一種大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)枯草芽孢桿菌抗菌脂肽的方法
【專利摘要】一種采用微生物發(fā)酵法大規(guī)模生產(chǎn)枯草芽孢桿菌抗菌脂肽的方法。利用微生物發(fā)酵法在20KL發(fā)酵罐內(nèi)實現(xiàn)大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)抗菌脂肽，其生產(chǎn)周期短，成本低，而且發(fā)酵得率高，有助于提高提取的收得率。
【專利說明】一種大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)枯草芽孢桿菌抗菌脂肽的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)枯草芽孢桿菌抗菌脂肽的方法，屬于微生物發(fā)酵【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]近年來我國食品安全問題愈發(fā)突出，其中很重要的一個原因就在于食品添加劑的濫用。目前世界食品工業(yè)中常用的防腐劑以化學(xué)合成防腐劑居多，根據(jù)我國《食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》GB2760的規(guī)定，目前許可使用的32種食品防腐劑中生物添加劑僅有2種，即乳鏈菌肽(Nisin)和放線菌納他霉素(Natamycin),其余均為化學(xué)合成防腐劑。由于化學(xué)防腐劑對人體不同程度存在毒性，其中一些甚至具有誘癌性和致畸性，因此在超標(biāo)使用的情況下會引起食物中毒，危害人類健康。美國國家衛(wèi)生基金會和國家癌癥研究所新近公布的一份報告表明，在全世界每年罹患癌癥的500萬人中，有50%左右與食品污染有關(guān)，而其中有30%左右受害于食品中的化學(xué)防腐劑。因此，研究開發(fā)具有重要食品工業(yè)用途的新型、高效、廣譜和安全的生物防腐劑已經(jīng)成為食品工業(yè)健康持續(xù)發(fā)展的當(dāng)務(wù)之急。
[0003]雖然國內(nèi)外對不同來源的微生物天然防腐劑研究很多，現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)細(xì)菌、放線菌、酵母菌和霉菌在生長繁殖過程中都能產(chǎn)生抗菌物質(zhì)，但是在食品工業(yè)中實際應(yīng)用還很少。這主要是因為天然防腐劑抑菌譜窄，如乳鏈菌肽(Nisin)抑菌效果不夠理想，納他霉素(Natamycin)只能抗真菌與酵母。因此，拓寬天然防腐劑的抑菌譜及提高抑菌效果，增進其抑菌穩(wěn)定性和適用范圍，降低生產(chǎn)成本并提高產(chǎn)量是當(dāng)今天然食品防腐劑發(fā)展的關(guān)鍵所在。
[0004]抗菌脂肽也可稱為脂肽抗生素，是一種由脂肪酸鏈和肽鏈組成的兩性分子，其一端由多個氨基酸組成的肽鏈形成親水基，另一端由脂肪烴鏈形成親油基。其特殊的化學(xué)結(jié)構(gòu)賦予其表面活性，以及抗病原真菌和細(xì)菌等作用。脂肽抗生素作為防腐劑具有天然、高效及低毒的優(yōu)勢，在食品、化`妝品、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。
[0005]抗菌脂肽在生物體內(nèi)天然含量極少，天然資源十分有限，提取效率非常低。而采用化學(xué)合成法生產(chǎn)成本很高，價格昂貴，批量生產(chǎn)困難。如何以較低的生產(chǎn)成本實現(xiàn)大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)抗菌脂肽成為一個亟待解決的問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]發(fā)明目的:本發(fā)明的目的是提供一種采用微生物發(fā)酵法大規(guī)模生產(chǎn)枯草芽孢桿菌抗菌脂肽的方法。利用微生物發(fā)酵法在20KL發(fā)酵罐內(nèi)實現(xiàn)大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)抗菌脂肽，其生產(chǎn)周期短，成本低，而且發(fā)酵得率高，有助于提高提取的收得率。
[0007]技術(shù)方案:一種大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)枯草芽孢桿菌抗菌脂肽的方法，所述方法包括以下步驟:
a)以種子發(fā)酵罐進行菌種擴大培養(yǎng):
第一步制作種子培養(yǎng)基:以葡萄糖15g/L,酵母膏3g/L,胰蛋白胨3g/L, MgSO4 5g/L,調(diào)節(jié)pH6.5，裝液系數(shù)65%;
第二步以枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis菌種fmbR按照體積比5%進行接種，37°C下培養(yǎng)10小時；
培養(yǎng)條件:種子培養(yǎng)過程中通風(fēng)量為1.3m3/min,攪拌轉(zhuǎn)速180rpm，罐壓
0.09-0.1lMPa ；
b)種子培養(yǎng)結(jié)束后，菌種按照體積百分比10%接入發(fā)酵罐內(nèi)，于37°C下培養(yǎng)36小時， 發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖30g/L，胰蛋白胨10g/L，牛肉膏0.5g/L，MgSO4 0.5g/L，Na2HPO4
0.5g/L, KH2PO4 0.5g/L, FeCl2 0.lmg/L, CaCO3 0.lmg/L，調(diào)節(jié) pH6.5，裝液系數(shù) 65% ；
發(fā)酵條件:發(fā)酵過程中通風(fēng)量為10m3/min,攪拌轉(zhuǎn)速120rpm,罐壓0.09-0.1 IMPa,流加消泡劑總量為0.05%發(fā)酵液體積；
c)發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵液經(jīng)過離心分離去除菌體，上清液中加入鹽酸調(diào)節(jié)pH至2.0，充分混勻后靜置24小時，然后過濾出絮凝物，用1.5倍初始發(fā)酵液體積的乙醇對得到的沉淀進一步處理，處理過程中調(diào)節(jié)pH至7.0，然后再進行干燥獲得粗品抗菌脂肽。
[0008]為了能夠?qū)崿F(xiàn)大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)枯草芽孢桿菌抗菌脂肽，發(fā)酵結(jié)束后檢測抗菌脂肽成分的質(zhì)量濃度平均達(dá)到7.4g/L以上。
[0009]為了最終保證生產(chǎn) 效率和粗品抗菌脂肽的品質(zhì)，所述步驟c中離心分離去除菌體采用碟片式離心機，轉(zhuǎn)速為8000rpm ;在上清液中加入的鹽酸濃度為6mol/L。
[0010]有益效果:實現(xiàn)了枯草芽孢桿菌抗菌脂肽的大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)，發(fā)酵得率可達(dá)到7.0g/L以上，生產(chǎn)周期短，成本相對較低，產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定。
【具體實施方式】
[0011]下面結(jié)合具體實例對本發(fā)明作進一步說明，但本發(fā)明并不僅限于以下實例。
[0012]實施例:
一種大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)枯草芽孢桿菌抗菌脂肽的方法，首先以公稱容積為2000L的種子發(fā)酵罐進行菌種擴大培養(yǎng)。
[0013]制作種子培養(yǎng)基:葡萄糖15g/L,酵母膏3g/L,胰蛋白胨3g/L, MgSO4 5g/L,調(diào)節(jié)初始PH值為6.5，發(fā)酵罐裝液系數(shù)65%，以南京農(nóng)業(yè)大學(xué)分離保藏的枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)菌種fmbR(保藏日期:2008年10月31日，保藏號=CICC 10366)，按照體積百分比5%進行接種，37°C下培養(yǎng)10小時，種子培養(yǎng)過程中通風(fēng)量為1.3m3/min，攪拌轉(zhuǎn)速180rpm，罐壓 0.09-0.1lMPa0
[0014]在2000L種子發(fā)酵罐內(nèi)培養(yǎng)好的菌種按照體積百分比10%接入公稱容積為20KL的生產(chǎn)發(fā)酵罐內(nèi)，于37°C下培養(yǎng)36小時，發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖30g/L，胰蛋白胨10g/L，牛肉膏 0.5g/L, MgSO4 0.5g/L, Na2HP04 0.5g/L, KH2PO4 0.5g/L, FeCl2 0.lmg/L, CaCO3 0.lmg/L,調(diào)節(jié)初始pH值為6.5，發(fā)酵罐裝液系數(shù)65%，發(fā)酵過程中通風(fēng)量為10m3/min，攪拌轉(zhuǎn)速120rpm，罐壓0.09-0.llMPa，流加消泡劑總量為0.05%發(fā)酵液體積。發(fā)酵結(jié)束后檢測抗菌脂肽成分的質(zhì)量濃度平均達(dá)到7.4g/L。
[0015]發(fā)酵液經(jīng)過碟片式離心機在8000rpm下離心分離去除菌體，在上清液中加入6mol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH至2.0，充分混勻后靜置24小時，用硅藻土過濾的方法過濾出絮凝物，用1.5倍初始發(fā)酵液體積的乙醇對得到的沉淀進一步處理，處理過程中調(diào)節(jié)pH至7.0，最后真空干燥 獲得粗品抗菌脂肽。
【權(quán)利要求】
1.一種大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)枯草芽孢桿菌抗菌脂肽的方法，其特征在于:所述方法包括以下步驟: a)以種子發(fā)酵罐進行菌種擴大培養(yǎng): 第一步制作種子培養(yǎng)基:以葡萄糖15g/L,酵母膏3g/L,胰蛋白胨3g/L,MgS04 5g/L,調(diào)節(jié)pH6.5，裝液系數(shù)65%; 第二步以枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis菌種fmbR按照體積比5%進行接種，37°C下培養(yǎng)10小時； 培養(yǎng)條件:種子培養(yǎng)過程中通風(fēng)量為1.3m3/min,攪拌轉(zhuǎn)速180rpm，罐壓0.09-0.1lMPa ； b)種子培養(yǎng)結(jié)束后，菌種按照體積百分比10%接入發(fā)酵罐內(nèi)，于37°C下培養(yǎng)36小時， 發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖30g/L，胰蛋白胨10g/L，牛肉膏0.5g/L，MgSO4 0.5g/L，Na2HPO40.5g/L, KH2PO4 0.5g/L, FeCl2 0.lmg/L, CaCO3 0.lmg/L，調(diào)節(jié) pH6.5，裝液系數(shù) 65% ； 發(fā)酵條件:發(fā)酵過程中通風(fēng)量為10m3/min,攪拌轉(zhuǎn)速120rpm,罐壓0.09-0.1 IMPa,流加消泡劑總量為0.05%發(fā)酵液體積； c)發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵液經(jīng)過離心分離去除菌體，上清液中加入鹽酸調(diào)節(jié)pH至2.0，充分混勻后靜置24小時，然后過濾出絮凝物，用1.5倍初始發(fā)酵液體積的乙醇對得到的沉淀進一步處理，處理過程中調(diào)節(jié)pH至7.0，然后再進行干燥獲得粗品抗菌脂肽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)枯草芽孢桿菌抗菌脂肽的方法，其特征在于:發(fā)酵結(jié)束后檢測抗菌脂肽成分的質(zhì)量濃度平均達(dá)到7.4g/L以上。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)枯草芽孢桿菌抗菌脂肽的方法，其特征在于:所述步驟c中離心分離去除菌 體采用碟片式離心機，轉(zhuǎn)速為SOOOrpm ;在上清液中加入的鹽酸濃度為6mol/L。
【文檔編號】C12P21/00GK103757075SQ201310230993
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2013年6月13日 優(yōu)先權(quán)日:2013年6月13日
【發(fā)明者】章金元, 陳德全, 石建偉, 楊曉博 申請人:江蘇海華生物科技有限公司, 鎮(zhèn)江東方生物工程設(shè)備技術(shù)有限責(zé)任公司