板栗疫病菌產(chǎn)孢基因Pro2及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種板栗疫病菌產(chǎn)孢基因Pro2及其應(yīng)用。該基因僅含有1個(gè)外顯子，DNA全長(zhǎng)1359bp，cDNA全長(zhǎng)1359bp，編碼452個(gè)氨基酸，表達(dá)的蛋白質(zhì)如SEQ.ID.No.3所示，該蛋白可用于調(diào)控板栗疫病菌分生孢子的形成。實(shí)驗(yàn)證明，該基因被潮霉素抗性基因hph置換后得到的缺失突變體產(chǎn)孢量減少，對(duì)高鹽和滲透壓敏感，在離體板栗樹(shù)枝上能夠形成與野生型大小沒(méi)有顯著差異的致病斑。本發(fā)明對(duì)產(chǎn)孢相關(guān)基因Pro2的功能研究，對(duì)研究板栗疫病菌及相關(guān)絲狀真菌分生孢子形成的分子機(jī)制和對(duì)外界環(huán)境的響應(yīng)機(jī)制具有重要的理論意義，而且對(duì)于研發(fā)控制板栗疫病及其它植物病害的候選藥物具有重要意義。
【專利說(shuō)明】板栗疫病菌產(chǎn)孢基因Pro2及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于微生物基因工程和植物保護(hù)領(lǐng)域，尤其涉及一種影響真菌分生孢子形成的板栗疫病菌產(chǎn)孢基因Pro2及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]板栗疫病菌(Cryphonectria parasitica)是引起板栗疫病的病原菌,在分類上屬于子囊菌中的絲狀真菌，現(xiàn)在已成為研究植物病原真菌致病機(jī)理的一個(gè)模式菌。板栗疫病菌可進(jìn)行有性生殖和無(wú)性生殖，在有性世代產(chǎn)生球形或扁球形、有長(zhǎng)頸的子囊殼，子囊產(chǎn)生在子囊殼內(nèi)，子囊孢子內(nèi)生于子囊中；在無(wú)性世代，板栗疫病菌形成單室或多室、大小不均、形狀不規(guī)則的分生孢子器，內(nèi)聚集著直或略彎的長(zhǎng)橢圓或圓柱形、無(wú)色、單倍體的分生孢子。分生孢子器和子囊殼均內(nèi)生于子座內(nèi)。在病害循環(huán)中，有性生殖的子囊孢子主要作為菌株變異(新的無(wú)性親和群)的來(lái)源，而無(wú)性生殖的分生孢子則主要是植物生長(zhǎng)季節(jié)中病菌和病害擴(kuò)散的來(lái)源。因此，闡明分生孢子形成和調(diào)控的分子機(jī)制，對(duì)于篩選植物病原真菌的分子靶標(biāo)，進(jìn)而研發(fā)控制真菌病害的特異性藥物，具有重要的應(yīng)用意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種板栗疫病菌產(chǎn)孢基因Pro2及其應(yīng)用，該基因在板栗疫病菌的分生孢子形成和外界因子響應(yīng)起重要作用，對(duì)篩選植物病害防治的候選靶標(biāo)藥物具有重要意義。
[0004]為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:板栗疫病菌產(chǎn)孢基因Pro2，具有序列表SEQ.1D.N0.1的堿基序列，由1641個(gè)堿基組成，4個(gè)外顯子，分別位于SEQ.1D.N0.1的5'端第I位至40位堿基之間、第99位至397位堿基之間、第487位至751位堿基之間和第2836位至3641位堿基之間；或者具有編碼序列表SEQ.1D.N0.3氨基酸序列的堿基序列。
[0005]與上述板栗疫病菌產(chǎn)孢基因Pro2具有80%以上同源性且編碼相同功能蛋白質(zhì)的堿基序列。
[0006]板栗疫病菌產(chǎn)孢基因Pro2或其缺失、突變或修飾后的基因在控制板栗疫病菌分生孢子產(chǎn)量或?qū)ν饨缫蜃禹憫?yīng)能力中的應(yīng)用。
[0007]板栗疫病菌產(chǎn)孢基因Pro2的編碼區(qū)序列構(gòu)建的表達(dá)載體或基因敲除盒。
[0008]上述表達(dá)載體或基因敲除盒轉(zhuǎn)化獲得的細(xì)胞系或宿主菌。
[0009]以上述板栗疫病菌產(chǎn)孢基因Pro2中任一區(qū)域堿基序列設(shè)計(jì)的引物。
[0010]上述引物通過(guò)PCR擴(kuò)增用于檢測(cè)在化合物處理狀況下Pro2基因的表達(dá)。
[0011]板栗疫病菌產(chǎn)孢基因Pro2的cDNA，具有序列表SEQ.1D.N0.2的堿基序列，由1416個(gè)堿基組成；或者具有編碼序列表SEQ.1D.N0.3氨基酸序列的堿基序列。
[0012]板栗疫病菌產(chǎn)孢基因Pro2編碼的蛋白質(zhì)或其同源蛋白，具有序列表SEQ.1D.N0.3,由472個(gè)氨基酸組成；或SEQ.1D.N0.4 (稻痕菌(Manapothia oryzae)同源蛋白，一致性 68%)、SEQ.1D.N0.5 (尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)同源蛋白，一致性 67%)的氨基酸序列。
[0013]上述蛋白質(zhì)或其同源蛋白為靶標(biāo)在設(shè)計(jì)和篩選抗真菌藥物中的應(yīng)用。
[0014]以上述蛋白質(zhì)或與其有40%以上一致性的同源蛋白中任一區(qū)域氨基酸序列設(shè)計(jì)的多肽。
[0015]上述多肽制備抗體用于檢測(cè)在化合物處理狀況下Pro2蛋白的表達(dá)。
[0016]本發(fā)明所提供的板栗疫病菌編碼gamma-谷氨酰磷酸還原酶(y -glutamyl phosphate reductase)蛋白，名稱為 Pro2,是 5_ 羧基-A1-批咯啉合酶(Δ1pyrroline-S-carboxylate synthetase)下游成員，來(lái)源于板栗疫病菌(Cryphonectria parasitica) EP155 菌株(ATCC 38755)。將釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的Pro2蛋白的氨基酸序列在板栗疫病菌基因組網(wǎng)站(http://genome, jg1-psf.0rg/pages/blast.jsf?db=Crypa2)進(jìn)行 blastp 分析，獲得與Pro2同源蛋白，ID號(hào)為343220，E值為1.97E-81。Pro2蛋白在真菌中的功能研究還未有報(bào)道。
[0017]本發(fā)明通過(guò)對(duì)Pro2與其它植物病原真菌中同源蛋白的聚類分析了該蛋白進(jìn)化的保守性和親緣關(guān)系(圖1)，與稻瘟菌和粗脈胞菌親緣關(guān)系最近，同源性分別為68.1%和74.1% ;與尖孢鐮刀菌、玉米赤霉菌和核盤菌的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，同源性分別為67.3,66.8%和69.7%，可見(jiàn)Pro2蛋白在絲狀真菌中進(jìn)化較保守，在致病真菌中執(zhí)行一些基本的功能。為了研究Pro2在板栗疫病菌中的功能，通過(guò)同源重組方法以高效同源重組系統(tǒng)AkuSO為出發(fā)菌株構(gòu)建Pro2的缺失突變體APro2并進(jìn)行了功能互補(bǔ)(圖2)，構(gòu)建的突變體PCR驗(yàn)證基因Pro2已被潮霉素抗性基因置換，且檢測(cè)不到Pro2的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，而重新導(dǎo)入Pro2基因的互補(bǔ)株內(nèi)檢測(cè)到Pro2基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。將突變體APro2接種到PDA平板培養(yǎng)觀察表型，該菌株表型與EP155和A ku80無(wú)顯著不同，色素減少(圖3);將突變體APro2接種到分別添加了 IM Sorbitol和0.2M NaCl的PDA平板培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)該菌株在高滲透壓力下和高鹽壓力下生長(zhǎng)均顯著慢于EP155和Aku80 (圖3)，證明了 Pro2基因的缺失導(dǎo)致板栗疫病菌對(duì)高鹽和高滲透壓敏感；將突變體A Pro2接種到板栗樹(shù)枝進(jìn)行致病力檢測(cè)，APro2產(chǎn)生的致病斑大小與EP155和Aku80的致病斑大小無(wú)顯著差異(圖3)，可見(jiàn)基因Pro2不是板栗疫病菌致病力相關(guān)基因。突變體八？1'02的產(chǎn)孢量(1.01\105±5.65父104個(gè)/ML)只有￡?155(2.08X 107±3.38X IO6 個(gè) /mL)和 Aku80(l.79X IO7± 1.63X IO6 個(gè) /mL)的 0.5% 和 0.6%,證明了 Pro2基因的缺失導(dǎo)致板栗疫病菌的分生孢子產(chǎn)量顯著減少(圖4)。綜合以上結(jié)果，說(shuō)明Pro2基因是板栗疫病菌分生孢子形成機(jī)制和對(duì)外界因子響應(yīng)機(jī)制所必需的基因。因此，篩選能夠阻止該基因表達(dá)與其蛋白質(zhì)的表達(dá)、修飾與定位的化合物，可以有效控制板栗疫病菌的分生孢子的產(chǎn)生和對(duì)外界環(huán)境的響應(yīng)，可以作為新型殺菌劑的候選新藥物直接利用。也就是說(shuō)，本發(fā)明所提供的Pro2的一個(gè)重要用途是，該基因的表達(dá)與其蛋白質(zhì)的表達(dá)、修飾與定位可以作為重要候選靶位點(diǎn)用于抗真菌藥劑(特別是抗板栗疫病菌的藥劑)的篩選和設(shè)計(jì)中。進(jìn)一步解析該基因參與的分生孢子形成機(jī)制和對(duì)外界因子響應(yīng)機(jī)制，從中也可以發(fā)現(xiàn)候選靶位點(diǎn)用于抗真菌藥劑(特別是抗板栗疫病菌藥劑)的篩選和設(shè)計(jì)中。此外，也可以以該基因核苷酸序列的某一區(qū)段作為探針或作為PCR引物設(shè)計(jì)的基礎(chǔ)在板栗疫病菌中再分離該序列，也可以用于篩選、分離其它真菌的與該基因具有一定序列同源性的序列。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0018]圖1是Pro2與其它植物病原真菌中同源蛋白的聚類分析圖。
[0019]圖2是Pro2基因的敲除研究實(shí)驗(yàn)圖。其中，
[0020]A是基因敲除盒構(gòu)建示意圖:左臂正、反向引物分別為Pro2_A(5’ -tggtccttgattgtgattcgtggtt—3，)矛口 Pro2_3(5， —tctttctagaggatccccgggtaccggtggtgcttgttgtggttgt-3 ’)，右臂正、反向引物分別為 Pro2_2 (5 ’ -atatcatcttctgtcgacctgcaggcaagtaagtaggggattcaag-3，)和 Pro2_B(5，-tcctccctctacccttacagacatc-3’ )，擴(kuò)增模板為 EP155 總 DNA,擴(kuò)增目的片段大小分別為961bp和1235bp。潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(hph)正、反向引物分別為 hph_F(5，-cggtacccggggatcctctag-3，)和 hph_R(5，-gcctgcaggtcgacagaagatg-3J )，擴(kuò)增模板為質(zhì)粒PCPXHY2。左、右兩臂及Hph的PCR擴(kuò)增片段通過(guò)fusion PCR的方法。左、右兩臂按照上下游順序分別融合到hph的兩側(cè)，構(gòu)成基因置換敲除盒。
[0021]B是PCR鑒定板栗疫病菌Pro2基因缺失突變體的構(gòu)建電泳圖:使用引物為Pro2-A/Pro2-B ；其中，M: GeneRulerlKb Ladder ； 1: EP155 ；2: A ku80 ；3: A Pro2 ；4:APro2_com。如 A 圖所不，基因 Pro2 全長(zhǎng) 1641bp 被 hph2145bp 置換后,Pro2-A/Pro2_B 擴(kuò)增突變體APro2條帶由擴(kuò)增EP155的3555bp增大為4341bp。Pro2-A/Pro2_B擴(kuò)增EP155和Aku80為3555bp，擴(kuò)增突變體APro2條帶增大為4341bp，擴(kuò)增互補(bǔ)突變體APro2_com則為3555bp和4314bp兩條帶。
[0022]C是RT-PCR驗(yàn)證板栗疫病菌Pro2基因缺失突變體的構(gòu)建電泳圖:使用引物Pro2-f(5，-gcaccgagtccttcatcgccatcag-3，)和 Pro2_r(5，_agccgtgggtgttgatgtgctcgac_3，)擴(kuò)增EP155、Aku80、APro2和A Pro2_com的cDNA，除了 A Pro2不能擴(kuò)增出條帶(如A圖所示)，基因Pro2全長(zhǎng)被hph置 換，該區(qū)域不轉(zhuǎn)錄)，EP155、A ku80和A Pro2_com均可擴(kuò)增出0.5kb目的條帶。
[0023]圖3是Pro2基因的缺失株菌落表型、滲透壓敏感性及鹽壓敏感性實(shí)驗(yàn)、致病性實(shí)驗(yàn)圖。
[0024]圖中，將 EP155、Aku80、EP713、A Pro2 A Pro2_com 于 PDA、添加了 IM Sorbito的PDA和添加了 0.2M NaCl的PDA光照培養(yǎng)7天的菌落表型。將EP155、Aku80、EP713、A Pro2和A Pro2-com接種休眠板栗樹(shù)枝后，于25°C保濕放置30天，對(duì)樹(shù)枝潰瘍斑進(jìn)行觀察。
[0025]圖4是Pro2基因的缺失株產(chǎn)孢量的比較圖。
[0026]圖中，對(duì)光照培養(yǎng)14天的菌落分生孢子進(jìn)行收集，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。
【具體實(shí)施方式】
[0027]以下通過(guò)實(shí)施例和附圖進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明，其中，實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特別說(shuō)明，均為常規(guī)方法；實(shí)驗(yàn)材料和試劑如無(wú)特別說(shuō)明，均可通過(guò)商業(yè)途徑獲得；百分含量如無(wú)特別說(shuō)明，均為質(zhì)量百分含量。
[0028]實(shí)施例l、Pro2與其它真菌中同源蛋白的聚類分析
[0029]將Pro2 的氨基酸序列輸入 GenBank (http://www.ncb1.nlm.nih.gov)進(jìn)行BlastP檢索，獲得多個(gè)物種同源蛋白的氨基酸序列。JGI_343220是板栗疫病菌Pro2蛋白，Pro2蛋白在其它真菌中的同源蛋白為:XP_003712240來(lái)自稻瘟菌(Magnaportheoryzae), EGU79394 來(lái)自尖抱鍵刀菌(Fusarium oxysporum), XP_390297 來(lái)自玉米赤霉菌(Gibberella zeae), XP_960835來(lái)自粗脈胞菌(Neurospora crassa), XP_001590431 來(lái)自核盤菌(Sclerotinia sclerotiorum)。使用 MEGA4.0 軟件的鄰接法(Neighbor-joining)構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，建樹(shù)過(guò)程選擇bootstrap檢驗(yàn)1000次，用TREEVIEW進(jìn)行展示。如附圖1所示，稻瘟菌和粗脈胞菌的Pro2蛋白聚成一支，與板栗疫病菌的親緣關(guān)系較近，而玉米赤霉菌與尖孢鐮刀菌聚成一支，與核盤菌親緣關(guān)系較近一簇，與板栗疫病菌親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。
[0030]實(shí)施例2、Pro2基因在板栗疫病菌中的功能研究
[0031]I)敲除盒的構(gòu)建
[0032]基因敲除采用同源重組的方法，用潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因替換板栗疫病菌高效同源重組系統(tǒng)中Pro2基因的編碼區(qū)，具體策略見(jiàn)圖2A。左臂正、反向引物分別為PrM-Ab’-tggtccttgattgtgattcgtggtt—S ，)矛口 Pro2_3 (5，—tctttctagaggatccccgggtaccggtggtgcttgttgtggttgt-3 ’)，右臂正、反向引物分別為 Pro2_2 (5 ’ -atatcatcttctgtcgacctgcaggcaagtaagtaggggattcaag-3，)和 Pro2_B (5，_tcctccctctacccttacagacatc_3，)，擴(kuò)增模板為 EP155總DNA，擴(kuò)增目的片段大小分別為961bp和1235bp。潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(hph)正、反向引物分別為 hph_F(5’ - cggtacccggggatcctctag-3’ )和 hph_R(5’ -gcctgcaggtcgacagaagatg-3’)，擴(kuò)增模板為質(zhì)粒pCPXHY2，擴(kuò)增目的片段大小為2145bp。通過(guò)fusion PCR的方法，左、右兩臂按照上下游順序分別融合到hph的兩側(cè)，構(gòu)成基因置換敲除盒。
[0033]本發(fā)明中采用的Fusion PCR方法如下:
[0034]分別回收上下游片段及抗性基因并按摩爾比1:3:1的比例進(jìn)行融合PCR反應(yīng)。融合PCR反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性2min ;94°C變性30sec，58°C退火10min，72°C延伸4min，共進(jìn)行15個(gè)循環(huán)；最后72°C反應(yīng)lOmin。以稀釋10倍后的融合PCR產(chǎn)物I yl為模板，用引物Pro2-A/Pro2-B按照常規(guī)PCR方法大量擴(kuò)增。獲得的PCR產(chǎn)物為4341bp，經(jīng)乙醇沉淀濃縮至濃度為l_2y g/uL，可直接用于真菌轉(zhuǎn)化。
[0035]2)板栗疫病菌的的轉(zhuǎn)化
[0036]在本發(fā)明中，板栗疫病菌的轉(zhuǎn)化采用CaCl2/PEG介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化真菌原生質(zhì)體的方法，原生質(zhì)體的制備和轉(zhuǎn)化方法具體如下:
[0037]a.原生質(zhì)體的制備
[0038]配備溶液0.6M MgSO4UM Sorbitol、OM soluiton (1.2M MgSO4, IOmM NaH2PO4,pH5.8)、Trapping Buffer (0.4M Sorbitol,0.1M Tris-HCl, pH7.0)、STC (IM Sorbitol,0.1M Tris-HCl pH8.0,0.1M CaCl2),PTC(40%PEG3350,0.1M Tris-HCl,0.1M CaCl2,pH8.0)高壓滅菌后保存于4°C。
[0039]將保存菌種接種至PDA平板，室溫光照培養(yǎng)數(shù)天至菌落半徑2cm，刮取少量菌絲至100ml EP完全培養(yǎng)基中，25°C靜置培養(yǎng)3d后可用于制備原生質(zhì)體。此時(shí)配備酶解液，于50mL0M soluiton加入纖維素酶0.5g、蝸牛酶0.3g及溶菌酶0.2g，過(guò)濾滅菌后待用。離心收集菌體，加入30mL0.6M MgSO4漂洗菌體兩次，加入50mL酶解液消化菌體細(xì)胞壁，于28°C、200rpm反應(yīng)3_4h至鏡檢觀察到菌絲體形成原生質(zhì)體后,按每管12.5ml酶解反應(yīng)液分裝到50ml corning管中，在液面上緩慢加2倍體積的Trapping Buffer, 3500g4°C離心30分鐘后，用巴氏吸管小心地從兩層液面交界處吸取原生質(zhì)體，并轉(zhuǎn)移至新的corning管中，置冰上；加入2倍體積IM Sorbitol漂洗原生質(zhì)體；重復(fù)一次；用15ml STC漂洗原生質(zhì)體一次；用血球計(jì)數(shù)板對(duì)原生質(zhì)體進(jìn)行計(jì)數(shù)，用STC:PTC按4:1的比例重懸原生質(zhì)體，同時(shí)加入DMSO至終濃度為1%，使原生質(zhì)體濃度為8 X IO7-1 X IO8個(gè)/ml以上；按每管100 ill分裝至EP管，置于-80°C保存?zhèn)溆谩?br> [0040]b.板栗疫病菌的轉(zhuǎn)化
[0041]配備再生培養(yǎng)基:200ml再生培養(yǎng)基中含有Casein enzymatic hydrolysate0.2g>yeast extracts0.2g、surcose68.4g、Bacto? Agar3.2g,加熱溶解后高壓滅菌，于轉(zhuǎn)化前 3h加熱溶解，冷卻至50°C后放于46°C溫育待用。
[0042]取2-5 ii g 純化的 DNA 與 I ii I spermidine (IOOmM)混勻后,加入 100 ii I 原生質(zhì)體中，輕輕混勻，冰浴30min ;再加入Iml PTC混勻，室溫放置25分鐘；7000g4°C離心5min ；棄上清，加入500iil STC輕輕懸浮沉淀，5000g4°C離心Imin ;棄上清，再次加入500 STC輕輕懸浮沉淀，按170 iil/皿均勻點(diǎn)在潔凈無(wú)菌的培養(yǎng)皿中，取12ml再生培養(yǎng)基覆蓋，并輕輕搖勻；于28°C培養(yǎng)18-24小時(shí)后，加入12ml含抗生素的再生培養(yǎng)基覆蓋上層，室溫培養(yǎng)3-4天至菌落長(zhǎng)出。[0043]c.抗性轉(zhuǎn)化株的純化
[0044]從再生培養(yǎng)基中挑取的轉(zhuǎn)化株首先要經(jīng)過(guò)2-3輪的抗性篩選，使其具有穩(wěn)定的抗生素抗性，然后通過(guò)單孢分離或原生質(zhì)體再生進(jìn)行菌株的純化。單孢分離的基本過(guò)程是:首先將轉(zhuǎn)化株接種于無(wú)抗生素的PDA平板上，光照培養(yǎng)14-21天左右使其產(chǎn)孢，用無(wú)菌水或0.02%Tween80洗下孢子，稀釋不同的濃度后涂于含有抗生素的PDA培養(yǎng)基上，室溫培養(yǎng)3天，挑取單菌落進(jìn)行檢測(cè)。
[0045]4)野生型菌株與Pro2基因的缺失株生長(zhǎng)的比較
[0046]將EP155、A ku80、EP713、A Pro2 和 A Pro2_com 接到 PDA 平皿上，每個(gè)菌株接種3-5份，于25°C光照培養(yǎng)14天后觀察表型(圖3)，APro2表型與EP155和A ku80無(wú)顯著差異，色素減少。
[0047]5)野生型菌株與Pro2基因的缺失株對(duì)滲透壓敏感性實(shí)驗(yàn)
[0048]將EP155、Aku80、EP713、APro2 和 A Pro2_com接種到添加了 IM Sorbitol 的 PDA平板上，每個(gè)菌株接種3-5份，于25°C光照培養(yǎng)7天，通過(guò)觀察生長(zhǎng)情況比較菌株對(duì)滲透壓敏感性(圖3)，APro2菌落顯著小于EP155和Aku80。
[0049]6)野生型菌株與Pro2基因的缺失株對(duì)鹽壓敏感性實(shí)驗(yàn)
[0050]將EP155、Aku80、EP713、APro2 和 A Pro2_com 接到添加了 0.2M NaCl 的 PDA 平板上，每個(gè)菌株接種3-5份，于25°C光照培養(yǎng)7天，通過(guò)觀察生長(zhǎng)情況比較板栗疫病菌對(duì)高鹽壓敏感性(圖3)，APro2菌落顯著小于EP155和Aku80。
[0051]7)野生型菌株與Pro2基因的缺失株致病力檢測(cè)實(shí)驗(yàn)
[0052]于每年的1-2月取直徑為5cm左右的板栗樹(shù)干，將其余細(xì)枝出去并用蠟封住切口，用內(nèi)徑直徑為5mm打孔器與樹(shù)枝上打孔，孔深約l-2mm，每孔間隔約10-12cm ;將板栗疫病菌于PDA平板上光照培養(yǎng)2-3d至菌落直徑約為2-3cm，用打孔器取出菌塊轉(zhuǎn)接于板栗樹(shù)枝新孔處，每個(gè)菌株接種五份，用封口膜封好，保持濕度，將樹(shù)干室溫放置30天后，小心將打孔處周圍的樹(shù)皮削去，即可觀察到菌塊產(chǎn)生的潰瘍斑，測(cè)量潰瘍斑的長(zhǎng)短直徑并計(jì)算面積，病斑面積=3.14X病斑長(zhǎng)軸半徑X病斑短軸半徑。APro2的致病斑大小與EP155和A ku80無(wú)顯著差異(圖3)。
[0053]8)野生型菌株與Pro2基因的缺失株產(chǎn)孢量的比較
[0054]將EP155、A ku80、EP713、A Pro2 和 A Pro2_com 接到 PDA 平皿上，每個(gè)菌株接種3-5份，于25°C光照培養(yǎng)14天后，每皿用IOml0.02%Tween80將分生孢子沖洗下來(lái)，于顯微鏡下計(jì)數(shù)。每個(gè)菌株分析數(shù)值至少三個(gè)重復(fù)。所獲得的分手孢子數(shù)量除以菌落面積即為該菌落的單位面積產(chǎn)孢量。突變體ΔPro02的產(chǎn)孢量(1.01\105±5.65\104個(gè)/mL)只有EP155 (2.08X 107±3.38X 106 f/mL)#P A ku80 (1.79 X 107± 1.63 X IO6 個(gè)/mL)的 0.5%和0.6%，即Pro2基因的缺失導(dǎo)致板栗疫病菌的分生孢子產(chǎn)量顯著減少(圖4)。
[0055]實(shí)施例3、RT-PCR
[0056]I)總RNA的提取:將接種于PDA光照培養(yǎng)7d的菌體從培養(yǎng)基上刮下，用吸水紙吸去過(guò)多水分。稱取0.5g菌體加足量的液氮研磨成粉末，立即加入準(zhǔn)備好的5ml總DNAextraction buffer和5ml Tris飽和酹的等體積混合物,在溶解的過(guò)程中用研磨件不斷攪拌使其充分作用。將融化的混合物轉(zhuǎn)入Corning管中，3500g離心40min。棄上清,加入等體積的苯酚/氯仿、等體積的氯仿各抽提一次。將上清液轉(zhuǎn)至EP管中，加0.7倍體積的異丙醇，混勻后室溫IOOOOg離心8分鐘，倒掉上清液，用預(yù)冷75%乙醇洗沉淀2-3次，自然晾干，加100 u I DEPC處理的ddH20溶解。電泳檢測(cè)所得總RNA的質(zhì)量和濃度。
[0057]2) dsRNA 的純化:用 RNase-Free DNase I (Roche)在 25_37°C消化 I5-2Omin 去除小量殘余總DNA，DNase I的用量是lu/y g DNA，經(jīng)酚/氯仿抽提和乙醇沉淀后，溶于適量的DEPC-H2O中，分光光度計(jì)測(cè)定RNA的濃度。用1.0%的瓊脂糖凝膠在IXTAE (40mMTris-HAc, ImM EDTA, pH8.0)的條件下電泳檢測(cè)消化后RNA的質(zhì)量。
[0058]3) cDNA 第一鏈的合成:反應(yīng)體系:0.2-2 u g 總 RNA、1 u IlOmM primer、加A DEPC-處理水定容至12iU ;溫和混勻后短暫離心，置于70°C水浴5min后，立即返回冰浴冷卻，短暫離心后繼續(xù)加入4 u 15 X reaction buffer、2 u IlOmM dNTP> IulRiboLock? RNase Inhibitor (20U),溫和混勻后短暫離心，置于37°C水浴5min后，加入I u lRiboLock?H Minus Reverse Transcriptase (200U)并輕輕混勻，42°C溫育 60min, 7CTC水浴5min終止反應(yīng)。反應(yīng)液置于_20°C保存。
[0059]4) RT-PCR:稀釋合適倍數(shù)的第一鏈 cDNA2 U IUOXEx Taq Buffer2.5 ii 1、
2.5mMdNTPl u l.Primerl (5uM) I u l、Primer2 (5uM) I u l.Ex Taq0.1 ii 1，加 ddH20 至總體積25 ill。將反應(yīng)體系置于PCR儀進(jìn)行PCR反應(yīng)。
【權(quán)利要求】
1.一種板栗疫病菌產(chǎn)孢基因Pro2，其特征在于具有序列表SEQ.1D.N0.1的堿基序列，或者具有編碼序列表SEQ.1D.N0.3氨基酸序列的堿基序列。
2.與權(quán)利要求1所述板栗疫病菌產(chǎn)孢基因Pro2具有80%以上同源性且編碼相同功能蛋白質(zhì)的喊基序列。
3.權(quán)利要求1所述板栗疫病菌產(chǎn)孢基因Pro2或其缺失、突變或修飾后的基因在控制板栗疫病菌分生孢子產(chǎn)量或?qū)ν饨缫蜃禹憫?yīng)能力中的應(yīng)用。
4.權(quán)利要求1所述板栗疫病菌產(chǎn)孢基因Pro2的編碼區(qū)序列構(gòu)建的表達(dá)載體或基因敲除盒。
5.權(quán)利要求4所述表達(dá)載體或基因敲除盒轉(zhuǎn)化獲得的細(xì)胞系或宿主菌。
6.權(quán)利要求1所述板栗疫病菌產(chǎn)孢基因Pro2中任一區(qū)域堿基序列設(shè)計(jì)的引物通過(guò)PCR擴(kuò)增用于檢測(cè)在化合物處理狀況下Pro2基因的表達(dá)。
7.權(quán)利要求1所述板栗疫病菌產(chǎn)孢基因Pro2的cDNA，其特征在于具有序列表SEQ.1D.N0.2的堿基序列，或者具有編碼序列表SEQ.1D.N0.3氨基酸序列的堿基序列。
8.權(quán)利要求1所述板栗疫病菌產(chǎn)孢基因Pro2編碼的蛋白質(zhì)或其同源蛋白，其特征在于具有序列表SEQ.1D.N0.3或SEQ.1D.N0.4、SEQ.1D.N0.5的氨基酸序列。
9.權(quán)利要求8所述板栗疫病菌產(chǎn)孢基因Pro2編碼的蛋白質(zhì)或其同源蛋白為靶標(biāo)在設(shè)計(jì)和篩選抗真菌藥物中的應(yīng)用。
10.權(quán)利要求8所述板栗疫病菌產(chǎn)孢基因Pro2編碼的蛋白質(zhì)或與其有40%以上一致性的同源蛋白中任一區(qū)域氨基酸序列設(shè)計(jì)的多肽制備抗體用于檢測(cè)在化合物處理狀況下Pro2蛋白的表達(dá)。
【文檔編號(hào)】C12N15/80GK103451203SQ201310233229
【公開(kāi)日】2013年12月18日 申請(qǐng)日期:2013年6月13日 優(yōu)先權(quán)日:2013年6月13日
【發(fā)明者】陳保善, 姚姿婷, 鄒承武, 周輝, 王金子, 盧立丹 申請(qǐng)人:廣西大學(xué)