溶酪大球菌及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了溶酪大球菌及其篩選方法和應(yīng)用，該溶酪大球菌為溶酪大球菌T17，其在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏編號為CGMCC?No.7623。溶酪大球菌T17能在含有鳥氨酸的普通營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中發(fā)酵產(chǎn)生大量的腐胺，并因此可以利用該菌發(fā)酵后從發(fā)酵液上清中分離純化得到腐胺。
【專利說明】溶酪大球菌及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于微生物領(lǐng)域，具體涉及一株溶酪大球菌，以及溶酪大球菌的制備方法和應(yīng)用技術(shù)。
【背景技術(shù)】
[0002]腐胺(putrescine)是一種有機化合物，常溫下為無色晶體或無色至微黃色液體。腐胺的分子式為NH2 (CH2) 4NH2,也被命名為I，4- 丁二胺、I，4- 二氨基丁烷、四亞甲基二胺或腐肉堿。腐胺是工業(yè)上生產(chǎn)尼龍-46、尼龍-6及尼龍-66的原料，尤其是尼龍-46廣泛用于汽車、摩托的零部件材料，而尼龍-66是電子產(chǎn)品的生產(chǎn)原料，酸性氣體吸收劑。目前腐胺的制備方法主要有(I)由氰化氫與丙烯腈反應(yīng)生成的丁二腈氫化而進行規(guī)?；a(chǎn)；(2)在碳酸鈉的作用下，由吡咯與鹽酸羥胺反應(yīng)得到丁二肟，再在鈉汞齊作用下，經(jīng)無水乙醇加熱還原制備；(3)由2，5-二氨基戊酸加熱催化脫羧制備；(4)以精氨酸脫羧、脫胍制備。由此可見，目前腐胺的生產(chǎn)方式主要以化學(xué)合成為主，能量消耗大，對環(huán)境也有污染。我國腐胺需求量較大，但國內(nèi)企業(yè)生產(chǎn)能力和產(chǎn)品質(zhì)量有限，從國外進口價格也很高，因此需要尋求高純度腐胺的制備方法，以降低生產(chǎn)成本，減少對環(huán)境的污染。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的是提供溶酪大球菌，并通過該菌的代謝特性發(fā)酵生產(chǎn)腐胺，獲得高濃度的腐胺發(fā)酵液。
[0004]本發(fā)明溶酪大球T17菌于2013年5月16日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，保藏號為=CGMCC N0.7623，分類命名:溶酪大球菌 Macrococcus caseolyticus。
[0005]本發(fā)明另一目的 是提供以上溶酪大球T17的篩選方法。
[0006]本發(fā)明采用普通營養(yǎng)肉湯瓊脂從市售制熟的鹽水鴨產(chǎn)品中分離得到。
[0007]在普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基37 °C中菌落是乳白色，隆起，革蘭氏染色陽性，普通顯微鏡下是球狀。
[0008]本發(fā)明容易分離提取，可以降低生產(chǎn)成本，減少化學(xué)合成造成的環(huán)境污染，使用該微生物發(fā)酵生產(chǎn)腐胺，發(fā)酵液中腐胺含量較高。
[0009]本發(fā)明再一目的是提出以上溶酪大球T17在生產(chǎn)高濃度腐胺方面的應(yīng)用。
[0010]本發(fā)明是以溶酪大球菌T17為生產(chǎn)菌株，接種保存好的純菌接種至普通營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基中，待菌株生長到對數(shù)生長期(0D值為0.6左右);將該活化好的菌液按照1%的接種量接種到改良的普通營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，37°C 220rpm振蕩培養(yǎng)4_6天；將培養(yǎng)后的菌體發(fā)酵液IOOOOrpm離心5min，此時的上清液即含有高濃度的腐胺，腐胺的含量在每升發(fā)酵液500mg以上。
[0011]本發(fā)明直接以鳥氨酸為前體，通過一些特定的具有鳥氨酸脫羧酶活性的微生物的作用，可以獲得高濃度的腐胺，然后從發(fā)酵液上清中分離腐胺，可以減少化學(xué)合成的污染，降低生產(chǎn)成本。由于本發(fā)明溶酪大球菌是從食品中分離獲得，并且也是傳統(tǒng)發(fā)酵肉制品中的一種菌，因此從該類菌中篩選到能產(chǎn)腐胺的菌株T17，該類菌不攜帶致病基因，發(fā)酵后的菌體也容易滅菌處理，使用該菌來發(fā)酵生產(chǎn)腐胺會比別的微生物發(fā)酵更為安全，不會造成有毒微生物和致病基因危害。
[0012]本發(fā)明所述的改良普通營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基的成分是在普通營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中添加質(zhì)量百分比分別占1%和0.005%的L-鳥氨酸、磷酸吡哆醛。
【專利附圖】

【附圖說明】[0013]圖1為七種生物胺標(biāo)樣的分離效果圖
圖2為以鳥氨酸為底物時，溶酪大球菌T17 (CGMCC N0.7623)的發(fā)酵上清液的高效液相圖。
[0014]圖3為溶酪大球菌T17的鳥氨酸脫羧酶基因序列和氨基酸序列。
【具體實施方式】
[0015]一、溶酪大球菌T17的篩選和鑒定:
1、準確稱取色胺、2-苯乙胺、腐胺、尸胺、組胺、酪胺、亞精胺和精胺的標(biāo)準品各50mg，用0.4mol/L的高氯酸(HClO4)定容到50mL,配成lmg/mL儲備液備用。
[0016]分別取以上標(biāo)準品儲備液，用0.4mol/L HClO4配制成質(zhì)量濃度分別為2.5lμg/mL、
5.0Pg/mLU0.0lμg/mL、25.0lμg/mL、50μg/mL、lOOlμg/mL 的混合標(biāo)準溶液，鋁箔避光、4°C冰箱保存?zhèn)溆谩?br> [0017]2、無菌條件下從每只制熟的鹽水鴨中分別取5g鴨脖和鴨翅肉、15g鴨胸肉、IOg鴨腿肉及IOg鴨背肉，共40克混合搗碎，每只鹽水鴨的鴨肉作為一個試驗樣品。
[0018]無菌條件下取25g各樣品分別加入225mL滅菌生理鹽水(含lg/L蛋白胨、9g/LNaCl)搖床振搖30min。然后取ImL上清液依次進行10倍梯度稀釋，選擇合適的稀釋度涂布于普通營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，于37°C下培養(yǎng)48h，挑選特征性菌落進一步地進行劃線分離，然后將純化好的菌落接種到普通營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)中，37 V 220rpm振蕩培養(yǎng)12h。
[0019]3、稱取0.1gL-鳥氨酸鹽酸鹽，加入到IOOmL普通營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中滅菌。將上述培養(yǎng)好的菌株發(fā)酵液按照1%接種量接種到含有氨基酸的普通營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基中，220rpm振蕩培養(yǎng)4-6天。
[0020]4、將步驟3獲得的發(fā)酵液低溫下IOOOOrpm離心5min,取上清500ML(不能帶菌體)以及混合后的生物胺標(biāo)準品加入到IOmL離心管中，依次加入500ML 0.25mol/L的Na2HPO4,50ML 4mol/L的NaOH，ImL 2.5mg/L的丹磺酰氯溶液，在離心管外邊包上錫箔紙避光，放入到55°C水浴鍋中避光衍生lh，然后將樣品置于4°C避光保存。
[0021]5.先將 G60 硅膠板(5cm*10cm)在 105°C下活化 lh。
[0022]展開劑由體積比為8: I: 2的氯仿、乙醚和三乙胺組成。
[0023]將25mL展開劑倒入展開缸中預(yù)飽和0.5h。使用自動點樣臺點樣，上樣量為2ML，間隔1.5cm，待樣點干燥后，置入展開槽內(nèi)，待展開劑擴展到距樣點17cm處取出，通風(fēng)廚內(nèi)干燥，在366nm紫外燈下觀察，然后使用自動凝膠成像分析拍照。通過和生物胺標(biāo)準品進行比對，確定各分離菌株是否產(chǎn)生腐胺，從而篩選到能夠產(chǎn)生腐胺的菌株T17。[0024]6、將T17菌株在普通營養(yǎng)肉湯固體培養(yǎng)基中，連續(xù)傳代培養(yǎng)，獲得純的單菌落，菌落是乳白色，隆起，革蘭氏染色陽性，普通顯微鏡下是小球狀。然后將該純菌落接種到滅菌后的5mL普通營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基中，37 0C 220rpm振蕩培養(yǎng)12h，利用細菌基因組提取試劑盒提取基因組DNA，通過PCR擴增獲得該菌株的16S rRNA基因片段，測序序列見表1，將測序后獲得的序列信息通過GENEBANK數(shù)據(jù)庫進行序列分析發(fā)現(xiàn)該菌為溶酪大球菌。
[0025]將該菌保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為:CGMCCN0.7623。
[0026]7、將培養(yǎng)12小時候的菌體培養(yǎng)液加入終濃度10%的滅菌甘油，_80°C保存。
[0027]表I溶酪大球菌T17的16SrRNA基因序列
【權(quán)利要求】
1.溶酪大球菌T17，其特征在于:其保藏號為=CGMCCN0.7623。
2.如權(quán)利要求1所述溶酪大球菌的篩選方法，其特征在于:從制熟的鹽水鴨中分離得至IJ，使用普通營養(yǎng)瓊脂進行培養(yǎng)。
3.—種如權(quán)利要求1所述的溶酪大球菌在生產(chǎn)高濃度腐胺的應(yīng)用，其特征在于:以所述的溶酪大球菌T17為生產(chǎn)菌株，接種保存好的純菌接種至普通營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基中，待菌株生長到對數(shù)生長期后；將該活化好的菌液按照1%的接種量接種到改良的普通營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，37°C 220rpm振蕩培養(yǎng)4-6天；將培養(yǎng)后的菌體發(fā)酵液IOOOOrpm離心5min，取上清液，即為腐胺的含量在每升發(fā)酵液500mg以上的高濃度的腐胺。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的溶酪大球菌在生產(chǎn)高濃度腐胺的應(yīng)用，其特征在于:所述的改良普通營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基的成分是在普通營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中添加質(zhì)量百分比分別占1%和.0.005%的L-鳥氨酸、 磷酸吡哆醛。
【文檔編號】C12N1/20GK103451123SQ201310227807
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2013年6月8日 優(yōu)先權(quán)日:2013年6月8日
【發(fā)明者】劉芳, 徐為民, 諸永志, 王道營, 耿志明, 張牧焓, 卞歡 申請人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院