一株產(chǎn)α-葡聚糖酶的畢赤酵母工程菌及其培養(yǎng)方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一株產(chǎn)α-葡聚糖酶的畢赤酵母工程菌及其培養(yǎng)方法。所述畢赤酵母工程菌KM1已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC?M?2013096。本發(fā)明的菌株在250mL三角瓶中搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)和在5L發(fā)酵罐中流加發(fā)酵培養(yǎng)，α-葡聚糖酶產(chǎn)量分別達(dá)到200U/mL和1100U/mL，其產(chǎn)酶能力相對于已報道的產(chǎn)α-葡聚糖酶菌種處于領(lǐng)先水平。且其培養(yǎng)方法簡單，產(chǎn)酶能力強(qiáng)，實驗重復(fù)性好，遺傳特性穩(wěn)定，是一種適合高密度發(fā)酵產(chǎn)α-葡聚糖酶的優(yōu)良菌種。
【專利說明】一株產(chǎn)a-葡聚糖酶的畢赤酵母工程菌及其培養(yǎng)方法【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體涉及一株產(chǎn)a -葡聚糖酶的畢赤酵母工程菌及其培養(yǎng)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]a -葡聚糖酶(Dextranase, 1，6_ a-D-glucan-6-glucanohydrolase ;EC3.2.1.11)也被稱為右旋糖酐酶，能夠隨機(jī)水解葡聚糖中的a-1，6糖苷鍵，終產(chǎn)物包括異麥芽糖、異麥芽三糖和葡萄糖以及痕量的多聚糖。a-葡聚糖酶分為兩類，內(nèi)切a-葡聚糖酶(endodextranases)水解葡聚糖內(nèi)部的糖苷鍵；外切a -葡聚糖酶(exodextranases)從葡聚糖的非還原端切割，終產(chǎn)物一般為葡萄糖、異麥芽糖或異麥芽三糖等。反應(yīng)產(chǎn)物和底物特異性與酶的類型有很大關(guān)系。眾多微生物都可產(chǎn)a-葡聚糖酶，包括青霉、曲霉、細(xì)麗毛殼、鐮刀霉菌、申克孢子絲菌、斯達(dá)油脂酵母、口腔擬桿菌、嗜熱厭氧桿菌、鏈球菌等[1]。
[0003]目前商品化的α-_葡聚糖酶主要是通過青霉屬iPenicillium)和毛殼屬i—等真菌的培養(yǎng)物得到。由于真菌產(chǎn)酶的同時還會產(chǎn)生抗生素和其它有害代謝物，成為葡聚糖酶通過FDA (美國食品和藥物管理局)認(rèn)證的一個障礙。與此同時，利用基因工程菌生產(chǎn)外源蛋白也極具發(fā)展前景。在a-葡聚糖酶的基因克隆和異源蛋白表達(dá)方面，大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)和畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)均有報道。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)雖然具有操作方便，培養(yǎng)簡易的特點(diǎn)，但是發(fā)酵細(xì)胞密度不高，獲取表達(dá)蛋白需要破碎細(xì)胞，蛋白容易形成包涵體，給純化分離，變性復(fù)性帶來困難。目前a-葡聚糖酶的研究進(jìn)展主要集中在甲醇誘導(dǎo)型畢赤酵母工程菌產(chǎn)外源a-葡聚糖酶。甲醇酵母基因表達(dá)系統(tǒng)是一種最近發(fā)展迅速的外源蛋白質(zhì)生產(chǎn)系統(tǒng)。甲醇酵母是可利用甲醇作為唯一碳源的酵母，其中巴斯德畢赤酵母/7ZcAia Pastoris的基因操作相對簡單、外源蛋白的超高量表達(dá)、易于工業(yè)化生產(chǎn)、能夠完成真核系統(tǒng)蛋白的蛋白水解成熟、糖基化修飾和二硫鍵形成等翻譯后的修飾加工過程。畢赤酵母表達(dá)載體分為游離型載體和整合型載體兩種，目前整合型載體應(yīng)用較廣，其中大部分屬于醇氧化酶AOX啟動子調(diào)控的甲醇誘導(dǎo)型載體，少部分如PGAPZ和pGAPZ a屬于三磷酸甘油醛脫氫酶GAP啟動子調(diào)控的組成型載體[2’ 3]。近年來，Chen等用5L發(fā)酵罐培養(yǎng)獲得了 83.9 U/mL的酶活[4]，Kang HK等用IOL發(fā)酵罐取得了 134 U/mL的酶活[5]。
[0004]近年來，中國酶制劑產(chǎn)業(yè)發(fā)展速度迅猛，取得了明顯進(jìn)步。但從世界范圍內(nèi)看，基于基因工程和蛋白質(zhì)工程的高科技成果在酶制劑生產(chǎn)領(lǐng)域中已實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化，為酶制劑產(chǎn)業(yè)帶來了革命性的發(fā)展。高新技術(shù)的應(yīng)用進(jìn)一步拉大了中國酶制劑產(chǎn)業(yè)和世界先進(jìn)水平的差距，尤其體現(xiàn)在國內(nèi)相關(guān)企業(yè)研發(fā)投入和研發(fā)創(chuàng)新能力不足，酶制劑產(chǎn)品結(jié)構(gòu)不合理、應(yīng)用深度不夠，缺少高端酶制劑產(chǎn)品。中國酶制劑產(chǎn)業(yè)的下一步快速發(fā)展有賴于強(qiáng)有力的自主技術(shù)創(chuàng)新體系。利用a-葡聚糖酶制得的酶制劑或添加劑將是一種無毒無害，環(huán)境溫和友好型的綠色催化制品，該酶在制糖工業(yè)、日用品行業(yè)、醫(yī)療領(lǐng)域具有較好的應(yīng)用前景。因此，提供一株產(chǎn)a -葡聚糖酶能力處于領(lǐng)先水平的畢赤酵母工程菌，具有實際的應(yīng)用價值。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一株產(chǎn)a -葡聚糖酶的畢赤酵母工程菌及其培養(yǎng)方法。
[0006]本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是:
一株產(chǎn)a-葡聚糖酶的畢赤酵母工程菌KMlO0ZcAia Pastoris KMl )，已于2013年3月21日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址:中國，武漢，武漢大學(xué)，保藏編號為CCTCC NO:M 2013096。
[0007]畢赤酵母工程菌KMl在生產(chǎn)a -葡聚糖酶上的應(yīng)用。
[0008]畢赤酵母工程菌KMl的搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)方法，包括將畢赤酵母工程菌KMl接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，28-30°C，轉(zhuǎn)速轉(zhuǎn)速200-250r/min，培養(yǎng)96-120h ;所述發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為:酵母粉8-12g/L,蛋白胨15-25g/L,2-6%(w/v)甘油。
[0009]優(yōu)選的，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為:酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L，5%(w/v)甘油。
[0010]畢赤酵母工程菌KMl的發(fā)酵罐流加培養(yǎng)方法，包括如下步驟:
(1)將畢赤酵母工程菌KMl接種至發(fā)酵罐中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為:溫度25-30°C，PH5.0-7.0，溶氧量大于10%，發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為:在BSM培養(yǎng)基中加入10-14 mL/L的PTM1微量鹽溶液及3-6%(w/v)的甘油；
(2)待甘油含量低于0.3%時，起始甘油流加，通過甘油流加維持溶氧在10-30%之間進(jìn)行發(fā)酵；
(3)持續(xù)培養(yǎng)90-100h即可。
[0011]優(yōu)選的，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為:在BSM培養(yǎng)基中加入12 mL/L的PTM1微量鹽溶液及5%(w/v)的甘油；
一種酶制劑，其含有保藏編號為CCTCC NO:M 2013096的畢赤酵母工程菌KMl {PichiaPastoris KMl)的發(fā)酵培養(yǎng)物,或者該發(fā)酵培養(yǎng)物中的菌體,或者該發(fā)酵培養(yǎng)物中的上清液。
[0012]本發(fā)明的有益效果是:
本發(fā)明的菌株在250mL三角瓶中搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)和在5L發(fā)酵罐中流加發(fā)酵培養(yǎng)，a -葡聚糖酶產(chǎn)量分別達(dá)到200 U/mL和1100 U/mL，其產(chǎn)酶能力相對于已報道的產(chǎn)a -葡聚糖酶菌種處于領(lǐng)先水平。且其培養(yǎng)方法簡單，產(chǎn)酶能力強(qiáng)，實驗重復(fù)性好，遺傳特性穩(wěn)定，是一種適合高密度發(fā)酵產(chǎn)a-葡聚糖酶的優(yōu)良菌種。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0013]圖1為a -葡聚糖酶酶活和酵母濕重變化關(guān)系。
【具體實施方式】
[0014]下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，但并不局限于此。
[0015]實施例1 一株組成型表達(dá)a -葡聚糖酶的畢赤酵母工程菌的構(gòu)建
1.實驗材料
朱黃著霉1iPenicillium minioluteuni)購自中國普通微生物菌種保藏管理中心,保藏號為CGMCC N0.35723。該菌株中含有a -葡聚糖酶基因，其基因序列如G1:3821900(GenBank登錄號)所示。畢赤酵母KM71H購自Invitrogen公司。[0016]2.實驗方法
具體步驟如下:
(I)以朱黃青霉QPeniciIlium minioluteum)基因組DNA為模板，擴(kuò)增得到a _葡聚糖酶基因，經(jīng)酶切，連接，構(gòu)建得到重組表達(dá)質(zhì)粒pGAPZ a A-dex,經(jīng)測序驗證，序列正確。
[0017](2)表達(dá)載體pGAPZ a A-dex使用AvrII單酶切，使之線性化，電擊轉(zhuǎn)化感受態(tài)畢赤酵母KM71H，在含有博來霉素(Zeocin)的YPD平板上篩選得到陽性克隆。
[0018](3)從陽性克隆菌落中挑選出產(chǎn)酶較高的一株，命名為PicAiaKM1。已于2013年3月21日送交中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏(CHINA CENTER FOR TYPE CULTURECOLLECTION, CCTCC)，地址:中國，武漢，武漢大學(xué)，保藏編號:CCTCC NO:M 2013096。
[0019]實施例2
一種制備a-葡聚糖酶的方法(搖瓶發(fā)酵培養(yǎng))，其步驟如下: (1)培養(yǎng)基成分:酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L,3%(w/v)甘油；
(2)接種:將實施例1所挑選的畢赤酵母工程菌CCTCCNO:M 2013096接種到上述培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為:250 mL三角瓶中裝液量30 mL，溫度30°C，轉(zhuǎn)速200r/min ；
(3)培養(yǎng)96小時后測定培養(yǎng)液中a-葡聚糖酶酶活為150U/mL。
[0020]酶活定義為:1單位酶活(U/mL)表示為ImL酶液在pH為5.0，溫度45°C下，I min分解a -葡聚糖(dextran) T-2000產(chǎn)生相當(dāng)于Iiimol葡萄糖的還原糖量。下同。
[0021]實施例3
一種制備a-葡聚糖酶的方法(搖瓶發(fā)酵培養(yǎng))，其步驟如下:
(1)培養(yǎng)基成分:酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L,5%(w/v)甘油；
(2)接種:將畢赤酵母工程菌CCTCCNO:M 2013096接種到上述培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為:250mL三角瓶中裝液量40mL，溫度30°C，轉(zhuǎn)速250 r/min ；
(3)培養(yǎng)120小時后測定培養(yǎng)液中右旋糖酐酶酶活為200U/mL。
[0022]實施例4
一種制備a-葡聚糖酶的方法(發(fā)酵罐流加培養(yǎng))，其步驟如下:
(1)培養(yǎng)基成分:在BSM培養(yǎng)基(Invitrogen公司)中加入12mL/L的PTM1微量鹽溶液及5%(w/v)的甘油；
(2)接種:將實施例1所挑選的畢赤酵母工程菌株KMl接種到上述培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為:溫度25-30°C，pH5.0-6.0，溶氧量大于10% ；
(3)待甘油含量低于0.3%時，起始甘油流加，通過甘油流加維持溶氧在10-20%之間進(jìn)行發(fā)酵；培養(yǎng)92小時后測定培養(yǎng)液中a -葡聚糖酶酶活為1100U/mL ；
(4)分離提純a-葡聚糖酶:采用離心、過濾的方法分離細(xì)胞，然后濃縮發(fā)酵液、選擇適當(dāng)超濾膜截流、進(jìn)行低溫噴霧干燥或載體吸附，得到a -葡聚糖酶。
[0023]為除去發(fā)酵過程中產(chǎn)生的泡沫，可以在培養(yǎng)基組成分中添加一定量的消泡劑，如添加0.02%泡敵。
[0024]取實施例4的發(fā)酵液上清，測a-葡聚糖酶酶活和酵母濕重變化關(guān)系，測定結(jié)果如圖1所示。
[0025]以上實施例僅為介紹本發(fā)明的優(yōu)選案例，對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，在不背離本發(fā)明精神的范圍內(nèi)所進(jìn)行的任何顯而易見的變化和改進(jìn)，都應(yīng)被視為本發(fā)明的一部分。[0026] 參考文獻(xiàn)
[1]Khalikova E, Susi P，Korpela T.Microbial dextran-hydrolyzingenzymes: fundamentals and applications[J].Microbiol Mol Biol Rev, 2005，69(2):306-325.[2]Qin X，Qian J，Yao G，et al.GAP promoter library for fine-tuningof gene expression in Pichia pas tor is [J].Appl Environ Microbiol, 2011， 77(11):3600-3608.[3]Zhang A-Lj Luo J-Xj Zhang T-Yj et al.Recent advances on the GAPpromoter derived expression system of Pichia pastor is [J].Molecular BiologyReports, 2009，36 (6):1611-1619.[4]Chen L， Zhou X， Fan W， et al.Expression, purification andcharacterization of a recombinant Lipomyces starkey dextranase in Pichiapastor is [J].Protein Expr Purif, 2008，58 (I):87-93.[5]Kang HKj Park JYj Ahn JSj et al.Cloning of a gene encoding dextranasefrom Lipomyces starAeyi and its expression in Pichia pastoris[J].J MicrobiolBiotechnol， 2009， 19 (2):172-177。
【權(quán)利要求】
1.一株產(chǎn)a-葡聚糖酶的畢赤酵母工程菌KMl，已于2013年3月21日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO:M 2013096。
2.權(quán)利要求1所述的工程菌KMl在生產(chǎn)a-葡聚糖酶上的應(yīng)用。
3.權(quán)利要求1所述的工程菌KMl的搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)方法，包括將畢赤酵母工程菌KMl接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，28-30°C，轉(zhuǎn)速轉(zhuǎn)速200-250r/min，培養(yǎng)96-120h ;所述發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為:酵母粉8-12g/L，蛋白胨15-25g/L，2-6%(w/v)甘油。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)方法，其特征在于，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為:酵母粉10g/L,蛋白胨20g/L, 5%(w/v)甘油。
5.權(quán)利要求1所述的工程菌KMl的發(fā)酵罐流加培養(yǎng)方法，包括如下步驟: (1)將畢赤酵母工程菌KMl接種至發(fā)酵罐中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為:溫度25-30°C，PH5.0-7.0，溶氧量大于10%，發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為:在BSM培養(yǎng)基中加入10-14 mL/L的PTM1微量鹽溶液及3-6%(w/v)的甘油； (2)待甘油含量低于0.3%時，起始甘油流加，通過甘油流加維持溶氧在10-30%之間進(jìn)行發(fā)酵； (3)持續(xù)培養(yǎng)90-100h即可。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的發(fā)酵罐流加培養(yǎng)方法，其特征在于，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為:在BSM培養(yǎng)基中加入12 mL/L的PTM1微量鹽溶液及5%(w/v)的甘油。
7.一種酶制劑，其含有保藏編號為CCTCC NO:M 2013096的畢赤酵母工程菌KMl的發(fā)酵培養(yǎng)物，或者該發(fā)酵培養(yǎng)物中的菌體，或者該發(fā)酵培養(yǎng)物中的上清液。
【文檔編號】C12N9/46GK103451114SQ201310287727
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2013年7月9日 優(yōu)先權(quán)日:2013年7月9日
【發(fā)明者】梁達(dá)奉, 曾練強(qiáng), 黃曾慰, 蟻細(xì)苗, 吳兆鵬, 李錦榮, 李雨虹, 張遠(yuǎn)平, 馬步, 林榮珍, 柳穎, 常國煒 申請人:廣州甘蔗糖業(yè)研究所, 廣西農(nóng)墾糖業(yè)集團(tuán)股份有限公司