分子標(biāo)記輔助選育豇豆耐鼓粒品種的方法及其使用的pcr引物組的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及植物生物【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種分子標(biāo)記輔助選育豇豆耐鼓粒品種的方法。分子標(biāo)記輔助選育豇豆耐鼓粒品種的PCR引物組，該引物組的序列為上游引物：5'-TTTCCATGGTAAAATTTTTTACC-3'；下游引物：5'-CCATTCCAAGAACGATTTGGCT-3'。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是，1.苗期鑒定，減少工作量，節(jié)約成本；2.提高了選擇的準(zhǔn)確性。
【專利說明】分子標(biāo)記輔助選育豇豆耐鼓粒品種的方法及其使用的PCR
引物組
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及植物生物【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種分子標(biāo)記輔助選育豇豆耐鼓粒品種的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]長(zhǎng)紅豆unguiculatassp.sesquipedalis (L.) Verd.)隸屬蝶形花亞科
菜豆族(Trib.Phasoleae DC.) 5[豆屬(San'),是我國(guó)重要的夏季豆類
蔬菜之一。由于主要食用部分為嫩莢，莢壁肥厚、種籽小、條莢均勻一致成為長(zhǎng)豇豆商品嫩莢最重要的經(jīng)濟(jì)指標(biāo)之一。然而長(zhǎng)豇豆生產(chǎn)實(shí)際中常常遇到嫩莢發(fā)育過程中由于莢壁和種子的不均衡發(fā)育，特別是種子發(fā)育過早過快導(dǎo)致嫩莢在種子著生處凸起而其它區(qū)域凹陷的現(xiàn)象，稱之為鼓粒(附圖1)。嫩莢鼓粒嚴(yán)重影響嫩莢的外觀品質(zhì)，降低商品價(jià)值。豇豆嫩莢鼓粒的實(shí)質(zhì)是豆莢中種子發(fā)育過早過快，導(dǎo)致種子占整個(gè)豆莢的比例過高。育種和生產(chǎn)實(shí)踐表明，不同豇豆品種嫩莢鼓粒程度不同，選育和應(yīng)用不易鼓粒的品種對(duì)豇豆生產(chǎn)具有重要意義。
[0003]種子和果實(shí)的發(fā)育尤其是膨大和營(yíng)養(yǎng)積累主要受光合產(chǎn)物的分配與利用所調(diào)控。蔗糖是植物光合產(chǎn)物在植物組織間運(yùn)輸和分配的主要形式，它作為養(yǎng)分和信號(hào)分子在植物的生長(zhǎng)發(fā)育中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。研究表明，豆類作物嫩莢莢壁和種子對(duì)蔗糖的吸收和利用存在著顯著的競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，蔗糖在莢壁和種子間的分配、積累與代謝決定著種子在豆莢中所占的比例。蔗糖代謝與分配，包括韌皮部蔗糖卸載、蔗糖轉(zhuǎn)化為己糖，以及己糖積累的過程受到蔗糖合成酶、蔗糖轉(zhuǎn)化酶及蔗糖、己糖膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等眾多因素的調(diào)控。蔗糖在植物體內(nèi)必須先經(jīng)蔗糖合成酶和轉(zhuǎn)化酶分解為己糖后，才能用于植物的生長(zhǎng)和發(fā)育。
[0004]生理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)易鼓粒豇豆品種在嫩莢發(fā)育早期比不易鼓粒品種具有更高的種皮細(xì)胞壁蔗糖轉(zhuǎn)化酶(CWIN)活性和較高的胚細(xì)胞分裂活性。隨后，由于易鼓粒品種種皮CWIN活性和胚己糖/蔗糖比值的快速下降導(dǎo)致其胚更早結(jié)束細(xì)胞分裂期和更早進(jìn)入細(xì)胞膨大期，這是造成易鼓粒品種胚細(xì)胞具有更大體積的重要原因。因此，種皮CWIN在長(zhǎng)豇豆嫩莢鼓粒中發(fā)揮著重要的作用，可以作為耐鼓粒育種的靶標(biāo)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 針對(duì)豇豆耐鼓粒育種常規(guī)方法中單純依靠在田間進(jìn)行豆莢鼓粒性的目測(cè)或工具測(cè)量鑒定所存在的主觀性強(qiáng)、易受環(huán)境影響、耗時(shí)費(fèi)力、需要大量土地和人力資源等缺陷，本發(fā)明的一個(gè)目的是分子標(biāo)記輔助選育豇豆耐鼓粒品種的PCR引物組，本發(fā)明的另外一個(gè)目的是提供采用上述引物組分子標(biāo)記輔助選育豇豆耐鼓粒品種的方法。本發(fā)明的方法具有準(zhǔn)確、快捷的特點(diǎn)。
[0006]為了實(shí)現(xiàn)上述的第一個(gè)目的，本發(fā)明采用了以下的技術(shù)方案:
分子標(biāo)記輔助選育豇豆耐鼓粒品種的PCR引物組，該引物組的序列為上游引物:5’_TTTCCATGGTAAAATTTTTTACC -3’ ；下游引物:5’_ CCATTCCAAGAACGATTTGGCT -3，。
[0007]為了實(shí)現(xiàn)上述的第二個(gè)目的，本發(fā)明采用了以下的技術(shù)方案:
分子標(biāo)記輔助選育豇豆耐鼓粒品種的方法，其特征在于按以下步驟進(jìn)行:
1)豇豆基因組DNA的提取:將各待檢測(cè)豇豆樣品用CTAB法提取基因組DNA后，分別保存，備用； 2)基因組DNA的PCR擴(kuò)增:將豇豆各樣品基因組DNA20 ng，分別加入各PCR管中，并在各管中依次加入PCR引物組至終濃度各0.2 μ Μ, dNTP至終濃度0.25 mM,MgC12至終濃度2.0 mM,PCR緩沖液至終濃度為I倍，并加入Taq DNA聚合酶I單位，最后加無菌重蒸水補(bǔ)足體積至20 μ I后，在94°C預(yù)變性2 min，94°C變性30 sec，58°C退火30 sec，72°C延伸30sec，36個(gè)循環(huán)，72°C延伸5min下進(jìn)行擴(kuò)增，產(chǎn)物4°C保存；所述的引物組的序列為上游引物:5’_ TTTCCATGGTAAAATTTTTTACC -3’ ；下游引物:5’_ CCATTCCAAGAACGATTTGGCT -3’ ；
3)酶切產(chǎn)物的凝膠電泳分析:擴(kuò)增產(chǎn)物在8%非變性聚丙烯酰胺凝膠，上進(jìn)行電泳分離，然后銀染進(jìn)行顯色，數(shù)碼相機(jī)照相記錄結(jié)果；所述的非變性聚丙烯酰胺凝膠為丙烯酰胺:甲叉雙丙烯酰胺=29:1 ；
4)豇豆樣品耐鼓粒性的鑒定:依據(jù)PCR產(chǎn)物在凝膠上條帶的模式，凡擴(kuò)增產(chǎn)物為ISObp片段的材料即為含豇豆耐鼓?；蛐偷牟牧希膊荒塬@得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的材料即為含豇豆不耐鼓?；蛐偷牟牧?；
5)耐鼓粒表型復(fù)選:對(duì)上述經(jīng)分子標(biāo)記篩選的植株進(jìn)行正常水肥管理，待植株開花期每株選10朵花蕾進(jìn)行掛牌，掛牌10天后用游標(biāo)卡尺測(cè)量每條嫩莢的鼓粒程度，以每株10個(gè)嫩莢的平均值作為該株的鼓粒性程度值，去除由于標(biāo)記選擇誤差造成的假陽(yáng)性，并選留耐鼓粒性得到改善且農(nóng)藝性狀好的后代新株系。
[0008]本發(fā)明的有益效果是:
1.苗期鑒定，減少工作量，節(jié)約成本:本發(fā)明獲得了根據(jù)豇豆細(xì)胞壁蔗糖轉(zhuǎn)化酶基因上小片段缺失設(shè)計(jì)的PCR分子標(biāo)記，該標(biāo)記與豇豆耐鼓粒性關(guān)聯(lián)，可應(yīng)用于耐鼓?；虻妮o助轉(zhuǎn)育檢測(cè)；該方法具有檢測(cè)方便、揭示多態(tài)性能力穩(wěn)定、費(fèi)用低廉等優(yōu)點(diǎn)；用此標(biāo)記可在苗期檢測(cè)耐鼓粒基因的存在與否從而預(yù)測(cè)植株的耐鼓粒性，能在早期淘汰大量的不耐鼓粒分離后代，可以將后續(xù)移栽、管理、鑒定等的工作量壓力減少到最低限度。常規(guī)育成豇豆品種需6-8年的周期，應(yīng)用分子標(biāo)記輔助選擇育種，可以在同一時(shí)間內(nèi)分析多個(gè)品種，對(duì)給定世代的材料只需在苗期取樣1-2周時(shí)間就可以明確分離后代中目標(biāo)基因的存在與否，使新品種的選育能在3-4年內(nèi)完成，大大節(jié)省了人力和物力；
2.提高了選擇的準(zhǔn)確性:傳統(tǒng)育種方法需要對(duì)雜交后代的耐鼓粒性進(jìn)行田間或溫室逐個(gè)鑒定，由于嫩莢鼓粒表型易受環(huán)境的影響，表型鑒定常有一定的誤差，利用分子標(biāo)記進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)可以避免環(huán)境對(duì)嫩莢鼓粒表型的影響，準(zhǔn)確性得到較大提高。本方法在苗期應(yīng)用分子標(biāo)記檢測(cè)進(jìn)行初篩后又對(duì)中選植株在成株期進(jìn)行一次表型復(fù)查，進(jìn)一步提高了選擇的準(zhǔn)確性。
[0009]本發(fā)明特點(diǎn)(優(yōu)點(diǎn)或創(chuàng)新點(diǎn))是:
利用DNA序列小片段缺失與嫩莢鼓粒程度表型值間的顯著關(guān)聯(lián)開發(fā)分子標(biāo)記。苗期采用分子標(biāo)記選擇，檢測(cè)需DNA量少而方便快速，能在早期剔除大多數(shù)非目標(biāo)株，大大減少了后續(xù)田間工作量。分子標(biāo)記方法可以對(duì)大量種質(zhì)資源及其雜交、回交后代進(jìn)行分析，較快地從大量目標(biāo)株中選出育種親本材料，縮短育種的世代和時(shí)間。所有具有與“之121”細(xì)胞壁
蔗糖轉(zhuǎn)化酶基因上小片段缺失位點(diǎn)完全相同的耐鼓粒豇豆品系都可以用引物進(jìn)
行標(biāo)記輔助選擇。
[0010]
[0011]【具體實(shí)施方式】
[0012]本發(fā)明通過以下實(shí)施例作進(jìn)一步的詳細(xì)說明，但應(yīng)該理解本發(fā)明并不受以下內(nèi)容所限止。
[0013]實(shí)施例1:
特異區(qū)分豇豆耐鼓粒性的分子標(biāo)記及基于分子標(biāo)記的豇豆耐鼓粒性篩選方法，該方法包括以下的步驟:
(1)與豇豆耐鼓粒性關(guān)聯(lián)的分子標(biāo)記位點(diǎn)的篩選:用Qiagen公司的植物DNA小量提取試劑盒依說明書所述方法提取耐鼓粒程度各異的36份豇豆品系的DNA ;利用引物5’ -CACTTCAGAGGATGGTTGG -3’和 5’- CCTTTCTATCTTATCACTAAACTACC -3’擴(kuò)增豇豆細(xì)胞壁蔗糖轉(zhuǎn)化酶基因片段并進(jìn)行常規(guī)測(cè)序。對(duì)從各品系擴(kuò)增所獲序列進(jìn)行比對(duì)鑒定出長(zhǎng)度為4bp的小片段多態(tài)性位點(diǎn)P-VuCWIN ；
(2)將上述P-CWIN位點(diǎn)的基因型數(shù)據(jù)與同上所述36份豇豆品系在歷年田間調(diào)查中獲得的鼓粒程度值用Tassel軟件的MLM的混合線性模型進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，獲得該位點(diǎn)與鼓粒性狀的關(guān)聯(lián)性P值為0.04，符合P〈0.05的統(tǒng)計(jì)閾值，表明該標(biāo)記位點(diǎn)與豇豆耐鼓粒性顯著關(guān)聯(lián)。
[0014](3)特異性檢測(cè)引物產(chǎn)-Κ?Ο?ν的設(shè)計(jì):根據(jù)擴(kuò)增出的豇豆細(xì)胞壁蔗糖轉(zhuǎn)化酶基因片段設(shè)計(jì)跨越Indel-CWIN位點(diǎn)的上下游引物，序列如下:
上游引物:5’-TTTCCATGGTAAAATTTTTTACC -3’ ；
下游引物:5’-CCATTCCAAGAACGATTTGGCT -3’。
[0015](4)特異引物的PCR擴(kuò)增與電泳檢測(cè):擴(kuò)增產(chǎn)物在8%非變性聚丙烯酰胺凝膠(丙烯酰胺:甲叉雙丙烯酰胺=29:1)上進(jìn)行電泳分離，然后銀染進(jìn)行顯色，數(shù)碼相機(jī)照相記錄結(jié)果。凡擴(kuò)增產(chǎn)物為ISObp片段的材料即為含豇豆耐鼓粒基因型的材料；凡含豇豆不耐鼓?；蛐偷牟牧?，由于其基因序列與上游引物3’端末尾4個(gè)堿基中的3個(gè)不匹配，因此均不能獲得擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0016]實(shí)施例2
利用標(biāo)記-OSV輔助篩選“之121”和‘之豇282’耐鼓粒雜交后代(O不耐鼓粒主栽品種與耐鼓粒資源的雜交和回交:挑選飽滿的非耐鼓粒輪回親本(‘之豇282’，農(nóng)藝性狀好，易鼓粒)和耐鼓粒供體親本(“夕121，，’嫩莢不易鼓粒，但農(nóng)藝性狀較差)播于大田。待開花后進(jìn)行雜交，莢成熟后收取種子，即為Ei。次年將F1 (5粒左右即可)和輪回親本種子播于大田，待開花后進(jìn)行雜交，莢成熟后收取種子，即為SS1Ep第三年將BC1F1 (30粒左右)和輪回親本種子播于大田，待開花后進(jìn)行雜交，莢成熟后按株系收取種子，即為Se2-E1，每株系收20粒左右種子。
[0017](2)苗期分子標(biāo)記選擇:將上步獲得的600粒左右BC2F1分離后代種子，分單株播種于大田并逐一掛牌。種子發(fā)芽20天后取葉片樣0.1克，液氮中研磨成粉末，用CTAB法提取 DNA。首先配制 CTAB 緩沖液:100 mL I mo 1.171 Tris pH 7.5，140 mL 5 mo 1.171 NaCl,20 mL 0.5 mo 1.171 EDTA pH 8.0,740 mL MiliQ H2O, 20 g CTAB。DNA 提取時(shí)取 IOmg 的新鮮葉片放入研缽中，加入150 μ? CTAB緩沖液，用缽杵輕輕研磨，然后再加入150 μ? CTAB緩沖液混勻；65.?水浴40min ;加入300 ? 24:1氯仿/異戍醇,上下混勻5 min,使樣品與氯仿充分混和；13000 r.min—1離心5min ;取上清液150 μ?，加入在_20°C預(yù)冷的異丙醇200ML,輕輕上下顛倒混勻；10000-?2000 r.mirT1離心3~4 min,棄上清液；讓異丙醇揮發(fā)干凈，加入50-100 μ?含RNase的ddH20溶解DNA ;然后用1%的瓊脂糖電泳檢測(cè)。用本發(fā)明中的分子標(biāo)記講行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體積為25微升，其中IOXbuffer 2.5微升，25mM MgCl2 1.5微升，2.5mM dNTPs 2微升，Taq酶(5單位/微升)0.2微升，模板DNA 10納克，加水至25微升。PCR反應(yīng)體系為DNA 94°C預(yù)變性3min后，94°C變性30sec，58°C退火30sec，72°C延伸展30sec，循環(huán)35次，最后72°C延伸lOmin。在PTC-225擴(kuò)增儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物在8%非變性聚丙烯酰胺凝膠(丙烯酰胺:甲叉雙丙烯酰胺=29:1)上進(jìn)行電泳分離，然后銀染進(jìn)行顯色，數(shù)碼相機(jī)照相記錄結(jié)果。凡擴(kuò)增產(chǎn)物為ISObp片段的材料即為含豇豆耐鼓粒基因型的材料予以保留，凡不能獲得擴(kuò)增產(chǎn)物的材料即為含豇豆不耐鼓?；蛐偷牟牧嫌枰詠G棄。
[0018](3)成株期表型復(fù)選:對(duì)經(jīng)上步分子標(biāo)記篩選的植株進(jìn)行正常水肥管理。植株開花期每株選10朵花蕾進(jìn)行掛牌，掛牌10天后用游標(biāo)卡尺測(cè)量每條嫩莢的鼓粒程度，以每株10個(gè)嫩莢的平均值作為該株的鼓粒性程度值。結(jié)合各株農(nóng)藝性狀，選擇耐鼓粒性強(qiáng)且農(nóng)藝性狀優(yōu)異的單株，自交獲得BC3F2，即為理論上農(nóng)藝性狀較優(yōu)、耐鼓粒性得到改善且基因型較為純合的新品系。
[0019](4)結(jié)果與分析:通過對(duì)14株經(jīng)分子標(biāo)記分析提示所攜細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶基因?yàn)槟凸牧；蛐偷姆蛛x后代進(jìn)行田間鼓粒程度的鑒定 ，按公式:鼓粒程度(%) = (LI L2)/L2 X100%計(jì)算鼓粒程度；結(jié)果表明有11株鼓粒程度〈30%為耐鼓粒，3株為不耐鼓粒，表明分子標(biāo)記檢測(cè)的準(zhǔn)確率在78%以上。再通過耐鼓粒表型復(fù)選和農(nóng)藝性狀篩選以彌補(bǔ)標(biāo)記輔助選擇的誤差，最后獲得了 I個(gè)耐鼓粒優(yōu)良新品系，命名為“FK3-1”。
【權(quán)利要求】
1.分子標(biāo)記輔助選育豇豆耐鼓粒品種的PCR引物組，其特征在于:該引物組的序列為上游引物:5’- TTTCCATGGTAAAATTTTTTACC -3’ ；下游引物:5’-CCATTCCAAGAACGATTTGGCT-3'。
2.分子標(biāo)記輔助選育豇豆耐鼓粒品種的方法，其特征在于按以下步驟進(jìn)行: .1)豇豆基因組DNA的提取:將各待檢測(cè)豇豆樣品用CTAB法提取基因組DNA后，分別保存，備用; . 2)基因組DNA的PCR擴(kuò)增:將豇豆各樣品基因組DNA20 ng，分別加入各PCR管中，并在各管中依次加入權(quán)利要求1所述的PCR引物組至終濃度各0.2 μ Μ, dNTP至終濃度0.25mM，MgCl2至終濃度2.0 mM，PCR緩沖液至終濃度為I倍，并加入Taq DNA聚合酶I單位，最后加無菌重蒸水補(bǔ)足體積至20 μ I后，在94°C預(yù)變性2 min，94°C變性30 sec，58°C退火:30 sec，72°C延伸30sec，36個(gè)循環(huán)，72°C延伸5min下進(jìn)行擴(kuò)增，產(chǎn)物4°C保存； . 3)酶切產(chǎn)物的凝膠電泳分析:擴(kuò)增產(chǎn)物在8%非變性聚丙烯酰胺凝膠，上進(jìn)行電泳分離，然后銀染進(jìn)行顯色，數(shù)碼相機(jī)照相記錄結(jié)果；所述的非變性聚丙烯酰胺凝膠為丙烯酰胺:甲叉雙丙烯酰胺=29:1 ； . 4)豇豆樣品耐鼓粒性的鑒定:依據(jù)PCR產(chǎn)物在凝膠上條帶的模式，凡擴(kuò)增產(chǎn)物為ISObp片段的材料即為含豇豆耐鼓?；蛐偷牟牧希膊荒塬@得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的材料即為含豇豆不耐鼓?；蛐偷牟牧希?. 5)耐鼓粒表型復(fù)選:對(duì)上述經(jīng)分子標(biāo)記篩選的植株進(jìn)行正常水肥管理，待植株開花期每株選10朵花蕾進(jìn)行掛牌，掛牌10天后用游標(biāo)卡尺測(cè)量每條嫩莢的鼓粒程度，以每株10個(gè)嫩莢的平均值作為該株的鼓粒性程度值，去除由于標(biāo)記選擇誤差造成的假陽(yáng)性，并選留耐鼓粒性得到改善且農(nóng)藝性狀好的后代新株系。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103468791SQ201310287714
【公開日】2013年12月25日 申請(qǐng)日期:2013年7月10日 優(yōu)先權(quán)日:2013年7月10日
【發(fā)明者】汪寶根, 吳曉花, 魯忠富, 徐沛, 李國(guó)景, 劉永華, 胡耀文 申請(qǐng)人:浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院