鼠尾椎間盤(pán)體外三維膠立體培養(yǎng)方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種鼠尾椎間盤(pán)體外三維膠立體培養(yǎng)方法，用PBS配制濃度為2wt%的瓊脂糖凝膠，與含10wt%FBS的DMEM培養(yǎng)液按體積比1：1混合形成三維培養(yǎng)膠；將從活體C57品系小鼠上剪切下來(lái)的鼠尾立即消毒并剝皮后投入PBS中清洗；在體視學(xué)顯微鏡下，剝除椎旁韌帶顯露椎間盤(pán)，沿上下軟骨終板完整的切下椎間盤(pán)，用PBS清洗；將前述三維培養(yǎng)膠鋪平培養(yǎng)皿，將椎間盤(pán)快速種植入三維培養(yǎng)膠內(nèi)，待凝固后再加入含10wt%FBS的DMEM培養(yǎng)液覆蓋表面，放入培養(yǎng)箱內(nèi)，每天更換含10wt%FBS的DMEM培養(yǎng)液一次。本發(fā)明適用于椎間盤(pán)組織工程學(xué)，椎間盤(pán)移植術(shù)以及藥物防治椎間盤(pán)退變等多方面的研究。
【專(zhuān)利說(shuō)明】鼠尾椎間盤(pán)體外三維膠立體培養(yǎng)方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種鼠尾椎間盤(pán)體外三維膠立體培養(yǎng)方法，該方法適用于椎間盤(pán)組織 工程學(xué)，椎間盤(pán)移植術(shù)以及藥物防治椎間盤(pán)退變等多方面的研究。

【背景技術(shù)】
[0002] 脊柱退變性疾病的病理基礎(chǔ)是椎間盤(pán)退變。它包括了頸椎病和腰椎間盤(pán)突出等疾 病，發(fā)病率逐年升高并嚴(yán)重危害中老年人的身體健康。通過(guò)退變產(chǎn)生的脊柱失穩(wěn)、椎管狹 窄刺激或壓迫肌肉、神經(jīng)根、血管和脊髓，甚至通過(guò)脊神經(jīng)反射影響內(nèi)臟功能。目前臨床治 療手段大部患者采用保守的對(duì)癥治療以拖延病情發(fā)作，少數(shù)患者手術(shù)治療摘除病變的椎間 盤(pán)。開(kāi)發(fā)針對(duì)病理環(huán)節(jié)的藥物需要有以椎間盤(pán)為對(duì)象的實(shí)驗(yàn)平臺(tái)支撐，由于缺少椎間盤(pán)細(xì) 胞株，而傳統(tǒng)二維平面培養(yǎng)的原代椎間盤(pán)細(xì)胞，難以保持其該有的生物學(xué)特性。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 針對(duì)傳統(tǒng)二維平面培養(yǎng)的上述不足，根據(jù)實(shí)施例，希望提出較好的保持了椎間盤(pán) 的生物學(xué)特性，可操作性強(qiáng)，成功率高的鼠尾椎間盤(pán)體外三維膠立體培養(yǎng)方法，在椎間盤(pán)移 植術(shù)以及藥物防治椎間盤(pán)退變的治療及研究方面具有廣闊的前景。
[0004] 根據(jù)實(shí)施例，本發(fā)明提供的一種鼠尾椎間盤(pán)體外三維膠立體培養(yǎng)方法，包括如下 步驟：
[0005] 用磷酸鹽緩沖液（縮寫(xiě) PBS，pH 值 7. 2 ?7. 4 :NaC1137mmol/L，KC12. 7mmol/L， Na2HP044. 3mmol/L，ΚΗ2Ρ041· 4mmol/L)緩沖液配制濃度為2wt%的瓊脂糖凝膠，與含10wt% 胎牛血清（Fetal Calf Serum，縮寫(xiě)FBS，Biowest公司訂購(gòu)）的細(xì)胞培養(yǎng)基（Dulbecco's Modified Eagle Medium，縮寫(xiě)DMEM，Biowest公司訂購(gòu)）培養(yǎng)液按體積比1 :1混合形成三 維培養(yǎng)膠；
[0006] 將從活體C57品系小鼠上剪切下來(lái)的鼠尾立即消毒并剝皮后投入PBS中清洗；在 體視學(xué)顯微鏡下，剝除椎旁韌帶顯露椎間盤(pán)，沿上下軟骨終板完整的切下椎間盤(pán)，用PBS清 洗；將前述三維培養(yǎng)膠鋪平培養(yǎng)皿，將椎間盤(pán)快速種植入三維培養(yǎng)膠內(nèi)，待凝固后再加入含 10wt%FBS的DMEM培養(yǎng)液覆蓋表面，放入培養(yǎng)箱內(nèi)，每天更換含10wt%FBS的DMEM培養(yǎng)液一 次。
[0007] 根據(jù)一個(gè)實(shí)施例，本發(fā)明前述鼠尾椎間盤(pán)體外三維膠立體培養(yǎng)方法中，進(jìn)一步包 括如下步驟：從培養(yǎng)箱內(nèi)取出培養(yǎng)皿，在37°C恒溫水平搖床內(nèi)以60rpm頻率搖晃，每次60 分鐘，每日早晚各一次，連續(xù)刺激兩天。
[0008] 隨后的實(shí)施例將證明，本發(fā)明方法成功的實(shí)現(xiàn)了鼠尾椎間盤(pán)的體外培養(yǎng)，克服了 傳統(tǒng)二維平面培養(yǎng)的缺點(diǎn)，較好的保持了椎間盤(pán)的生物學(xué)特性，本發(fā)明可操作性強(qiáng)，成功率 高。隨后的實(shí)施例通過(guò)多種技術(shù)方法：顯微鏡下連續(xù)觀察、模擬力學(xué)刺激、特殊病理切片染 色、PCR定量分析力生長(zhǎng)因子和膠原和蛋白等基因表達(dá)，最終證實(shí)了本發(fā)明方法成功的在體 外連續(xù)培養(yǎng)鼠尾椎間盤(pán)達(dá)12天。本發(fā)明方法適用于椎間盤(pán)組織工程學(xué)，椎間盤(pán)移植術(shù)以及 藥物防治椎間盤(pán)退變等多方面的治療及研究。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0009] 圖1為本發(fā)明鼠尾椎間盤(pán)體外三維膠立體培養(yǎng)的顯微解剖圖。
[0010] 圖2為本發(fā)明鼠尾椎間盤(pán)體外三維膠立體培養(yǎng)的椎間盤(pán)種植圖。
[0011] 圖3為本發(fā)明鼠尾椎間盤(pán)體外三維膠立體培養(yǎng)的連續(xù)觀察圖。
[0012] 圖4為本發(fā)明鼠尾椎間盤(pán)體外三維膠立體培養(yǎng)的病理切片藏紅固綠染色圖。
[0013] 圖5a為本發(fā)明鼠尾椎間盤(pán)體外三維膠立體培養(yǎng)的MGF原位雜交圖(椎間盤(pán)和纖維 環(huán)部分)。
[0014] 圖5b為本發(fā)明鼠尾椎間盤(pán)體外三維膠立體培養(yǎng)的MGF原位雜交圖(髓核和軟骨終 板部分)。
[0015] 圖6是IGF基因選擇性剪接示意圖(據(jù)此設(shè)計(jì)PCR引物和原位雜交的位點(diǎn)）。

【具體實(shí)施方式】
[0016] 本發(fā)明方法利用三維膠體外立體培養(yǎng)椎間盤(pán)細(xì)胞，以維持其生物學(xué)特性，方便實(shí) 驗(yàn)研究的目標(biāo)。下面結(jié)合附圖和具體實(shí)例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明鼠尾椎間盤(pán)體外三維膠立體 培養(yǎng)技術(shù)。這些實(shí)例應(yīng)理解為僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。在閱讀 了本實(shí)用鼠尾椎間盤(pán)體外三維膠立體培養(yǎng)技術(shù)記載的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本 發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等效變化和修飾同樣落入本實(shí)用鼠尾椎間盤(pán)體外三維膠立體 培養(yǎng)技術(shù)權(quán)利要求所限定的范圍。
[0017] 1、椎間盤(pán)體外培養(yǎng)三維膠的配制
[0018] PBS配制2wt%瓊脂糖，高溫高壓滅菌，趁熱分裝于50ml離心管，每管10ml室溫下 冷卻凝固，常溫保存。使用時(shí)在微波爐中火加熱lmin融化后，溫水中與10wt%FBS的DMEM 培養(yǎng)液按體積比1 :1溶合成三維培養(yǎng)膠待用。
[0019] 2、鼠尾椎間盤(pán)的顯微手術(shù)完整分離步驟
[0020] C57小鼠進(jìn)行腹腔10wt%水合氯醛麻醉后剪尾，皮膚酒精消毒，剝皮入PBS清洗3 次。如圖1所示在體視學(xué)顯微鏡下，剝除椎旁韌帶顯露椎間盤(pán)，沿上下軟骨終板完整的切下 椎間盤(pán)。PBS清洗后，如圖2所示將三維培養(yǎng)膠鋪平60mm培養(yǎng)皿，將椎間盤(pán)快速種植入膠 內(nèi)，待凝固后再加入含l〇wt%FBS的DMEM培養(yǎng)液覆蓋表面，放入培養(yǎng)箱內(nèi)，每天換液一次。隔 日拍照連續(xù)觀察如圖3所示，本實(shí)施例成功的在體外連續(xù)培養(yǎng)鼠尾椎間盤(pán)達(dá)12天。
[0021] 3、體外三維膠培養(yǎng)椎間盤(pán)給予生理量的力學(xué)刺激
[0022] 取出培養(yǎng)皿，37°C恒溫水平搖床內(nèi)以60rpm頻率搖晃，每次60分鐘，每日早晚各一 次，連續(xù)刺激兩天。離心力計(jì)算公式如下：G=R (1.118) (10-5) (RPM) / 2。
[0023] 說(shuō)明：離心半徑R = 10cm，轉(zhuǎn)速RPM=60,離心力G=0. 4倍重力加速度。正常人體 椎間盤(pán)呈微負(fù)壓狀態(tài)，正常狀態(tài)下受到的地球引力加速度是lg。根據(jù)離心力計(jì)算結(jié)果，本實(shí) 施例的力學(xué)刺激量是〇. 4g比較符合生理刺激量。
[0024] 4、椎間盤(pán)冰凍切片制作及藏紅固綠染色觀察
[0025] 將椎間盤(pán)組織從膠中取出，PBS清洗2次，用4wt%PFA固定1小時(shí)后PBS清洗2次， 然后經(jīng)10wt%、30wt%、50wt%濃度的蔗糖PBS溶液各3小時(shí)逐級(jí)沉淀后0TC膠包埋，負(fù)20°C 保存?zhèn)溆?。冰凍切片機(jī)，以lOum厚度連續(xù)切片，室溫晾干后，負(fù)20°C保存?zhèn)溆?。將冰凍切?取出晾干，蒸餾水洗，〇. lwt%固綠染液5min，lwt%冰醋酸快速漂洗，清水快速漂洗，0. 2wt% 藏紅染液5min，95wt%酒精蒸快速漂洗，常規(guī)脫水透明封片。結(jié)果如圖4所示，正常對(duì)照組 的椎間盤(pán)纖維環(huán)由纖維軟骨構(gòu)成，I型膠原含量高，可被固綠染液著色呈綠色，其間的纖維 軟骨細(xì)胞由于其在細(xì)胞周?chē)南莞C中分泌蛋白多糖，可以被藏紅染液著色呈紅色，結(jié)果（圖 4第一排）可以見(jiàn)到板層狀排列的膠原纖維環(huán)及散在其間紅色的纖維軟骨細(xì)胞，其結(jié)構(gòu)緊 密，排列整齊，細(xì)胞分有均勻。軟骨終板因含關(guān)節(jié)軟骨，蛋白多糖含量較高，因此著色呈紅 色。髓核細(xì)胞靠分泌大量的蛋白多糖來(lái)維持水分，因此是椎間盤(pán)組織中著色最紅的部分，結(jié) 構(gòu)疏松呈網(wǎng)狀。力學(xué)刺激組，結(jié)果（圖4第二排)可見(jiàn)，纖維環(huán)膠原排列整齊，結(jié)構(gòu)緊密，軟骨 細(xì)胞分布均勻。軟骨終板完整，髓核紅染較深。退變誘導(dǎo)組，結(jié)果（圖4第三排）可見(jiàn)，纖維 環(huán)排列不齊，結(jié)構(gòu)疏松，軟骨終板空隙增加，髓核著色力下降。
[0026] 5、椎間盤(pán)細(xì)胞外基質(zhì)中軟骨膠原和蛋白及其代謝相關(guān)酶基因表達(dá)的相對(duì)定量PCR 分析(表1)
[0027] 表1小鼠引物序列

【權(quán)利要求】
1. 一種鼠尾椎間盤(pán)體外三維膠立體培養(yǎng)方法，其特征是，包括如下步驟： 用磷酸鹽緩沖液PBS配制濃度為2wt%的瓊脂糖凝膠，與含10wt%胎牛血清FBS的細(xì)胞 培養(yǎng)基DMEM培養(yǎng)液按體積比1 :1混合形成三維培養(yǎng)膠； 將從活體C57品系小鼠上剪切下來(lái)的鼠尾立即消毒并剝皮后投入PBS中清洗；在體 視學(xué)顯微鏡下，剝除椎旁韌帶顯露椎間盤(pán)，沿上下軟骨終板完整的切下椎間盤(pán)，用PBS清 洗；將前述三維培養(yǎng)膠鋪平培養(yǎng)皿，將椎間盤(pán)快速種植入三維培養(yǎng)膠內(nèi)，待凝固后再加入含 10wt%FBS的DMEM培養(yǎng)液覆蓋表面，放入培養(yǎng)箱內(nèi)，每天更換含10wt%FBS的DMEM培養(yǎng)液一 次。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的鼠尾椎間盤(pán)體外三維膠立體培養(yǎng)方法，其特征是，進(jìn)一步包 括如下步驟：從培養(yǎng)箱內(nèi)取出培養(yǎng)皿，在37°C恒溫水平搖床內(nèi)以60rpm頻率搖晃，每次60 分鐘，每日早晚各一次，連續(xù)刺激兩天。
【文檔編號(hào)】C12N5/071GK104232562SQ201310241689
【公開(kāi)日】2014年12月24日 申請(qǐng)日期:2013年6月18日 優(yōu)先權(quán)日:2013年6月18日
【發(fā)明者】李晨光, 王擁軍, 趙永見(jiàn), 施杞, 楊燕萍, 牛凱 申請(qǐng)人:上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院