含豬圓環(huán)病毒2型細(xì)胞的培養(yǎng)方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及含豬圓環(huán)病毒2型細(xì)胞的培養(yǎng)方法，該方法包括單個含豬圓環(huán)病毒2型PK15細(xì)胞克隆及其亞群的培養(yǎng)：將PCV2/SN07-12種毒接種于無1型豬圓環(huán)病毒污染的豬腎細(xì)胞(PK15細(xì)胞)中，PCV2/SN07-12種毒的微生物保藏登記號為：CCTCC NO：V201304，陽性含豬圓環(huán)病毒2型PK15細(xì)胞克隆株的篩選、高滴度豬圓環(huán)病毒2型的增殖三個步驟，培養(yǎng)得到病毒滴度達(dá)107.0TCID50/ml。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明培養(yǎng)得到的細(xì)胞具有工藝簡單、病毒滴度高、生物學(xué)特性穩(wěn)定等優(yōu)點。
CCTCC NO:V201304
2013.03.15
【專利說明】含豬圓環(huán)病毒2型細(xì)胞的培養(yǎng)方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于病毒細(xì)胞的培養(yǎng)方法，尤其是涉及含豬圓環(huán)病毒2型細(xì)胞的培養(yǎng)方法。

【背景技術(shù)】
[0002]以豬圓環(huán)病毒2型(Porcine Circovirus type2，PCV2)為主要致病因子引起的疾病統(tǒng)稱為豬圓環(huán)病毒病(PCV2_associated disease，PCVAD)。目前，PCVAD已在全世界范圍內(nèi)發(fā)生與流行，是危害養(yǎng)豬生產(chǎn)的嚴(yán)重傳染病之一。對于PCV2造成的相關(guān)疾病尚無有效的預(yù)防措施，使用PCV2抗原制成的疫苗在豬圓環(huán)病毒病的預(yù)防中初見成效。隨著針對PCV2引起的相關(guān)疫苗、診斷試劑和治療方法的形成與發(fā)展，需要有效可靠的方法來獲取足量的PCV2病毒。目前，對PCV2的培養(yǎng)都建立在豬腎PK15細(xì)胞系上。由于PCV2體外培養(yǎng)不產(chǎn)生細(xì)胞病變，病毒增殖能力差，病毒毒價低，病毒含量通常低于105_°TCID5(l/ml，因此該培養(yǎng)方法的病毒含毒量難以滿足制備疫苗的要求。
[0003]國內(nèi)多家單位研究通過對PK15母細(xì)胞進行有限稀釋和細(xì)胞克隆，得到對PCV2具有高敏感性的細(xì)胞系，其它類型的細(xì)胞系進行有限稀釋和細(xì)胞克隆的報道也不少。目前關(guān)于該病毒毒價的研究主要技術(shù)路線是采用D-氨基葡萄糖處理細(xì)胞增強病毒的增殖能力，或者采用病毒在細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)傳代，使分離株隨細(xì)胞傳代次數(shù)的遞增，病毒滴度有所升高；但研制周期長，工藝復(fù)雜，產(chǎn)品質(zhì)量較難控制，成本較高，不利于規(guī)模化生產(chǎn)價格合理的疫苗。目前，國內(nèi)外尚無通過含豬圓環(huán)病毒2型的PK15細(xì)胞進行有限稀釋和細(xì)胞克隆進行培養(yǎng)豬圓環(huán)病毒2型的報道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的就是為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷而提供一種工藝簡單、病毒滴度高、生物學(xué)特性穩(wěn)定的含豬圓環(huán)病毒2型細(xì)胞的培養(yǎng)方法。
[0005]本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn):
[0006]含豬圓環(huán)病毒2型細(xì)胞的培養(yǎng)方法，包括以下步驟:
[0007](I)單個含豬圓環(huán)病毒2型PK15細(xì)胞克隆及其亞群的培養(yǎng)
[0008]將PCV2/SN07-12種毒接種于無I型豬圓環(huán)病毒污染的豬腎細(xì)胞(PK15細(xì)胞)中并在37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，使用胰酶消化處于對數(shù)生長期的單層含豬圓環(huán)病毒2型的PKl5細(xì)胞，然后采用有限稀釋法，按照每孔10uL含20wt% (請審核修改)牛血清細(xì)胞生長液，0.5個細(xì)胞/孔的密度，加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板置于含5vt% CO2，溫度為37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，挑選有單個細(xì)胞生長的細(xì)胞孔中細(xì)胞進行亞克隆培養(yǎng)，使用胰酶消化后，加入牛血清細(xì)胞生長液，再加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板置于含5vt% CO2，溫度為37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h ；
[0009](2)陽性含豬圓環(huán)病毒2型PK15細(xì)胞克隆株的篩選
[0010]取長滿單層96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，棄去培養(yǎng)液，PBS洗滌細(xì)胞3次，經(jīng)無水乙醇在-20°C固定2h，封閉液洗滌I次，再利用封閉液在37°C作用30min，加入PCV2抗血清，37°C作用45min，PBS洗滌細(xì)胞3次后，加入熒光標(biāo)記A蛋白(FITC-SPA)，37°C作用45min，洗滌3次后加加封片液(Mounting-Fluid)，于熒光顯微鏡下觀察特異性熒光細(xì)胞，以未接毒的正常PK15細(xì)胞作為陰性對照，挑選熒光數(shù)量最多的克隆株為豬圓環(huán)病毒2型高感染性的PK15細(xì)胞亞群，重復(fù)克隆一次，每次克隆均需做感染比例檢測，對含豬圓環(huán)病毒2型PK15細(xì)胞株進行純化后獲得含PCV2高感染比例的PK15-Ag細(xì)胞系。
[0011](3)高滴度豬圓環(huán)病毒2型的增殖
[0012]利用胰酶消化含PCV2高感染比例的PK15-A8細(xì)胞系并接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)，加入含7wt%-10wt%犢牛血清的DMEM營養(yǎng)液，在37°C培養(yǎng)24h，棄生長液，加入含2wt%犢牛血清的DMEM維持液，于37°C培養(yǎng)72-96h，收獲細(xì)胞培養(yǎng)物，凍融3次，既得到高滴度豬圓環(huán)病毒2型，IFA方法測定的病毒滴度達(dá)107_°TCID5(l/ml。
[0013]步驟(I)中所述的PCV2/SN07-12種毒為圓環(huán)病毒屬豬圓環(huán)病毒2型(PorcineCircovirus Type2)的微生物保藏登記號為:CCTCC NO:V201304其微生物保藏號是:CCTCCNO:V201114 ;保藏時間:2013.3.15 ;保藏單位:中國典型培養(yǎng)物保藏中心，CHINA CENTERFOR TYPE CULTURE COLLECT1N(CCTCC);保藏地址:湖北省武漢市武昌區(qū)武漢大學(xué)保藏中心(武漢大學(xué)第一附屬小學(xué)對面)。
[0014]步驟(2)中獲得含PCV2高感染比例的PK15-A8細(xì)胞系于_196°C保存。
[0015]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點:
[0016](I)工藝簡單:種細(xì)胞擴大培養(yǎng)收獲液即為疫苗的原液，與傳統(tǒng)PCV2疫苗制備方法相比省去生產(chǎn)工藝中的種毒復(fù)壯、病毒接種吸附和采用D-氨基葡萄糖處理細(xì)胞等工藝；
[0017](2)病毒滴度高:病毒滴度達(dá)107_°TCID5Q/ml。
[0018](3)生物學(xué)特性穩(wěn)定:豬圓環(huán)病毒2型在PK15-A8細(xì)胞內(nèi)增殖穩(wěn)定，無外源微生物污染。

【具體實施方式】
[0019]下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進行詳細(xì)說明。
[0020]實施例
[0021]含豬圓環(huán)病毒2型細(xì)胞的培養(yǎng)方法，包括以下步驟:
[0022](I)單個含豬圓環(huán)病毒2型PK15細(xì)胞克隆及其亞群的培養(yǎng)
[0023]將PCV2/SN07-12種毒接種于無I型豬圓環(huán)病毒污染的豬腎細(xì)胞(PK15細(xì)胞)中并在37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，使用胰酶消化處于對數(shù)生長期的單層含豬圓環(huán)病毒2型的PKl5細(xì)胞，然后采用有限稀釋法，按照每孔10uL含20Wt%牛血清細(xì)胞生長液，0.5個細(xì)胞/孔的密度，加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板置于含5vt% CO2，溫度為37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，挑選有單個細(xì)胞生長的細(xì)胞孔中細(xì)胞進行亞克隆培養(yǎng)，使用胰酶消化后，加入牛血清細(xì)胞生長液，再加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板置于含5moL/LC02，溫度為37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h。
[0024](2)陽性含豬圓環(huán)病毒2型PK15細(xì)胞克隆株的篩選
[0025]取長滿單層96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，棄去培養(yǎng)液，PBS洗滌細(xì)胞3次，經(jīng)無水乙醇在-20°C固定2h，封閉液洗滌I次，再利用封閉液在37°C作用30min，加入PCV2抗血清，37°C作用45min，PBS洗滌細(xì)胞3次后，加入熒光標(biāo)記A蛋白(FITC-SPA)，37°C作用45min，洗滌3次后加加封片液(Mounting-Fluid)，于熒光顯微鏡下觀察特異性熒光細(xì)胞，以未接毒的正常PK15細(xì)胞作為陰性對照，挑選熒光數(shù)量最多的克隆株為豬圓環(huán)病毒2型高感染性的PK15細(xì)胞亞群，重復(fù)克隆一次，每次克隆均需做感染比例檢測，對含豬圓環(huán)病毒2型PK15細(xì)胞株進行純化后獲得含PCV2高感染比例的PK15-A8細(xì)胞系，在_196°C保存。
[0026](3)高滴度豬圓環(huán)病毒2型的增殖方法
[0027]利用胰酶消化含PCV2高感染比例的PK15-A8細(xì)胞系并接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)，加入含7wt%-10wt%犢牛血清的DMEM營養(yǎng)液，在37°C培養(yǎng)24h，棄生長液，加入含2wt%犢牛血清的DMEM維持液，于37°C培養(yǎng)72-96h，收獲細(xì)胞培養(yǎng)物，凍融3次，既得到高滴度豬圓環(huán)病毒2型，IFA方法測定的病毒滴度達(dá)107_°TCID5(l/ml。
[0028]對含高滴度豬圓環(huán)病毒2型PK15-A8細(xì)胞系的特性研究
[0029]1、細(xì)胞形態(tài)的研究
[0030]取等量的無豬圓環(huán)病毒2型PK15細(xì)胞、含豬圓環(huán)病毒2型PK15-A8克隆株細(xì)胞分別接種于24孔板，加入7wt% -10wt%犢牛血清的DMEM培養(yǎng)液，37°C培養(yǎng)48小時，待細(xì)胞長滿單層觀察其形態(tài)差異。兩株細(xì)胞形態(tài)差異不顯著。
[0031]2、細(xì)胞生長速度的研究
[0032]取IX 15個細(xì)胞接種于6孔板中培養(yǎng)，加入含7wt% -1Owt%犢牛血清的DMEM培養(yǎng)液，37°C培養(yǎng)，分別于第12h、24h、36h和48h取其中I孔細(xì)胞進行計數(shù)。與無豬圓環(huán)病毒2型PK15細(xì)胞相比，PK15-A8細(xì)胞生長速度相對變慢。
[0033]3、細(xì)胞生物學(xué)穩(wěn)定性的研究
[0034]將克隆篩選后的含豬圓環(huán)病毒2型的PK15-A8細(xì)胞傳代至第40代，選取第5、10、20、30、40代細(xì)胞鋪于96孔板，37°C培養(yǎng)72_96h后，用IFA方法檢測熒光數(shù)量，觀察不同代次間熒光數(shù)量的差異，以判定克隆的含豬圓環(huán)病毒2型的PK15-A8細(xì)胞增殖病毒特性是否穩(wěn)定。IFA測定結(jié)果表明豬圓環(huán)病毒2型在PK15-A8細(xì)胞內(nèi)增殖穩(wěn)定。
[0035]4、細(xì)胞外源病毒檢測的研究
[0036]取第5、10、20、30、40代含豬圓環(huán)病毒2型的PK15-A8細(xì)胞，提取培養(yǎng)物中的病毒總RNA，對PCVl、HCV、PPV、BVDV和PRV等病毒進行檢測，同時設(shè)定已知病毒對照。結(jié)果顯示，其它外源病毒均為陰性。
[0037]5、細(xì)胞支原體檢測的研究
[0038]取第5、10、20、30、40代含豬圓環(huán)病毒2型的PK15-A8細(xì)胞，按《中國獸藥典》附錄的方法，取細(xì)胞上清，按比例接種于支原體培養(yǎng)基中，同時設(shè)立陰性對照，于37°C培養(yǎng)5-7天。檢測結(jié)果表明該克隆株無支原體污染。
[0039]6、PCV2在克隆細(xì)胞株內(nèi)生長曲線的研究
[0040]取IX 15個細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞板，第24h、48h、72h、96h和120h收獲細(xì)胞上清，
用IFA方法測定病毒TCID5tl，重復(fù)3次。結(jié)果表明，含豬圓環(huán)病毒2型的PK15-A8細(xì)胞培養(yǎng)至72-96小時，病毒含量最高。
【權(quán)利要求】
1.含豬圓環(huán)病毒2型細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)單個含豬圓環(huán)病毒2型PK15細(xì)胞克隆及其亞群的培養(yǎng) 將PCV2/SN07-12種毒接種于無I型豬圓環(huán)病毒污染的豬腎細(xì)胞(PK15細(xì)胞)中并在37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，使用胰酶消化處于對數(shù)生長期的單層含豬圓環(huán)病毒2型的PK15細(xì)胞，然后采用有限稀釋法，按照每孔10uL含20Wt%牛血清細(xì)胞生長液，0.5個細(xì)胞/孔的密度，加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板置于含5vt% CO2，溫度為37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，挑選有單個細(xì)胞生長的細(xì)胞孔中細(xì)胞進行亞克隆培養(yǎng)，使用胰酶消化后，加入牛血清細(xì)胞生長液，再加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板置于含5vt% CO2，溫度為37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h ； (2)陽性含豬圓環(huán)病毒2型PK15細(xì)胞克隆株的篩選 取長滿單層96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，棄去培養(yǎng)液，PBS洗滌細(xì)胞3次，經(jīng)無水乙醇在_20°C固定2h，封閉液洗滌I次，再利用封閉液在37°C作用30min，加入PCV2抗血清，37°C作用45min，PBS洗滌細(xì)胞3次后，加入熒光標(biāo)記A蛋白(FITC-SPA)，37°C作用45min，洗滌3次后加封片液(Mounting-Fluid)，熒光顯微鏡下挑選熒光數(shù)量最多的克隆株為豬圓環(huán)病毒2型高感染性的PK15細(xì)胞亞群，重復(fù)克隆一次，對含豬圓環(huán)病毒2型PK15細(xì)胞株進行純化后獲得含PCV2高感染比例的PK15-A8細(xì)胞系； (3)高滴度豬圓環(huán)病毒2型的增殖 利用胰酶消化含PCV2高感染比例的PK15-A8細(xì)胞系并接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)，加入含7wt% -10wt%犢牛血清的DMEM營養(yǎng)液，在37°C培養(yǎng)24h，棄生長液，加入含2被％犢牛血清的DMEM維持液，于37°C培養(yǎng)72-96h，收獲細(xì)胞培養(yǎng)物，凍融3次，既得到高滴度豬圓環(huán)病毒2型。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的含豬圓環(huán)病毒2型細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟(I)中所述的PCV2/SN07-12種毒為圓環(huán)病毒屬豬圓環(huán)病毒2型(Porcine Circovirus Type2)的微生物保藏登記號為:CCTCC NO:V201304。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的含豬圓環(huán)病毒2型細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟(2)中獲得含PCV2高感染比例的PK15-A8細(xì)胞系于_196°C保存。
【文檔編號】C12N7/00GK104232563SQ201310241711
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2013年6月18日 優(yōu)先權(quán)日:2013年6月18日
【發(fā)明者】何錫忠, 李春華, 趙本進, 張春玲, 倪建平, 蔣鳳英, 彭麗英, 張婉華 申請人:上海佳牧生物制品有限公司, 上?？屏⑻剞r(nóng)科（集團）有限公司, 上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院