一種純化fitc標(biāo)記的蝦白斑綜合癥病毒（wssv）的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及病毒學(xué)與免疫學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，特別是涉及一種純化FITC標(biāo)記的蝦白斑綜合癥病毒（WSSV）的方法。將經(jīng)FITC標(biāo)記的蝦白斑綜合癥病毒混合液利用分子篩柱進行純化；收集含有FITC標(biāo)記的WSSV的洗脫液，即得到純化的可視化WSSV；其中，分子篩柱填料為G-25M，洗脫液為PBS緩沖液。采用本發(fā)明可以較為簡便地制備純化的可視化WSSV，整個過程不需要借助高速離心機，也不需要反復(fù)離心去除上清再重懸，操作簡便、省時、對儀器依賴度低，最終純化完畢的WSSV仍然具有與蝦類細胞的結(jié)合活性,可以用于進一步深入研究。
【專利說明】一種純化FITC標(biāo)記的蝦白斑綜合癥病毒(WSSV)的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及病毒學(xué)與免疫學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，特別是涉及一種純化FITC標(biāo)記的對蝦白斑綜合癥病毒(WSSV)的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]對奸白斑綜合癥病毒(White Spot Syndrome Virus,又稱WSSV)是當(dāng)前中國對蟲下養(yǎng)殖業(yè)危害最重的病害，其侵染宿主的過程和機理一直是研究熱點。目前對于WSSV侵染過程的研究多局限于個體水平，在細胞層面上的研究甚為缺乏，急需有可視化的WSSV作為實驗工具來促進研究。
[0003]使用異硫氰酸突光素(fluorescein isothiocyanate, FITC)標(biāo)記病毒并運用于研究已經(jīng)在其他病毒中實現(xiàn)。Benne，CA等人利用FITC標(biāo)記的流感病毒(H3N2)證明了其表面活性蛋白A而非表面活性蛋白D是大鼠巨噬細胞吞噬H3N2的調(diào)理素(CornelisA.Benne, Barry Benaissa-Trouw, Jos A.G.Van Strijp, Cornells A.Kraaijeveld, J.FreekF.Van Iwaarden.Surfactant protein A, but not surfactant protein D, is an opsoninfor influenza A virus phagocytosis by rat alveolar macrophages.European Journalof Immunology, 27 (1997)，886-890)。Joan E.Nichols 等人還利用 FITC 標(biāo)記的流感病毒作為表征，對單核巨噬細胞和淋巴細胞在流式細胞儀上進行分離(Joan E.Nichols1D.J.Mock, N.J.Roberts.Use of FITC-1abeled influenza virus and flow cytometryto assess binding and internalization of virus by monocytes-macrophages andlymphocytes.Archives of Virology, 130 (1992),441-455.)。
[0004]目前已有文獻報道，通過FITC標(biāo)記的WSSV開展個例研究。Li等首先報道了使用FITC標(biāo)記研究β -1ntegrin在WSSV侵染斑節(jié)對奸血細胞中發(fā)揮的作用(Deng-FengLi, Ming-Chang Zhang, Ha1- Jie Yang, Yan-Bing Zhu, Xun Xu.2007.β -1ntegrin mediatesWSSV infection.Virology, 368 (2007), 122-132.XWu 等在研究沉默Rab GTPases 后對于斑節(jié)對蝦血細胞吞噬能力的影響中也使用了 FITC標(biāo)記的WSSV。以上2篇文獻中使用的FITC標(biāo)記法都是先將WSSV與FITC混合孵育，然后通過三次高速離心(10，000 X g，IOmin)去除上清，再加入 TM buffer 重懸(50mM/L Tris-HCl, 10mM/L MgC12，ρΗ7.6)分離帶有標(biāo)記的WSSV與游離的FITC，純化過程繁瑣、耗時長，并且需要使用高速離心機。
[0005]分子篩是一種具網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的天然或人工合成的化學(xué)物質(zhì)。如交聯(lián)葡聚糖、沸石等，當(dāng)作為層析介質(zhì)時，可按分子大小對混合物進行分級分離。通過本發(fā)明，可以更為簡便地純化FITC標(biāo)記的WSSV，為研究WSSV在細胞水平上的侵染過程提供幫助。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種純化FITC標(biāo)記的對蝦白斑綜合癥病毒(WSSV)的方法。
[0007]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為:[0008]一種純化FITC標(biāo)記的蝦白斑綜合癥病毒(WSSV)的方法，將經(jīng)FITC標(biāo)記的蝦白斑綜合癥病毒混合液利用分子篩柱進行純化；收集含有FITC標(biāo)記的WSSV的洗脫液，即得到純化的可視化WSSV ;其中，分子篩柱填料為G-25M，洗脫液為PBS緩沖液。
[0009]進一步地說，將經(jīng)FITC標(biāo)記的蝦白斑綜合癥病毒混合液轉(zhuǎn)移至裝填有G-25M分子篩填料的分子篩柱，整個過程用PBS作為洗脫液，并依靠重力進行洗脫；收集含有FITC標(biāo)記的WSSV的洗脫液，即得到純化的可視化WSSV ;其中，裝填有G-25M分子篩填料的分子篩柱先經(jīng)2倍柱體積的PBS清洗。
[0010]所述FITC標(biāo)記的WSSV混合液為將保存于PBS溶液中濃度為3.0 X IO6Copy/ μ I的蝦白斑綜合癥病毒與FITC溶液按照體積比5-10:1混合，室溫下孵育0.5-2h。
[0011]所述FITC溶液濃度為lyg/μ I。
[0012]所述孵育在水平搖床或雜交爐中進行。
[0013]所述水平搖床轉(zhuǎn)速為30_100rpm。
[0014]所述收集的洗脫液經(jīng)考馬斯亮藍法檢測蛋白含量，將病毒含量最高(即藍色最深)洗脫液混合，即得到含有FITC標(biāo)記的WSSV的溶液，置于4°C避光保存。
[0015]本發(fā)明所具有的優(yōu)點:通過采用本發(fā)明的方法，可以較為簡便的得到可視化的WSSV,而且能夠分離游離的FITC與FITC標(biāo)記的WSSV，整個過程中不需要借助高速離心機，也不需要反復(fù)離心去除上清再重懸，操作簡便、省時、對儀器依賴度低，最終純化完畢的帶有FITC標(biāo)記的WSSV在波長為490~495nm的藍光激發(fā)下發(fā)出波長為520~530nm的綠色熒光，同時WSSV仍然具有與蝦類細胞的結(jié)合活性及感染性，可以用于進一步深入研究。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0016]圖1為本發(fā)明實施例提供的純化FITC標(biāo)記的WSSV過程示意圖。
[0017]圖2為本發(fā)明實施例提供的FITC標(biāo)記的WSSV與紅螯螯蝦造血組織原代細胞孵育結(jié)果圖(熒光)。
[0018]圖3為本發(fā)明實施例提供的FITC標(biāo)記的WSSV與紅螯螯蝦造血組織原代細胞孵育結(jié)果圖(可見光)。
【具體實施方式】
[0019]實施例1
[0020]1.材料準(zhǔn)備
[0021]將Img 異硫氰酸突光素(fluorescein isothiocyanate, FITC)溶于 Iml 碳酸鈉碳酸氫鈉緩沖液(0.1M，ρΗ9.0)制成FITC含量為I μ g/ μ I的FITC溶液，_20°C保存。
[0022]配制pH為7.4的10mM/L磷酸鈉緩沖液，并向其中分別加入KCl和NaCl，使它們的終濃度分別達到27mM/L和138mM/L，該溶液記為PBS (pH7.4)。
[0023]將已經(jīng)制備好的高純度WSSV保存在上述PBS (pH7.4)中，濃度控制在約
3.0X IO6Copy/μ 1，_80°C保存。
[0024]配制pH為6.8的10mM/L磷酸氫二鈉/磷酸二氫鉀緩沖液，并向其中分別加入NaCl、CaCl2、MnCl2 和 KCl，使它們的終濃度分別達到 150mM/L、10 μ M/L、10 μ M/L 和 27 μ M/L，該溶液記為CPBS (pH6.8)。[0025]2.FITC與對蝦WSSV混合孵育
[0026]取于冰上融化的80 μ I高純度WSSV溶液與10 μ I FITC溶液，于200 μ I離心管中混合，在水平搖床60rpm中室溫孵育lh，反應(yīng)過程中用錫箔紙包住避光。
[0027]3.純化 FITC 標(biāo)記的 WSSV
[0028]如圖1所示，孵育完畢以后將混合液轉(zhuǎn)移至裝填有G-25M分子篩填料的分子篩柱(柱體積為6ml)，整個過程用PBS并依靠重力進行洗脫。
[0029]先將預(yù)先裝有G-25M分子篩填料的分子篩柱(柱體積為6ml)垂直固定于鐵架臺上，然后使用2倍柱體積的上述PBS (pH7.4)清洗分子篩柱，當(dāng)分子篩柱中液面與填料持平時關(guān)閉止水夾。
[0030]此時再加入步驟2孵育后的混合液，打開止水夾使分子篩柱中液體流出約80 μ I后關(guān)閉(即，打開止水夾使分子篩柱中液面與填料持平)，最后使用2倍柱體積的上述PBS(ρΗ7.4)洗脫。洗脫時使用1.5ml的EP管收集洗脫液，每250 μ I —管，將收集管按照收集順序依次編號。
[0031]同時吸取每個收集管中10μI溶液使用考馬斯亮藍法檢測每個收集管中的蛋白含量，將檢測到的連續(xù)編號的第一批含有蛋白的收集液視為含有病毒的洗脫液，取其中病毒含量最高(即藍色最深)的3管，總體積約720 μ 1，將這些洗脫收集液混合，即得到含有FITC標(biāo)記的WSSV的溶液，置于4°C避光保存。整個純化過程均注意避光操作。
[0032]洗脫完畢以后再使用8倍柱體積的上述PBS (pH7.4)沖洗分子篩柱后保存下次使用。
[0033]4.應(yīng)用研究
[0034]向在48孔板中培養(yǎng)的紅螯螯蝦造血組織原代細胞中加入純化的FITC標(biāo)記的WSSV溶液，每孔中加入量為50 μ 1，細胞培養(yǎng)條件下孵育lh，在孵育完畢后用上述CPBS沖洗3次以除去未與蝦細胞結(jié)合的FITC標(biāo)記的WSSV，最后在熒光顯微鏡下觀察到經(jīng)過FITC標(biāo)記的WSSV與蝦類細胞的結(jié)合情況(圖2和圖3)。純化完畢的WSSV在波長為490~495nm的藍光激發(fā)下會發(fā)出波長為520~530nm的綠色熒光，由圖2可見在鏡下觀察到被FITC標(biāo)記的WSSV結(jié)合的蝦類細胞會發(fā)出綠色熒光。
【權(quán)利要求】
1.一種純化FITC標(biāo)記的蝦白斑綜合癥病毒(WSSV)的方法，其特征在于:將經(jīng)FITC標(biāo)記的蝦白斑綜合癥病毒混合液利用分子篩柱進行純化；收集含有FITC標(biāo)記的WSSV的洗脫液，即得到純化的可視化WSSV ;其中，分子篩柱填料為G-25M，洗脫液為PBS緩沖液。
2.按權(quán)利要求1所述的純化FITC標(biāo)記的蝦白斑綜合癥病毒(WSSV)的方法，其特征在于:將經(jīng)FITC標(biāo)記的蝦白斑綜合癥病毒混合液轉(zhuǎn)移至裝填有G-25M分子篩填料的分子篩柱，整個過程用PBS作為洗脫液，并依靠重力進行洗脫；收集含有FITC標(biāo)記的WSSV的洗脫液，即得到純化的可視化WSSV ;其中，裝填有G-25M分子篩填料的分子篩柱先經(jīng)2倍柱體積的PBS清洗。
3.按權(quán)利要求1或2所述的純化FITC標(biāo)記的蝦白斑綜合癥病毒(WSSV)的方法，其特征在于:所述FITC標(biāo)記的WSSV混合液為將保存于PBS溶液中濃度為3.0 X IO6Copy/ μ I的蝦白斑綜合癥病毒與FITC溶液按照體積比5-10:1混合，室溫下孵育0.5-2h。
4.按權(quán)利要求3所述的純化FITC標(biāo)記的蝦白斑綜合癥病毒(WSSV)的方法，其特征在于:所述FITC溶液濃度為I μ g/ μ I。
5.按權(quán)利要求3所述的純化FITC標(biāo)記的蝦白斑綜合癥病毒(WSSV)的方法，其特征在于:所述孵育在水平搖床或雜交爐中進行。
6.按權(quán)利要求5所述的純化FITC標(biāo)記的蝦白斑綜合癥病毒(WSSV)的方法，其特征在于:所述水平搖床轉(zhuǎn)速為30-100rpm。
7.按權(quán)利要求1或2所述的純化FITC標(biāo)記的蝦白斑綜合癥病毒(WSSV)的方法，其特征在于:所述收集的洗脫液經(jīng)考馬斯亮藍法檢測蛋白含量，將病毒含量最高(即藍色最深)洗脫液混合，即得到含有FI TC標(biāo)記的WSSV的溶液，置于4°C避光保存。
【文檔編號】C12N7/02GK103468652SQ201310302179
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2013年7月15日 優(yōu)先權(quán)日:2013年7月15日
【發(fā)明者】相建海, 謝世筠, 李富花 申請人:中國科學(xué)院海洋研究所