一種利用枯草芽孢桿菌生產(chǎn)紅色素的方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵領(lǐng)域，涉及利用枯草芽孢桿菌液體發(fā)酵制備紅色素的工藝方法以及紅色素粗產(chǎn)品的純化精制技術(shù)。本發(fā)明所用菌株為枯草芽孢桿菌(Bacillus?subtilis)HJ，保藏編號(hào)為CGMCC?No.5701。本發(fā)明提供的發(fā)酵生產(chǎn)紅色素的方法，包括如下步驟：（1）種子液的制備：將菌種枯草芽孢桿菌CGMCC?No.5701活化培養(yǎng)后獲得種子液；（2）將種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵，所述發(fā)酵為搖瓶發(fā)酵或深層液體通風(fēng)發(fā)酵；（3）提取枯草芽孢桿菌發(fā)酵液中的紅色素。通過(guò)搖瓶發(fā)酵方法紅獲得的紅色素產(chǎn)量達(dá)到1.8g/L以上。通過(guò)深層液體通風(fēng)發(fā)酵方法獲得的紅色素產(chǎn)量為2.4g/L。
【專利說(shuō)明】一種利用枯草芽孢桿菌生產(chǎn)紅色素的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】:
[0001]本發(fā)明涉及微生物發(fā)酵領(lǐng)域，具體涉及利用枯草孢桿菌液體發(fā)酵制備紅色素的工藝方法以及紅色素粗產(chǎn)品的純化精制技術(shù)。
【背景技術(shù)】:
[0002]天然色素不僅可以作為食品添加劑，用于食品染色，其中一些色素還具有重要的生理保健功能，而且在化妝品行業(yè)、紡織、服裝、家紡行業(yè)都有廣泛的應(yīng)用。我國(guó)龐大的天然色素研發(fā)隊(duì)伍，使我國(guó)食品工業(yè)在改革開(kāi)放以來(lái)快速發(fā)展壯大。經(jīng)過(guò)多年的努力，我國(guó)的食用色素產(chǎn)業(yè)已然崛起，形成一定規(guī)模，成為未來(lái)食品工業(yè)中的一個(gè)不可缺少的行業(yè)。傳統(tǒng)以動(dòng)植物為原料生產(chǎn)天然色素具有諸多缺點(diǎn)，而利用微生物資源生產(chǎn)天然色素成本低、周期短、操作方便，且不受時(shí)間空間的限制，容易實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。所以采用微生物生產(chǎn)天然色素將逐漸成為天然色素來(lái)源的主流，并將為我國(guó)天然色素行業(yè)的發(fā)展提供豐富的原料。
[0003]紅色作為三原色之一，能與黃、藍(lán)兩色以不同比例調(diào)和出多種色彩，故此，紅色素有很高的附加值。目前常用的紅色素多集中于紅色植物，如紅辣椒；某些真菌，如紅曲霉菌，以及極少數(shù)細(xì)菌。傳統(tǒng)的以紅色植物為原料的提取方法原料需求量極大，且易造成浪費(fèi)。而目前已報(bào)道的用來(lái)生產(chǎn)紅色素的微生物多為真菌，例如:紅曲霉菌，但真菌受到生長(zhǎng)條件，和時(shí)間的限制，對(duì)此，研究人員探索一種利用細(xì)菌(如枯草芽孢桿菌)生產(chǎn)紅色素的生產(chǎn)工藝，在其液體發(fā)酵及其發(fā)酵條件優(yōu)化和發(fā)酵產(chǎn)物提取精制等方面進(jìn)行研究，為天然紅色素的開(kāi)發(fā)提供一種簡(jiǎn)便可行的生產(chǎn)方法和提純方法?？莶菅挎邨U菌已被用來(lái)生產(chǎn)功能性食品和飼用微生態(tài)制劑，是食品、飼料中允許使用的微生物，具有極高的安全性，是一種潛在的益生菌。

【發(fā)明內(nèi)容】
:
[0004]本發(fā)明的目的在于提供`一種利用枯草芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)紅色素的方法。
[0005]本發(fā)明技術(shù)方案如下:
[0006]本發(fā)明所用菌株為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)HJ，保藏編號(hào)為CGMCCN0.5701。保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址:北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，郵編100101，保藏日期:2012年I月9日。
[0007]本發(fā)明提供的發(fā)酵生產(chǎn)紅色素的方法，包括如下步驟:(I)種子液的制備:將菌種枯草芽孢桿菌CGMCC N0.5701活化培養(yǎng)后獲得種子液；(2)將種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵，所述發(fā)酵為搖瓶發(fā)酵或深層液體通風(fēng)發(fā)酵；(3)提取枯草芽孢桿菌發(fā)酵液中的紅色素。
[0008]所述搖瓶發(fā)酵的方法如下:
[0009]將種子液以2-10%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基，250ml三角瓶裝液量為30_60ml，三角瓶塞采用乳膠塞，培養(yǎng)溫度30-35°C，轉(zhuǎn)速160-180r/min搖床培養(yǎng)12_15h，而后于24-29 °C恒溫箱靜置培養(yǎng)106h。[0010]所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成:麥芽糖0.3-0.8g、麩皮浸出液10ml，可溶性淀粉
0.4-0.7g、葡萄糖 0.6-1.2g、硫酸銨 0.3g、蛋白胨 lg、牛肉膏 0.5g、NaCl0.5g、KH2PO40.lg、MgSO4.7Η200.04g、蒸餾水 IOOmL, ρΗ7.5-8.0,121。。，滅菌 20min。
[0011]所述種子培養(yǎng)基組成:蛋白胨lg、牛肉膏0.5g、酵母粉0.5g、NaCl0.5g、K2HPO40.02g、H2OlOOmL, ρΗ6.8-7.2，121。。滅菌 20min。
[0012]通過(guò)搖瓶發(fā)酵方法紅獲得的紅色素產(chǎn)量達(dá)到1.8g/L以上。
[0013]所述深層液體通風(fēng)發(fā)酵的方法如下:
[0014]紅色素的氣升式發(fā)酵:將氣升式反應(yīng)器裝入IOL液體發(fā)酵培養(yǎng)基，通過(guò)發(fā)酵罐夾套升溫到95°C時(shí)，改為將蒸汽直接通入到液體培養(yǎng)基中，121°C滅菌30min，然后將溫度逐漸降至32-35°C，將種子液以3-8%的接種量接入培養(yǎng)基中，初始發(fā)酵12-15h，發(fā)酵控制條件為:35-37°C, ρΗ7.5-8.0，通氣量為0.6vvm ;發(fā)酵12_15h后將發(fā)酵溫度調(diào)為25_26°C，通氣量調(diào)節(jié)至0.3vmm, pH調(diào)節(jié)至8.0 ;發(fā)酵72h,補(bǔ)加濃度lg/L的葡萄糖500ml。
[0015]氣升式通風(fēng)發(fā)酵培養(yǎng)基組成:麥芽糖0.5g、可溶性淀粉0.5-0.7g、葡萄糖
0.7-lg、硫酸銨 0.3g、硝酸銨 0.2g，蛋白胨 0.4-lg、牛肉膏 0.5g、NaCl0.5g、KH2PO40.lg、MgSO4.7Η200.04g、蒸餾水 IOOmL, ρΗ8.0,121。。，滅菌 20min。
[0016]通過(guò)深層液體通風(fēng)發(fā)酵方法獲得的紅色素產(chǎn)量為2.4g/L。
[0017]發(fā)酵液中紅色素的提取:
[0018]所述搖瓶發(fā)酵或深層液體通風(fēng)發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵液lOOOOr/min離心lOmin，洗滌沉淀得菌體，用80%的pH4.5的`酸性乙醇作為溶劑，然后用300W超聲細(xì)胞破碎儀，破碎溫度35°C，超聲時(shí)間為30min ;然后將破碎液在37°C下震蕩抽提40min，10000r/min離心5min，超聲振蕩處理后得紅色素溶液；接著采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀真空濃縮，溫度控制為55-65°C，當(dāng)濃縮至色素溶液粘稠時(shí)，取出色素濃縮液，-20°C冷凍過(guò)夜，然后將結(jié)冰的色素置于真空冷凍干燥機(jī)中，控制真空度為30-50Pa，溫度為-35°C，冷凍時(shí)間15_18h ;取出即為干燥好的紅色素制品。
[0019]本發(fā)明所產(chǎn)紅色素的特性:
[0020]該色素易溶于甲醇，乙醇，酸性乙醇，異丙醇，正丁醇，乙酸等有機(jī)溶劑，色素溶液的最大吸收波長(zhǎng)為535nm ;該紅色素的酸堿穩(wěn)定性及耐熱性較好；該色素在避光、室內(nèi)散射光和室外自然光照射下具有良好的光穩(wěn)定性，但紫外光對(duì)其光穩(wěn)定性有一定的影響；該色素對(duì)Na+、K+的穩(wěn)定性較好；Ca2+對(duì)其具有明顯的消色作用；Mn2+對(duì)其具有明顯的增色作用，并且持續(xù)增色；Mg2+、Fe2+、Fe3+、Cu2+均可以使色素溶液產(chǎn)生沉淀或結(jié)晶，并且Fe3+對(duì)色素色澤影響最大。氧化劑對(duì)色素的影響較小，但還原劑對(duì)紅色素影響顯著。食品中常用的防腐劑苯甲酸鈉和山梨酸鉀對(duì)紅色素穩(wěn)定性幾乎沒(méi)有影響。小鼠經(jīng)口急性毒性試驗(yàn)顯示，在最大劑量范圍內(nèi)未產(chǎn)生毒副作用，且無(wú)劑量反應(yīng)關(guān)系，本發(fā)明紅色素屬于無(wú)毒級(jí)，是一種安全性較高的天然色素，因此具有較大的開(kāi)發(fā)利用價(jià)值，可以應(yīng)用于食品等工業(yè)。
[0021]有益效果:
[0022](I)本發(fā)明提供一種以枯草芽孢桿菌為生產(chǎn)菌的紅色素液體發(fā)酵方法，操作簡(jiǎn)便，重現(xiàn)性好，發(fā)酵后期采用靜置方式，節(jié)省人力資源，減小能耗，且紅色素產(chǎn)量較高，達(dá)到2.4g/L。
[0023](2)本發(fā)明提供一種從枯草芽孢桿菌紅色素發(fā)酵液中提取純化紅色素的方法，能夠較快速地純化出該色素，色素回收率85%,色素純度在95%以上。
[0024](3)本發(fā)明制備得到的紅色素屬于純天然色素產(chǎn)品，沒(méi)有人工化學(xué)合成色素的潛在危害性，不會(huì)對(duì)環(huán)境造成污染。小鼠經(jīng)口急性毒性試驗(yàn)證明，對(duì)動(dòng)物體不會(huì)產(chǎn)生任何毒副作用，可以在食品工業(yè)、化妝品工業(yè)、醫(yī)藥、生物試劑、防治中廣泛應(yīng)用。
[0025](4)本發(fā)明篩選到的菌株遺傳穩(wěn)定性好。連續(xù)傳代10代以上，紅色素的合成能力基本不變。[0026](5)本發(fā)明所述產(chǎn)紅色素菌株培養(yǎng)周期短，發(fā)酵速度快，色素產(chǎn)量高，成本低，所產(chǎn)色素穩(wěn)定性強(qiáng)、顏色鮮艷，對(duì)發(fā)酵設(shè)備要求低，無(wú)需大型發(fā)酵設(shè)備，節(jié)省大量動(dòng)力和人工費(fèi)用，具有工業(yè)化開(kāi)發(fā)價(jià)值。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】:
[0027]圖1菌株HJ固體平板菌落
[0028]圖2菌株HJ液體發(fā)酵情況
[0029]圖3紅色素的洗脫曲線
[0030]圖4紅色素的吸收光譜
[0031]圖5溫度對(duì)色素穩(wěn)定性的影響
[0032]圖6光照對(duì)色素穩(wěn)定性的影響
【具體實(shí)施方式】:
[0033]下面通過(guò)具體的實(shí)施方案敘述本發(fā)明。除非特別說(shuō)明，本發(fā)明中所用的技術(shù)手段均為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的方法。另外，實(shí)施方案應(yīng)理解為說(shuō)明性的，而非限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的實(shí)質(zhì)和范圍僅由權(quán)利要求書(shū)所限定。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，在不背離本發(fā)明實(shí)質(zhì)和范圍的前提下，對(duì)這些實(shí)施方案中的物料成分和用量進(jìn)行的各種改變或改動(dòng)也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0034]實(shí)施例1:高產(chǎn)紅色素菌株的篩選
[0035](I)富集培養(yǎng):
[0036]將Ig 土樣(采集于含腐殖質(zhì)豐富的上壤)加入裝有80ml無(wú)菌水的250ml三角瓶中，加入無(wú)菌玻璃珠，在150r/min搖床中振蕩20min。吸取3_4ml振蕩后的乳濁液，加入IOOml富集培養(yǎng)基中，置于35°C、轉(zhuǎn)速170r/min的恒溫?fù)u床中培養(yǎng)48h。富集培養(yǎng)基:麩皮浸出液 5ml、牛肉膏 0.3g，蛋白胨 lg, NaCl0.5g，K2HPO40.lg, MgSO4.7Η200.02g，H2095mL，ρΗ7.2，121°C 滅菌 20min。
[0037](2)初篩:
[0038]將富集后的培養(yǎng)液逐級(jí)稀釋到10_4、10_5、10_6，取0.2ml涂布于初篩固體培養(yǎng)基平板上，平板晾至表面沒(méi)有流動(dòng)液體時(shí)，在32-37°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30-36h，然后培養(yǎng)溫度降到24-32°C，繼續(xù)培養(yǎng)24-72h。挑取初篩平板上菌落或菌落周?chē)@示紅色的菌株進(jìn)行純化。
[0039]初篩固體培養(yǎng)基:牛肉膏0.3g，蛋白胨lg，NaCl0.5g，K2HPO40.lg,MgSO4.7Η200.02g, H2OlOOmL,瓊脂粉 1.6g, ρΗ7.2，121°C滅菌 20min。
[0040](3)純化:[0041]將初篩出來(lái)的菌株，于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板上劃線，置于37°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，重復(fù)劃線培養(yǎng)三次以上，如連續(xù)多次在顯微鏡下觀察到形態(tài)單一的菌體則認(rèn)為菌株已純化。本發(fā)明所述菌株如圖1所示。
[0042](4)復(fù)篩:
[0043]將初篩平板上菌落或菌落周?chē)@示紅色的菌株接種到種子培養(yǎng)基中，32_37°C恒溫震蕩搖床培養(yǎng)16-20h后，按照2-6%的接種量接種到復(fù)篩發(fā)酵培養(yǎng)基中，搖床震蕩培養(yǎng)。發(fā)酵條件為:250ml三角瓶，裝液量為30-60ml，初始12_18h，搖床震蕩頻率為160_220r/min，然后三角瓶繼續(xù)培養(yǎng)24-72h，發(fā)酵溫度24_32°C。選擇發(fā)酵培養(yǎng)后發(fā)酵液顏色紅色越深的對(duì)應(yīng)菌株低溫保藏。
[0044]麩皮浸出液的制備方法:5g麩皮加水在電爐上加熱，待沸騰后，改用小火熬煮，當(dāng)水少于80ml時(shí)，補(bǔ)充水至100ml，在沸水中煮沸30min，取其過(guò)濾液，定容至100ml。
[0045]種子培養(yǎng)基:蛋白胨lg、牛肉膏0.5g、酵母粉0.5g、NaCl0.5g、K2HPO40.5g、H2OlOOmL, ρΗ7.2，121°C 滅菌 20min。
[0046]復(fù)篩培養(yǎng)基:麩皮浸出液IOml,牛肉膏0.3g,葡萄糖0.5g,蛋白胨lg, NaCl0.5g,NH4NO30.02g, H2090mL,，ρΗ7.5，121°C滅菌 20min。
[0047](5)菌種保藏:
[0048]將篩選到的菌種在牛肉膏蛋白胨上劃線，分離到單菌落后在LB斜面培養(yǎng)基上劃線，37 °C培養(yǎng)3天，置于4度冰箱內(nèi)保存。
[0049]斜面培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖10，蛋白胨10，NaC15，瓊脂15，pH值7.2-7.4，121 °C滅菌20min。
[0050]實(shí)施例2:高產(chǎn)紅色素菌株HJ形態(tài)特征及生理生化特征
[0051 ] 本發(fā)明所述菌株，牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板培養(yǎng)18h后，觀察菌落形態(tài)，表面較粗糙，邊緣不整齊，菌落顏色為淡紅色，革蘭氏染色呈陽(yáng)性。菌體的形態(tài)為短桿棒狀。菌體大小為0.65 μ mX 2.7 μ m,可形成內(nèi)生芽孢，菌體具有運(yùn)動(dòng)性；纖維素分解實(shí)驗(yàn)呈陰性；在糖類發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中，該菌株可利用可溶性淀粉、葡萄糖、麥芽糖和蔗糖做唯一性碳源生長(zhǎng)；在其他生理生化檢測(cè)中，該菌株接觸酶、VP測(cè)定呈陽(yáng)性，能水解淀粉，液化明膠，能利用檸檬酸鹽，不產(chǎn)生熒光色素，甲基紅實(shí)驗(yàn)呈陽(yáng)性。菌株HJ具體的形態(tài)學(xué)及生理生化特征見(jiàn)表I。菌落、染色特征和生理生化特征與《伯杰細(xì)菌鑒手冊(cè)》(第八版)中的枯草芽孢桿菌比較接近，初步確定菌株HJ為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)。
[0052]表I菌株HJ形態(tài)學(xué)及生理生化特性
[0053]
【權(quán)利要求】
1.一種利用枯草芽孢桿菌生產(chǎn)紅色素的方法，其特征在于，包括如下步驟:(1)種子液的制備:將菌種枯草芽孢桿菌CGMCC N0.5701活化培養(yǎng)后獲得種子液；(2)將種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵，所述發(fā)酵為搖瓶發(fā)酵或深層液體通風(fēng)發(fā)酵；(3)枯草芽孢桿菌發(fā)酵液中紅色素的提取。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用枯草芽孢桿菌生產(chǎn)紅色素的方法，其特征在于，所述搖瓶發(fā)酵的方法包括以下步驟:將種子液以2-10%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基，250ml三角瓶裝液量為30-60ml，三角瓶塞采用乳膠塞，培養(yǎng)溫度30-35°C，轉(zhuǎn)速160_180r/min搖床培養(yǎng)12_15h,而后于24-29°C恒溫箱靜置培養(yǎng)106h。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種利用枯草芽孢桿菌生產(chǎn)紅色素的方法，其特征在于，所述搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基組成:麥芽糖0.3-0.Sg、麩皮浸出液10ml，可溶性淀粉0.4-0.7g、葡萄糖 0.6-1.2g、硫酸銨 0.3g、蛋白胨 lg、牛肉膏 0.5g、NaCl0.5g、KH2PO40.lg、MgSO4.7Η200.04g、蒸餾水 IOOmL, ρΗ7.5-8.0,121。。，滅菌 20min。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用枯草芽孢桿菌生產(chǎn)紅色素的方法，其特征在于，所述深層液體通風(fēng)發(fā)酵的方法包括以下步驟:紅色素的氣升式發(fā)酵:將氣升式反應(yīng)器裝入IOL液體發(fā)酵培養(yǎng)基，通過(guò)發(fā)酵罐夾套升溫到95°C時(shí)，改為將蒸汽直接通入到液體培養(yǎng)基中，121°C滅菌30min，然后將溫度逐漸降至32_35°C，將種子液以3_8 %的接種量接入培養(yǎng)基中，初始發(fā)酵12-15h ，發(fā)酵控制條件為35-37°C，pH7.5-8.0,通氣量為0.6vvm ;發(fā)酵12-15h后將發(fā)酵溫度調(diào)為25-26°C，通氣量調(diào)節(jié)至0.3vmm, pH調(diào)節(jié)至8.0 ;發(fā)酵72h，補(bǔ)加濃度lg/L的葡萄糖500ml。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或4所述的一種利用枯草芽孢桿菌生產(chǎn)紅色素的方法，其特征在于，所述氣升式通風(fēng)發(fā)酵培養(yǎng)基組成:麥芽糖0.5g、可溶性淀粉0.5-0.7g、葡萄糖0.7-lg、硫酸銨 0.3g、硝酸銨 0.2g，蛋白胨 0.4-lg、牛肉膏 0.5g、NaCl0.5g、KH2PO40.lg、MgSO4.7Η200.04g、蒸餾水 IOOmL, ρΗ8.0,121。。，滅菌 20min。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用枯草芽孢桿菌生產(chǎn)紅色素的方法，其特征在于，所述發(fā)酵液中紅色素的提取方法包括以下步驟:發(fā)酵液lOOOOr/min離心lOmin，洗滌沉淀得菌體，用80%的pH4.5的酸性乙醇作為溶劑，然后用300W超聲細(xì)胞破碎儀，破碎溫度35°C，超聲時(shí)間為30min ;然后將破碎液在37°C下震蕩抽提40min，10000r/min離心5min，超聲振蕩處理后得紅色素溶液；接著采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀真空濃縮，溫度控制為55-65°C，當(dāng)濃縮至色素溶液粘稠時(shí)，取出色素濃縮液，-20°C冷凍過(guò)夜，然后將結(jié)冰的色素置于真空冷凍干燥機(jī)中，控制真空度為30-50Pa，溫度為-35°C，冷凍時(shí)間15_18h ;取出即為干燥好的紅色素制品O
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用枯草芽孢桿菌生產(chǎn)紅色素的方法，其特征在于，所述種子液的制備所用培養(yǎng)基組成:蛋白胨lg、牛肉膏0.5g、酵母粉0.5g、NaCl0.5g、K2HPO40.02g、加蒸餾水至 100ml, ρΗ6.8-7.2，121。。，滅菌 20min。
【文檔編號(hào)】C12R1/125GK103451235SQ201310225157
【公開(kāi)日】2013年12月18日 申請(qǐng)日期:2013年6月6日 優(yōu)先權(quán)日:2013年6月6日
【發(fā)明者】高兆建, 杜永凱, 唐仕榮, 張建萍, 陳尚龍, 王東星, 張從省, 周剛 申請(qǐng)人:徐州工程學(xué)院