一種豬細(xì)小病毒毒株的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種豬細(xì)小病毒毒株，豬細(xì)小病毒（Parvoviridae），CCTCCNO：V201313。本發(fā)明采用PCR方法對河南地區(qū)采集的疑似PPV病料進(jìn)行PCR檢測，通過接種豬睪丸（ST）細(xì)胞分離到1株病毒，命名為HP104。通過觀察細(xì)胞病變、生物學(xué)特性研究、電鏡觀察病毒的形態(tài)等途徑證實(shí)分離的病毒為豬細(xì)小病毒。本發(fā)明將豬細(xì)小病毒HP104株病毒液與油乳劑混合制成乳化劑，然后接種健康豚鼠，28天后檢測到HI抗體水平達(dá)到128，而對照組豚鼠豬細(xì)小病毒抗體呈陰性。說明河南分離株P(guān)PVHP104具有良好的免疫原性。
【專利說明】一種豬細(xì)小病毒毒株
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種豬細(xì)小病毒毒株的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]豬細(xì)小病毒(Porcine parvovirus, PPV)是引起母豬繁殖障礙的主要病原體之一。能夠?qū)е率芨腥灸肛i產(chǎn)出死胎、畸形胎、木乃伊胎及病弱仔豬，同時(shí)還會(huì)引起仔豬皮炎癥狀、非化膿性心肌炎和消瘦性綜合征。豬細(xì)小病毒又常同豬偽狂犬病毒、豬圓環(huán)病毒、豬瘟、豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒等混合感染而加重了其危害。
[0003]一些科研工作者曾經(jīng)做過河南地區(qū)豬細(xì)小病毒的流行病學(xué)調(diào)查，發(fā)現(xiàn)很多豬場都有PPV抗體陽性豬存在，說明河南地區(qū)PPV的感染情況比較嚴(yán)重，給河南地區(qū)養(yǎng)豬業(yè)造成了重大的經(jīng)濟(jì)損失。在當(dāng)前情況下，對河南地區(qū)存在的豬細(xì)小病毒進(jìn)行研究也就顯得尤為
重要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種豬細(xì)小病毒毒株，分類命名:豬細(xì)小病毒，拉丁文學(xué)名:Parvoviridae,保藏單位:中國典型培養(yǎng)物保藏中心,保藏單位簡稱:CCTCC,保藏單位地址:湖北省武漢市武昌區(qū)珞珈山路16號(hào)武漢大學(xué)，保藏日期:2013年5月28日，保藏編號(hào)CCTCC NO:V201313o
[0005]本發(fā)明的技術(shù)方案是:一種豬細(xì)小病毒毒株，豬細(xì)小病毒(Parvoviridae)，CCTCCNO:V201313o
[0006]本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明采用PCR方法對河南地區(qū)采集的疑似PPV病料進(jìn)行PCR檢測，通過接種豬睪丸(ST)細(xì)胞分離到I株病毒，命名為HP104。通過觀察細(xì)胞病變、生物學(xué)特性研究、電鏡觀察病毒的形態(tài)等途徑證實(shí)分離的病毒為豬細(xì)小病毒。
[0007]本發(fā)明將豬細(xì)小病毒HP104株病毒液與油乳劑混合制成乳化劑，然后接種健康豚鼠，28天后檢測到HI抗體水平達(dá)到128，而對照組豚鼠豬細(xì)小病毒抗體呈陰性。說明河南分離株P(guān)PV HP104具有良好的免疫原性。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0008]圖1為組織病料中PPV的PCR擴(kuò)增結(jié)果，其中M.DNA Marker DL 2000; 1.病料中的PPV的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；2.陰性對照；
圖2為HP104株電鏡照片；
圖3為豬細(xì)小病毒HP104全基因組各片段PCR擴(kuò)增結(jié)果，M.DNA Marker DL2000; 1.P1/P2擴(kuò)增結(jié)果；2.P3/P4擴(kuò)增結(jié)果；3.P5/P6擴(kuò)增結(jié)果；4.P7/P8擴(kuò)增結(jié)果；5.陰性對照；
圖4為重組質(zhì)粒PCR鑒定結(jié)果，M.DNA Marker DL2000; 1.P1/P2擴(kuò)增片段;2.P3/P4擴(kuò)增片段；3.P5/P6擴(kuò)增片段；4.P7/P8擴(kuò)增片段；5.陰性對照；圖5為PPV不同分離株基因的核苷酸序列同源性分析 圖6為PPV全基因序列系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。
【具體實(shí)施方式】
[0009]一種豬細(xì)小病毒毒株，豬細(xì)小病毒(Parvoviridae)，CCTCC NO:V201313。
[0010]一豬細(xì)小病毒毒株HP104的分離鑒定和生物學(xué)特性的研究 I材料與方法
1.1材料
1.1.1病料組織和細(xì)胞株
病料組織采自河南省新鄉(xiāng)市某豬場病死仔豬的胎衣、肝臟、脾臟、肺臟和淋巴結(jié)。河南省新鄉(xiāng)市某豬場1000頭母豬，2012年9月有10頭初產(chǎn)母豬流產(chǎn)、死產(chǎn)，母豬無明顯癥狀，而斷奶仔豬被毛粗糙、精神沉郁。根據(jù)發(fā)病情況，懷疑是PPV感染)豬睪丸(ST)細(xì)胞購自中國獸藥監(jiān)察所(凍存)。
[0011]1.1.2 HA試劑的配制
0.01 M PBS液的配制:取氯化鈉8 g，氯化鉀0.2 g，磷酸二氫鈉1.15 g，磷酸氫二鉀
0.2 g，溶于800 mL三蒸水中充 分溶解后定容至1000 mL，調(diào)pH值到7.4，高壓滅菌后4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0012]抗凝劑(3.8%檸檬酸鈉)的配制:稱取檸檬酸鈉3.8g，加滅菌蒸餾水至100 mL,裝瓶備用。
[0013]0.6%豚鼠紅細(xì)胞懸液制備:按常規(guī)方法心臟采集健康豚鼠血液(每毫升血液加入抗凝劑0.2 mL)，將血液注入離心管中，經(jīng)2000 rpm離心lOmin，用移液器吸去上清液和紅細(xì)胞上層的白細(xì)胞薄膜，將沉淀的紅細(xì)胞用PBS液洗滌，如此反復(fù)洗滌三次，第三次離心10min后棄上清液，加PBS配制成0.6%的紅細(xì)胞懸液。
[0014]1.2引物設(shè)計(jì)
從GenBank中下載多條具有代表性的豬細(xì)小病毒基因組序列，利用DNAStar軟件尋找非結(jié)構(gòu)蛋白NSl基因中的序列。應(yīng)用Primer premier 5.0軟件設(shè)計(jì)出擴(kuò)增195 bp的引物Pl和P2，用于檢測PPV。引物由上海生工生物工程有限公司合成。
[0015]Pl 5’- CCA AAA ATG CAA ACC CCA ATA-3’
P2 5’- ATCT GGC GGT GTT GGA GTT AAG-3’
1.3病料的PCR檢測和處理
1.3.1病料的PCR檢測
采用蛋白酶K法提取病料組織(死胎胎衣、肝臟、脾臟、肺臟和淋巴結(jié))DNA。以病料組織DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，擴(kuò)增體系為2 X PCR Taq Mix聚合酶12 μ L，模板DNA 3UL，引物Pl和Ρ2各0.5 yL，補(bǔ)超純水至25 μ L。混勻后于PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，同時(shí)設(shè)無模板的陰性對照。反應(yīng)條件為95°C預(yù)變性5 min ；94°C I min,53°C 50 s,72°C 50 s，共30個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后，取5 μ? PCR產(chǎn)物用10 g/L瓊脂糖凝膠(含
0.5 Pg/mL EB)進(jìn)行電泳檢測PCR結(jié)果。
[0016]如果PCR檢測結(jié)果為陽性，則將PCR產(chǎn)物回收純化并連接到T載體上，經(jīng)連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化、重組質(zhì)粒的提取、重組質(zhì)粒的PCR和酶切鑒定等過程，對鑒定的陽性克隆進(jìn)行序列測定，由上海生物工程有限公司完成，
1.3.2病料的處理
將PCR檢測為陽性的病料組織按1:5(w/V)加入含青霉素I OOO U/mL和鏈霉素I 000U/mL的滅菌PBS液，經(jīng)研缽研磨后，放入_20°C冰箱中，反復(fù)凍融3次，再用0.22 Mm的細(xì)菌濾器過濾除菌。
[0017]1.4病毒的培養(yǎng)與增殖
將處理后的病料按培養(yǎng)液量的1/10同步接種到ST細(xì)胞中，置于5%C02 37°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h。收獲接毒細(xì)胞，反復(fù)凍融3次收集病毒，8000 rpm離心30min去除細(xì)胞碎片，此為第I代毒，命名為PPV HP104。按10%接毒量盲傳至細(xì)胞出現(xiàn)了較穩(wěn)定的細(xì)胞病變(CPE)，此后按培養(yǎng)液體積的2%接毒，用同樣的方法將該毒株連續(xù)傳代到第25代。
[0018]1.5細(xì)胞病變觀察
將狀態(tài)良好長成單層的ST細(xì)胞用0.25%胰酶按常規(guī)方法消化后，同步接種PPV HP104第10代細(xì)胞培養(yǎng)物，置于5%C02 3 7°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。逐日觀察細(xì)胞病變直至收獲病毒。
[0019]1.6病毒滴度TCID5tl的測定
將消化吹散的ST細(xì)胞懸液加入EP管中，取PPV HP104第10、15、20、25代細(xì)胞培養(yǎng)物分別連續(xù)倍比稀釋KT1?10_1(1，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育Ih后接種到96孔板中，每孔200 μ?,每個(gè)稀釋度各作6個(gè)重復(fù)，逐日觀察細(xì)胞病變情況，并按照Reed-Muench法計(jì)算病毒滴度TCID500`[0020]1.7病毒血凝效價(jià)的測定
在96孔“V”型微量反應(yīng)板上，加入50 μ? PBS液于反應(yīng)板的第I孔至第12孔，再加50μ? PPV ΗΡ104第10、15、20、25代細(xì)胞培養(yǎng)物于每排第I孔，按倍比稀釋至第11孔，棄去50 μ L，第12孔為陰性對照孔，加50 μ L 0.6%的豚鼠紅細(xì)胞懸液于每孔。在微量震蕩器上搖勻10 S，放置37°C溫箱靜置I h，以50%紅細(xì)胞凝集為終點(diǎn)，樣品出現(xiàn)凝集終點(diǎn)的最高稀釋度為該病毒液HA效價(jià)。
[0021]1.8理化特性研究
取5只滅菌的離心管，在超凈臺(tái)內(nèi)分別加入3 mL PPV HP104第20代細(xì)胞液。第I管加入終濃度為4.8%的分析純氯仿混合振蕩,置于4°C作用10 min,隨后用500 rpm的速度離心5 min，然后吸取上層液體；第2管用0.1 mol/L的鹽酸調(diào)pH至3.0，于37°C水浴作用2 h，再用5.6%的NaHC03溶液將pH值調(diào)回至7.2 ;第3管置于56°C水浴中作用30 min ;第
4管加入1%的胰蛋白酶置37°C水浴作用I h后，用滅活胎牛血清終止其作用；第5管不處理作為正常對照。然后分別ST傳代細(xì)胞按常規(guī)方法測定其TCID5tlt5
[0022]1.9形態(tài)學(xué)觀察
取PPV HP104第25代細(xì)胞培養(yǎng)物在_20°C反復(fù)凍融3次，用超聲波將其處理3次，每次5 min，在4°C條件下12 000 rpm離心I h，取上清液用IN NaOH把pH調(diào)至8.0 ;緩緩加入PEG-6000至10%，0.5M NaCL，攪拌I h后放置在4°C過夜，過夜后20 000 rpm離心I h，沉淀物用少量TEI液溶解，20 000 rpm離心30 min,取上清后以50 000 rpm離心2.5 h,然后將上清棄去，用少量TEI把沉淀物溶解，12 000 rpm離心15 min，上清液就是濃縮的PPV病毒液,取2 μ?涂在柱上,用電鏡進(jìn)行觀察照相。[0023]2 結(jié)果
2.1病料的PPV檢測結(jié)果和測序結(jié)果
從疑似PPV感染的病料組織中提取DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增的產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測表明，獲得了 I條約200 bp的的特異性帶(圖1)，與預(yù)期片段大小相符。
[0024]陽性克隆測序結(jié)果表明PCR擴(kuò)增片段長度為195bp，與預(yù)期結(jié)果相符合。將陽性片段序列與Genbank中已發(fā)表的多株豬細(xì)小病毒序列進(jìn)行核苷酸同源性比較后，發(fā)現(xiàn)同源性可達(dá)到100%。測序結(jié)果如下:
【權(quán)利要求】
1.一種豬細(xì)小病毒毒株，其特征在于，豬細(xì)小病毒(Parvoviridae)，CCTCC NO:V201313 。
【文檔編號(hào)】C12R1/93GK103436497SQ201310235390
【公開日】2013年12月11日 申請日期:2013年6月14日 優(yōu)先權(quán)日:2013年6月14日
【發(fā)明者】崔保安, 陳紅英, 吳宇陽, 陳龍彪, 魏戰(zhàn)勇, 李新生 申請人:河南農(nóng)業(yè)大學(xué)