb。
[0019] 搖瓶中表達(dá)量達(dá)到5mg/L，上罐發(fā)酵表達(dá)達(dá)到225mg/L。
[0020] 實(shí)施例4ckmb分離純化
[0021] 濃縮，硫酸銨分級(jí)沉淀，phenyl疏水層析和Q離子交換，得到高純度的ckmb。結(jié)果 SDS-PAGE純度大于95%
[0022] 實(shí)施例5ckmb活性測(cè)定
[0023] 利用elisa檢測(cè)來測(cè)定免疫活性。
[0024] 1.包被：用0. 05M PH9,碳酸鹽包被緩沖液將抗體稀釋至蛋白質(zhì)含量為1?10 μ g/ ml，在每個(gè)聚苯乙烯板的反應(yīng)孔中加0. lml，4°C過夜。次日，棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液洗 3次，每次3分鐘。
[0025] 2.加樣：加一定稀釋的待檢樣品0. lml于上述已包被之反應(yīng)孔中，置37°C孵育1 小時(shí)。然后洗滌。（同時(shí)做空白孔，陰性對(duì)照孔及陽(yáng)性對(duì)照孔）。
[0026] 3.加酶標(biāo)抗體：于各反應(yīng)孔中，加入新鮮稀釋的酶標(biāo)抗體（經(jīng)滴定后的稀釋 度）0· lml，37°C孵育0.5?1小時(shí)，洗滌。
[0027] 4.加底物液顯色：于各反應(yīng)孔中加入臨時(shí)配制的TMB (四甲基聯(lián)苯胺）底物溶液 0· lml，37 °C 10 ?30 分鐘。
[0028] 5.終止反應(yīng)：于各反應(yīng)孔中加入2M硫酸0. 05ml。
[0029] 6.結(jié)果判定：可于白色背景上，直接用肉眼觀察結(jié)果：反應(yīng)孔內(nèi)顏色越深，陽(yáng)性程 度越強(qiáng)，陰性反應(yīng)為無(wú)色或極淺，依據(jù)所呈顏色的深淺，以" + 號(hào)表示。也可測(cè)0D值： 在ELISA檢測(cè)儀上，于450nm(若以ABTS顯色劑，于410nm)處，以空白對(duì)照孔調(diào)零后測(cè)各孔 0D值，若大于規(guī)定的陰性對(duì)照0D值的2. 1倍，即為陽(yáng)性。
[0030] 結(jié)果，本方法制備的ckmb呈陽(yáng)性。
[0031] 實(shí)施例5ckmb在體外診斷試劑方面的應(yīng)用
[0032] 本發(fā)明制備的ckmb免疫小鼠，抗體滴度與天然提取的Ckmb的一樣?？捎糜谠\斷 試劑的質(zhì)控對(duì)照。
【權(quán)利要求】
1. m基因和b基因在同一載體中串聯(lián)表達(dá)載體和工程菌的構(gòu)建方法，包括如下步驟： 1) 編碼ckm亞基的基因克隆到pPICZa上的EcoRI和Notl之間，構(gòu)建以ΑΧΟΙ為啟動(dòng) 子a因子為分泌信號(hào)的重組質(zhì)粒，命名為pPICZaA-ckm; 2) 編碼ckb亞基的基因克隆到pPICZa上的EcoRI和Notl之間，構(gòu)建以ΑΧΟΙ為啟動(dòng) 子a因子為分泌信號(hào)的重組質(zhì)粒，命名為pPICZa A-ckb; 3) 以BamHl和Bgl II雙切？？扣2〇六-〇吐，凝膠回收表達(dá)框，命名為六(《1-〇1*; 4) 將表達(dá)框 AOXl-ckb 克隆到 pPICZ a A-ckm 的 BamHl ; 5) 篩選ckm和ckb同一方向串聯(lián)表達(dá)的重組質(zhì)粒，命名為pPICZ a A-ckm-ckb ; 6) 重組質(zhì)粒pPICZ a A-ckm-ckb轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115,用不同濃度G418篩選出不同拷 貝重組質(zhì)粒的畢赤酵母GS115，篩選出表達(dá)量最高的一株命名為pPICZ a A-ckm-ckb。 2. ckmb在畢赤酵母中的表達(dá)和高效制備方法，其步驟包括： 構(gòu)建含有權(quán)利要求1的表達(dá)載體和工程菌；培養(yǎng)含有表達(dá)載體的工程菌，誘導(dǎo)表達(dá)和 分離純化ckmb。
3. 按照權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述ckmb的分離純化包括以下步驟： 濃縮，硫酸銨分級(jí)沉淀，phenyl疏水層析和Q離子交換。
4. 按照權(quán)利要求2、3所制備的ckmb在體外診斷試劑方面的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N15/81GK104232678SQ201310223513
【公開日】2014年12月24日 申請(qǐng)日期:2013年6月6日 優(yōu)先權(quán)日:2013年6月6日
【發(fā)明者】羅朝領(lǐng), 肖建國(guó), 茅柳娟, 馬麗, 王連會(huì), 王亮, 王微微 申請(qǐng)人:上海凱璟生物科技有限公司