一種豬圓環(huán)病毒Ⅱ型毒株的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種豬圓環(huán)病毒Ⅱ型毒株，豬圓環(huán)病毒Ⅱ型(Circoviridae)，CCTCC?NO：V201312。本發(fā)明對PCV2體外培養(yǎng)增殖條件進行優(yōu)化并篩選出一株對PCV2敏感性較高的命名為L8的PK15細胞克隆株，為PCV2進一步研究奠定了基礎。
【專利說明】—種豬圓環(huán)病毒II型毒株
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種豬圓環(huán)病毒II型毒株。
【背景技術】
[0002]1974年，德國一個研究者從豬腎細胞系PK15(ATCC-CCL33)發(fā)現一個新的，沒有致病性的微小核糖核苷酸病毒樣污染物。隨后報道該污染物是一個二十面體，沒有囊膜，有一個單股環(huán)狀DNA基因組的病毒，是已知最小的能在哺乳動物細胞中進行自我復制的病毒，緊接著，命名為豬圓環(huán)病毒(PCV)。它主要感染單核/巨噬細胞系細胞，其中豬肺泡巨噬細胞是其主要的靶細胞。隨后在德國、加拿大、大不列顛以及北愛爾蘭進行豬的PCV抗體血清學調查，結果表明豬群中PCV普遍存在。用PCV試驗感染9月齡大的豬，結果不發(fā)生臨床疾病，因此認為病毒沒有致病性。
[0003]90年代末期，從加拿大西部的患有消瘦性疾病的豬群身上第一次分離出類似PCV樣的病毒。此后不久在美國北部和歐洲也分離出類似加拿大的病毒株。用單抗、多抗、基因序列分析都顯示出這些毒株在免疫原性和遺傳學與PCV的不同。因此提出，病豬分離的PCV為PCV2，之前PK15分離的PCV為PCVl。盡管PCVl無致病性，但廣泛存在于豬體和豬源細胞系；PCV2具有致病性，可引起豬的多種疾病。PCV2和豬的一系列疾病綜合癥相關，科學術語稱圓環(huán)病毒病(PCVD)。1996年首次報道消瘦綜合癥是加拿大西部的豬，1991年第一次在一個健康的SPF豬群中分離出PCV2。作者提出PMWS這個名詞來描述其臨床癥狀。感染豬的損傷部位檢測出大量PCV2核苷酸和抗原，能分離出PCV2。在加利福尼亞6周齡的豬的間質性肺炎和淋巴結病能檢測出PCV2基因組，也分離出一株PCV2病毒。1996-1997年，PCV2相關的消瘦疾病在法國和西班牙報道。從此以后，PCV2相關的PMWS在世界所有養(yǎng)豬國家爭相報道。從1986年西班牙、英國和1989年日本的PMWS豬保存的組織病變樣本中檢測出大量PCV2抗原。此外，從一個回顧評價中發(fā)現，早在1969年就有PCV2在豬群中感染的證據。因此，不能說PMWS是一種新病，也不能說PCV2是一個新病毒。PCV2與另外一個在豬群迅速擴大的疾病相關，豬皮炎腎病綜合癥(PDNS)，在一些國家TONS已經達到動物流行病比例。盡管流行病學顯示PMWS與I3DNS可能是有聯系的，但TONS感染是否與PCV2有直接關系仍需要證明。PCV2是豬繁殖障礙的一個病因，能在新生豬心肌炎的心臟組織中檢測出大量PCV2。PCV2抗原在增生性壞死性肺炎(PNP)豬的肺組織中大量檢出，也能在母豬流產死亡綜合癥(SAMS)的母豬組織中檢測出PCV2。PCV2也是豬呼吸道疾病綜合癥的一個誘因。
[0004]在PCVAD中，PMWS危害最大，它主`要發(fā)生于5?16周齡的斷奶仔豬，是一種以進行性消瘦和多系統病理損傷為主要特征的免疫抑制性疾病，并且易與其它病原并發(fā)或繼發(fā)感染。據估計PCVD每年給歐盟帶來6億歐元的損失。直接損失來自于保育豬和育肥豬的死亡、淘汰豬。間接損失來自于為控制繼發(fā)感染而投入的抗生素和為減少PMWS影響而投入的豬場管理費用。
[0005]目前，對于PCV2引發(fā)的疾病還沒有一個有效的預防措施，但首選方案還是對豬只接種疫苗。疫苗研制上，遇到最大的困難就是PCV2病毒增殖滴度低的問題。病毒體外培養(yǎng)增殖能力弱，很難滿足疫苗生產要求。此外，沒有一個固定的疫苗免疫效果評價標準，強毒感染動物模型反應結果不一。

【發(fā)明內容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供一種豬圓環(huán)病毒II型毒株，分類命名:豬圓環(huán)病毒II型，拉丁文學名:Circoviridae，保藏單位:中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏單位簡稱:CCTCC，保藏單位地址:湖北省武漢市武昌區(qū)珞珈山路16號武漢大學，保藏日期:2013年5月28日，保藏編號 CCTCC NO:V201312o
[0007]本發(fā)明的技術方案是:一種豬圓環(huán)病毒II型毒株，豬圓環(huán)病毒II型(Circoviridae)，CCTCC NO:V201312。
[0008]本發(fā)明的有益效果是:本試驗對PCV2體外培養(yǎng)增殖條件進行優(yōu)化并篩選出一株對PCV2敏感性較高的命名 為L8的PK15細胞克隆株，為PCV2進一步研究奠定了基礎。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0009]圖1為組織病料中PCV2的PCR擴增結果，M.DNA Marker DL 2000; 1-2.病料中的PCV2 PCR擴增產物；3.陰性對照；
圖2為細胞毒PCV2全基因組的PCR產物，M.DNA Marker DL 2000; 1-2.細胞毒中PCV2的PCR擴增產物；3.陰性對照；
圖3為PCV2毒株全基因組核苷酸序列比較，分別代表AY556476，AY556477，AY578327, DQ910866, DQ915587, DQ923524, EF210106, EF565364,EF592576, EU148504,EU386606, EU408780, EU547458, EU747085, EU921257, FJ804417, FJ870972, FJ905470,FN687856,⑶049340，⑶247992， HM038028, HM038032, HM776453, HQ378161,EU780074,JQ692110, AF055392, AF055394, EU148503，HZ09?！硎緦嶒炇曳蛛x株；★表示2a, 2b, 2c參考序列；
圖4為PCV2分離株基因組核苷酸序列的系統進化樹，▲表示實驗室分離株；
圖 5 為病毒傳代 PCR 檢測，M.DNA Marker DL 2000; 1-6.分別代表 PCV2 I, 4，8，12，16，20代;7.陰性對照；
圖6為系列稀釋法不意圖；
圖 7 為 L8 細胞 PCVl 檢測，M.DNA Marker DL 2000; 1.PCVl PCR 產物;2.L8 細胞;
3.陰性對照。
【具體實施方式】
[0010]一種豬圓環(huán)病毒II型毒株，豬圓環(huán)病毒II型(Circoviridae)，CCTCC NO:V201312。
[0011]一豬圓環(huán)病毒II型PCV2/HZ09株的分離鑒定及全基因組序列分析 I材料和方法
1.1試驗材料
2009年8月采自鄭州某豬場疑似斷奶后多系統衰竭綜合征豬的淋巴結、肺臟和脾臟等組織。aq DNA聚合酶、DL2000 DNA Marker、pMD18_T載體、Χ-gal (5_溴_4_氯 _3_吲哚-β-D半乳糖苷)和IPTG(異丙基-β-D-硫代半乳糖)等購自寶生物工程(大連)有限公司；膠回收試劑盒購于BioTeke公司；RPMI Medium 1640、新生牛血清購自索萊寶公司；兔抗豬IgG-FITC, D-Glucosamine購自Sigma公司；特異性抗PCV2抗血清購自VMRD公司。
[0012]1.2引物設計
引物 P1/P2 參考文獻(Kim et al., 2003)(表 I)。引物 P3/P4 根據 GenBank 中 PCVl、PCV2核苷酸序列，利用01ig06.0設計。引物P1/P2和P3/P4分別用于PCV2的PCR檢測和全基因組的擴增。引物由上海生物工程服務有限公司合成。
[0013]表I PCV2檢測引物和全基因擴增引物
【權利要求】
1.一種豬圓環(huán)病毒II型毒株，其特征在于，豬圓環(huán)病毒II型(CiiXOViridae), CCTCCNO:V201312o`
【文檔編號】C12N7/00GK103436498SQ201310235414
【公開日】2013年12月11日 申請日期:2013年6月14日 優(yōu)先權日:2013年6月14日
【發(fā)明者】崔保安, 陳紅英, 盧權威, 郭官鵬, 郭敬, 李新生, 魏戰(zhàn)勇 申請人:河南農業(yè)大學