一種重組磁螺菌及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種重組磁螺菌及其構(gòu)建方法。具體為首先構(gòu)建丟失了磁小體膜蛋白基因的趨磁細菌突變株，然后將一個磁小體膜蛋白基因與一個功能性蛋白基因進行基因融合，連接到pMD18-T Simple Vector上，轉(zhuǎn)化入E.coli DH5α感受態(tài)細胞，構(gòu)建得到重組質(zhì)粒。通過本發(fā)明方法構(gòu)建得到的重組磁螺菌可用于合成表面展示有功能性蛋白的磁小體，所述磁小體可以很容易地與抗體，乃至核酸、糖類、脂類、非抗體蛋白等功能性蛋白相連，形成具有特定功能的磁性復合體，該復合體既能夠用于磁性分離，還可以組裝成特定結(jié)構(gòu)的磁性材料或構(gòu)件。
【專利說明】一種重組磁螺菌及其應用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種磁螺菌，具體地說，涉及一種合成功能化磁小體的重組磁螺菌及 其應用。

【背景技術(shù)】
[0002] 趨磁細菌（Magnetotactic bacteria, MTB)是水生原核生物的一個多系類群 (polyphyletic group),有球狀、卵狀、桿狀、弧狀和螺旋狀等形狀,可以是單細胞,也可以 是多細胞，一般具有端生或雙生鞭毛。在系統(tǒng)發(fā)育上屬于變形桿菌門（Proteobacteria)的 α _ 變形桿菌綱（Alphaproteobacteria)、δ -變形桿菌綱（Deltaproteobacteria)、Y -變 形桿菌綱（Gammaproteobacteria)和硝化螺旋菌門（Nitrospirae)。
[0003] 趨磁細菌可以從環(huán)境中吸收大量的鐵，形成一種特殊的細胞器，其內(nèi)部含有一個 單磁疇的四氧化三鐵（Fe 3O4)或四硫化三鐵（Fe3S4)的晶體，外部有脂類和蛋白組成的單位 膜包被，稱為磁小體。不同的菌株可以合成不同形狀的磁小體，具有種專一性。磁小體主要 有平截八面體、棱柱狀、子彈狀、箭頭狀、齒狀等，直徑30?120nm。在細胞內(nèi)，磁小體通常高 度有序地排列成一條或幾條鏈，形成一個或多個"小磁針"，從而使菌體可以感知外界磁場。
[0004] 磁小體的形成過程屬于生物礦化（biomineralization)，其整個過程多在50nm左 右的泡囊內(nèi)進行，受到嚴格的生物調(diào)控，條件溫和，產(chǎn)物為單磁疇晶體，粒徑均一、晶形穩(wěn) 定，在同類材料中磁性最強，是名副其實的"納米工廠（Nanofactory)"。同時，磁小體有單 位膜包被，與裸露的磁性材料相比，易于分散，目前尚無法人工模擬。
[0005] 由于氧化鐵磁性顆粒（磁珠）已經(jīng)廣泛用于磁性分離、固定化酶、食品檢測、環(huán)境 監(jiān)測、醫(yī)學診斷、造影劑、磁共振成像、磁熱療、靶向治療、磁性記錄材料等許多領(lǐng)域，因此， 成分與之類似的磁小體也受到了學者的關(guān)注。研究表明，不同趨磁細菌形成的磁小體形狀 多樣，而同一種趨磁細菌合成的磁小體大小、晶型、磁學性質(zhì)均一，且由于有單位膜包被，磁 小體相對容易分散，是理想的三維納米磁性材料。同時，磁小體膜上含有大量的磷脂酰乙醇 胺，可提供豐富的氨基，用于偶聯(lián)功能性的分子，便于對磁小體的化學修飾。
[0006] 日本學者松永是（Tadashi Matsunaga)利用雙功能交聯(lián)劑分別嘗試了將酶、抗 體、核酸等連接在磁小體上，構(gòu)建成磁性復合物，用于固定化酶，富集和檢測血液中的蛋 白、食品中的病原菌、環(huán)境中的有害物質(zhì)等。我們也用類似的方法建立了對7種沙門氏菌 (Salmonella)、大腸桿菌（Escherichia coli) 0157、乙肝抗原 HBsAg、禽白血病病毒（Avian Leukosis Virus)、葡萄扇葉病毒（Grapevine fanleaf virus)、李環(huán)斑壞死病毒（Prunus necrotic ringspot virus)、菌麻毒素（Ricin)和腸毒素（Enterotoxin)的檢測方法。從理 論上講，市售磁珠多為微米級的多磁疇顆粒或球體（如Dynabeads),其磁性（矯頑力）小于 磁小體，當前者用于磁性分離時，效果應遜于磁小體。但實際上，二者的在檢測或診斷方面 的測試靈敏度相仿。分析上述實驗可以看出，這些實驗主要是利用抗體的氨基與磁小體相 連，而這些氨基更多地分布于其氮末端，這也正是抗體與抗原結(jié)合的區(qū)域（Fab)，如果Fab 與磁小體偶聯(lián)，則無法再去結(jié)合抗原，從而造成抗體活性的損失。同時，在上述方法中，磁小 體與抗體偶聯(lián)，仍然需要通過昂貴的雙功能試劑，沒有發(fā)揮出磁小體作為生物材料的優(yōu)勢。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是提供一種重組磁螺菌的構(gòu)建方法。
[0008] 本發(fā)明的另一目的是利用重組磁螺菌合成具有不同功能的磁小體。
[0009] 為了實現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
[0010] 本發(fā)明提供了一種重組質(zhì)粒，所述重組質(zhì)粒是將一個磁小體膜蛋白基因與一個功 能性蛋白基因進行基因融合，構(gòu)建重組質(zhì)粒；
[0011] 其中，磁小體膜蛋白基因為mamC、mmsl3或mamF ;功能性蛋白基因為spa、beep或 msa〇
[0012] 本發(fā)明還提供了一種含有上述重組質(zhì)粒的重組磁螺菌的構(gòu)建方法，其特征在于， 步驟如下：
[0013] 1)構(gòu)建趨磁細菌突變株；
[0014] 2)構(gòu)建得到上述的重組質(zhì)粒；
[0015] 3)將步驟2)得到的重組質(zhì)粒導入步驟1)得到的趨磁細菌突變株，構(gòu)建重組磁螺 菌。
[0016] 具體地，所述步驟1)還包括以下步驟：
[0017] (1)通過PCR擴增趨磁細菌磁小體膜蛋白基因的上游長約Ikb的基因序列記作S 片段，下游長約Ikb的基因序列記作X片段；
[0018] (2)將所述兩個片段和0.8kb的慶大霉素（Gm)抗性基因片段定向克隆到自殺載體 PUX19的多克隆位點，構(gòu)建成重組自殺質(zhì)粒pUX19-S-Gm-X ;優(yōu)選地，所述的磁小體膜蛋白基 因為mamC或mamF ;
[0019] (3)用抗性基因置換磁小體膜蛋白基因的片段以實現(xiàn)同源雙交換，得到丟失了磁 小體膜蛋白基因的趨磁細菌突變株。
[0020] 當磁小體膜蛋白基因為mamC時，S片段如SEQ ID No. 1所示，X片段如SEQ ID No. 2 所示。
[0021] 當磁小體膜蛋白基因為mamF時，S片段如SEQ ID No. 3所示，X片段如SEQ ID No. 4 所示。
[0022] 本發(fā)明還提供了上述的構(gòu)建方法的步驟1)得到的趨磁細菌突變株。
[0023] 本發(fā)明還提供了上述的構(gòu)建方法得到的重組磁螺菌。
[0024] 本發(fā)明還提供了利用一種表面展示有功能性蛋白的磁小體，所述磁小體通過上述 重組磁螺菌合成。
[0025] 本發(fā)明還提供了上述磁小體在與功能性蛋白相連、磁性分離或組裝成特定結(jié)構(gòu)的 磁性材料中的應用。
[0026] 所述磁小體易與抗體，乃至核酸、糖類、脂類、非抗體蛋白等功能性蛋白相連，形成 具有特定功能的磁性復合體，該復合體既能夠用于磁性分離，還可以組裝成特定結(jié)構(gòu)的磁 性材料或構(gòu)件。
[0027] 磁小體上展示有SpA蛋白，該蛋白可與多數(shù)哺乳動物抗體的碳末端（Fe)結(jié)合，F(xiàn)e 端遠離抗體與抗原結(jié)合的部分（antigen binding fragment，F(xiàn)ab片段，位于氮末端），可以 有效地形成磁小體-抗體復合物，而不會影響抗體的活性（滴度），以這種復合物為載體，用 磁性免疫分離的方法富集相應的抗原，提高監(jiān)測和診斷的靈敏度。
[0028] 磁小體上展示有重組單體鏈霉親和素（SA)，SA可以特異性地與生物素（biotin) 迅速、高效、牢固地結(jié)合，從而可以使磁小體與生物素化的蛋白、核酸、糖類、脂類結(jié)合，形成 復合體，執(zhí)行相應的功能；
[0029] 磁小體上展示有生物素分子。由于天然的鏈霉親和素是四聚體，可以結(jié)合4個生 物素分子，這些磁小體可以占據(jù)鏈霉親和素的1?2個生物素結(jié)合位點，則剩余的位點可與 生物素化的蛋白、核酸、糖類、脂類結(jié)合，形成磁小體復合體，執(zhí)行相應的功能；還可以與展 示有重組單體鏈霉親和素的磁小體組裝成特定的膠體晶體結(jié)構(gòu)。
[0030] 本發(fā)明的優(yōu)勢在于建立了磁小體表面展示技術(shù)，通過磁小體膜蛋白的融合表達， 分別將SpA蛋白、鏈霉親和素、生物素展示在磁小體的表面。使磁小體可以很容易地抗體， 乃至核酸、糖類、脂類、非抗體蛋白等功能性蛋白相連，形成具有特定功能的磁性復合體，既 能夠用于磁性分離，還可以組裝成特定結(jié)構(gòu)的磁性材料或構(gòu)件。

【具體實施方式】
[0031] 以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。
[0032] 實施例1
[0033] M. gryphiswaldense MSR-1 的 mamC 突變株和 mamF 突變株的構(gòu)建
[0034] 通過構(gòu)建重組質(zhì)粒，分別用PCR擴增的方法，將mamC基因上、下游長約Ikb的片段 (分別記作s、X片段，S片段如SEQ ID No. 1所示，X片段如SEQ ID No. 2所示），將這兩個 片段和0. 8kb的慶大霉素（Gm)抗性基因片段定向克隆到自殺載體pUX19的多克隆位點，構(gòu) 建成重組自殺質(zhì)粒pUX19-MamC-S-Gm-X，再通過同源雙交換將mamC基因片段用抗性基因置 換下來。具體步驟如下：
[0035] 1、分別用引物 mamC-S-F-Xba I /mamC-S-R-Kpn I 和 mamC-X-F-Kpn I / mamC-X-R-Pst I擴增mamC基因上、下游區(qū)域（以全基因組方向來看其上下游），電泳分離 擴增產(chǎn)物，切膠回收，然后連接到PMD18-T Simple Vector【購自TaKaRa寶生物工程(大連） 有限公司】上，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌（E.c〇li)DH5a感受態(tài)細胞【購自普洛麥格（北京）生物技 術(shù)有限公司】。經(jīng)PCR驗證正確后，分別命名為重組質(zhì)粒pT-MamC-S和pT-MamC-X，測序，確 定上下游基因的正確性。
[0036] 其中，引物 mamC-S-F-Xba I 如 SEQ ID No. 5 所示；
[0037] 引物 mamC-S-R-Kpn I 如 SEQ ID No. 6 所示；
[0038] 引物 mamC-X-F-Kpn I 如 SEQ ID No. 7 所示；
[0039] 引物 mamC-X-R-Pst I 如 SEQ ID No. 8 所示。
[0040] 2、分別用內(nèi)切酶Xba I /Kpn I和Kpn I /Pst I (內(nèi)切酶XbaI購自TaKaRa公司， 1500U，Code D1093A ;內(nèi)切酶KpnI 購自 TaKaRa 公司，5000U，1068A ;內(nèi)切酶PstI 購自 TaKaRa 公司，3000U，D1073A)雙酶切重組質(zhì)粒pT-MamC-S和pT-MamC-X，以獲得mamC基因上、下游片 段（分別記作S、X片段）。再以內(nèi)切酶Xba I /Pst I雙酶切自殺載體pUX19,以獲得該質(zhì)粒 的其開環(huán)片段；并用內(nèi)切酶Kpn I單酶切抗性質(zhì)粒pUC-Gm，以獲得慶大霉素（Gm)抗性基因 片段。分別電泳分離酶切后的產(chǎn)物，并切膠回收目的片段：mamC基因的上下游片段mamC-S 和mamC-X、抗性片段Gm和自殺載體pUX19。用T4DNA連接酶(購自TIANGEN公司，目錄號： RT406,60u)連接上述酶切后得到的四個片段，構(gòu)建成重組自殺質(zhì)粒pUX19-MamC-S-Gm-X。
[0041] 3、將上述自殺質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E. coli S17-1感受態(tài)細胞，并在慶大霉素和卡那霉 素（Km)雙抗性平板上篩選陽性克隆。用菌落PCR篩選，以獲得Gm基因反向插入的突變 株，避免Gm片段插入后對下游基因的表達產(chǎn)生影響，即極性效應的產(chǎn)生。命名為E. coli S17-1 (pUX19-MamC-S-Gm-X)。
[0042] 4、將菌株E. coli S17-l(pUX19-MamC-S-Gm-X)作為供體菌與MSR-I野生型分別做 接合實驗，接合后菌液涂布在Gm和萘啶酮酸（Nx)雙抗性平板上篩選。所得菌落，如在Km抗 性平板上不生長，而在Gm抗性標記的抗性平板上生長良好，可初步鑒定為雙交換突變株。
[0043] 5、將抗性篩選得到的雙交換突變株進行菌落PCR復篩驗證。具體過程是：在mamC 基因內(nèi)部設計一對引物mamC-F和mamC-R，PCR擴增，驗證mamC基因是否被替換掉；同時還 需在引物mamC-S-F-Xba I所在基因之前設計引物mamC-F-F，在引物mamC-X-R-Pst I所在 基因之后設計引物mamC-R-R，驗證上下游臂是否交換正確。提取所得突變株的基因組，進一 步驗證菌株是否污染了野生型，并且要通過PCR擴增確保磁小體島上的其它基因如mamA、 mamP、mamS、mamR、mamB 等沒有丟失，即得 AmamC 突變株 Μ· gryphiswaldense MamC (菌株 1)。
[0044] 6、同法通過引物 mamF-S-Dl-Kpn I 如 SEQ ID No. 13 所示；引物 mamF-S-D2-Pst I 如 SEQ ID No. 14 所示；引物 mamF-X-Gl-Xba I 如 SEQ ID No. 15 所示；引物 mamF-X-G2_Kpn I 如 SEQ ID No. 16 所不。可得 AmamF 突變株 M.gryphiswaldense MamF(菌 株2)
[0045] 實施例2spa基因、beep基因的獲得和重組單體msa基因的構(gòu)建
[0046] 培養(yǎng)金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus) ATCC6538,提取其全基因組為模 板，用引物Spa-LF (如SEQ ID No. 9所示）和Spa-RB (如SEQ ID No. 10所示)，擴增得到全 長spa基因。其中，引物Spa-LF包含Linker序列（Gly4Ser) 3，引物Spa-RB包含BamHI酶 切位點。
[0047] 如上法提取磁螺菌野生型菌株MSR-I的基因組DNA，以之作為模板，用引物BCCP-F (如SEQ ID No. 11所示）和BCCP-R (如SEQ IDNo. 12所示）擴增得到生物素羧基載體蛋白 基因 beep。其中，引物BCCP-F包含Linker序列（Gly4Ser)3，引物BCCP-R包含XbaI酶切位 點。
[0048] 根據(jù)野生型阿維丁鏈霉菌（Streptomyces avidinii)鏈霉親和素基因（sa)序列， 我們將其編碼55位纈氨酸、76位蘇氨酸、109位亮氨酸和125位纈氨酸的密碼子GTC、ACG、 CTG、GTC分別更換為ACA、AGA、ACA、AGA，則其對應的四個氨基酸，即分別更換為蘇氨酸、精 氨酸、蘇氨酸和精氨酸（即T76R，V125R，V55T，L109T)，同時在起始密碼子前面加上了一段 Linker序列（Gly4Ser)3。把改造后得到的重組單體片段命名為msa，該片段由上海英濰捷 基生物技術(shù)有限公司合成，其蛋白產(chǎn)物命名為MSA片段。
[0049] 實施例3各融合蛋白基因的構(gòu)建
[0050] 含有MamC與單體鏈霉親和素融合蛋白基因的表達質(zhì)粒pMamC-MSA的構(gòu)建，具體步 驟如下：
[0051] 1、用野生型MSR-I基因組作為模板，以mamC-expl-Kpnl作為上游引物，mamC_exp2 作為下游引物擴增mamC基因。切膠回收，然后連接到pMD18-T Simple Vector上，轉(zhuǎn)化入 E. coli DH5a感受態(tài)細胞，PCR驗證并測序正確后，將所得重組質(zhì)粒命名為pT-MamC-exp。
[0052] 2、以pT-MamC-exp和重組單體鏈霉親和素片段MSA同時作為模板，用 mamC-expl-Kpnl作為上游引物，MSA-EcoRI作為下游引物，進行融合PCR，以獲得mamC基因 與msa基因的融合片段，瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收，然后連接到pMD18-T Simple Vector 上，轉(zhuǎn)化入E.coliDH5a感受態(tài)細胞，PCR驗證并測序正確后，將所得重組質(zhì)粒命名為 pT-MamC-MSA。
[0053] 3、提質(zhì)粒pT-MamC-MSA，用內(nèi)切酶KpnI/EcoRI雙酶切，獲得MamC-MSA融合基因片 段，兩端酶切位點為KpnI和EcoRI ;質(zhì)粒pBBRlMCS-2 (美國五大湖生物能源研究中心發(fā)酵 實驗室，張耀平先生贈送)也用內(nèi)切酶KpnI/EcoRI雙酶切，獲得pBBRlMCS-2開環(huán)片段，兩端 酶切位點為KpnI和EcoRI。將上述兩種酶切體系經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，回收，再用T4DNA連 接酶連接，命名為重組質(zhì)粒pMamC-SA。通過轉(zhuǎn)化入E. coli DH5a感受態(tài)細胞，PCR驗證、酶 切，并測序，以該質(zhì)粒驗證含有MamC與MSA融合蛋白基因。
[0054] 同法,可構(gòu)建重組質(zhì)粒pMamC-Spa和pMamC-BCCP。
[0055] 與上述方法類似，可分別擴增mamF和mmsl3基因，并構(gòu)建成重組質(zhì)粒pMmsl3_MSA、 pMmsl3_BCCP、pMms13-Spa、pMamF-MSA、pMamF-BCCP、pMamF-Spa。
[0056] 實施例4重組磁螺菌的構(gòu)建
[0057] 將含有 mamC 或 mmsl3 的質(zhì)粒 pMamC-MSA、pMamC-SpA、pMamC-BCCP、pMmsl3_MSA、 pMmsl3-BCCP、pMmsl3_Spa 分別導入菌株 I [M. gryphiswaldense MSR-I 的 mamC 缺失突變株 (Δ mamC)]，得到重組磁螺菌 M. gryphiswaldense MamC-SpA (菌株 3)、MamC-MSA (菌株 4)、 MamC-BCCP (菌株 5)、Mmsl3-SpA (菌株 6)、Mmsl3-MSA (菌株 7)、Mmsl3-BCCP (菌株 8);將含有 mamF 基因的質(zhì)粒 pMamF-MSA、pMamF-BCCP、pMamF-Spa 分別導入菌株 2 [M. gryphiswaldense MSR-I 的 mamF 缺失突變株（Δ mamF)]，即得菌株 M. gryphiswaldense MamF-SpA (菌株 9)、 MamF-MSA (菌株 10)、MamF-BCCP (菌株 11)。詳見表 1 :
[0058] 表1本發(fā)明中構(gòu)建的菌株
[0059]

【權(quán)利要求】
1. 一種重組質(zhì)粒，其特征在于，所述重組質(zhì)粒是將一個磁小體膜蛋白基因與一個功能 性蛋白基因進行基因融合，連接到PMD18-T Simple Vector上，轉(zhuǎn)化入E.coli DH5a感受 態(tài)細胞，構(gòu)建得到重組質(zhì)粒； 其中，磁小體膜蛋白基因為mamC、mmsl3或mamF ;功能性蛋白基因為spa、bccp或msa。
2. 含有權(quán)利要求1的重組質(zhì)粒的重組磁螺菌的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟如下： 1) 構(gòu)建趨磁細菌突變株； 2) 構(gòu)建權(quán)利要求1所述的重組質(zhì)粒； 3) 將步驟2)得到的重組質(zhì)粒導入步驟1)得到的趨磁細菌突變株，構(gòu)建重組磁螺菌。
3. 如權(quán)利要求2所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述步驟1)包括如下步驟： (1) 通過PCR擴增趨磁細菌磁小體膜蛋白基因的上游長約lkb的基因序列記作S片段， 下游長約lkb的基因序列記作X片段； (2) 將所述兩個片段和0.8kb的慶大霉素（Gm)抗性基因片段定向克隆到自殺載體 PUX19的多克隆位點，構(gòu)建成重組自殺質(zhì)粒pUX19-S-Gm-X ; (3) 用抗性基因置換磁小體膜蛋白基因的片段以實現(xiàn)同源雙交換，得到丟失了磁小體 膜蛋白基因的趨磁細菌突變株。
4. 如權(quán)利要求3所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述的磁小體膜蛋白基因為mamC或 mamF。
5. -種趨磁細菌突變株，其特征在于，所述趨磁細菌突變株是由權(quán)利要求2或3所述的 構(gòu)建方法的步驟1)構(gòu)建得到的。
6. 如權(quán)利要求2所述的重組磁螺菌的構(gòu)建方法構(gòu)建得到的重組磁螺菌。
7. -種表面展示有功能性蛋白的磁小體，其特征在于，所述磁小體通過權(quán)利要求6所 述的重組磁螺菌合成。
8. 權(quán)利要求7所述的磁小體在與功能性蛋白相連、磁性分離或組裝成特定結(jié)構(gòu)的磁性 材料中的應用。
【文檔編號】C12R1/01GK104278048SQ201310291562
【公開日】2015年1月14日 申請日期:2013年7月11日 優(yōu)先權(quán)日:2013年7月11日
【發(fā)明者】田杰生, 胡俊英, 徐俊, 王旭, 李麗, 劉凌子, 錢欣欣, 姜偉, 李穎, 李季倫 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學