一種利用枯草芽孢桿菌生產(chǎn)環(huán)磷腺苷的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種生產(chǎn)作為藥物和生化試劑有用的環(huán)磷腺苷的工業(yè)方法，編碼具有腺苷酸環(huán)化酶活性的蛋白并可用于上訴生產(chǎn)方法的基因，含有該基因的重組DNA，含有該重組DNA的新菌株，和使用該新菌株生產(chǎn)環(huán)磷腺苷的方法。
【專利說明】一種利用枯草芽孢桿菌生產(chǎn)環(huán)磷腺苷的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于微生物菌種篩選的【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及利用基因重組構(gòu)建環(huán)磷腺苷高 產(chǎn)菌株及其發(fā)酵生產(chǎn)的技術(shù)。

【背景技術(shù)】
[0002] 本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)作為藥物和生化試劑有用的環(huán)磷腺苷的工業(yè)方法，編碼具有 腺苷酸環(huán)化酶活性的蛋白并可用于上訴生產(chǎn)方法的基因，含有該基因的重組DNA，含有該重 組DNA的轉(zhuǎn)化子，和使用該轉(zhuǎn)化子生產(chǎn)環(huán)磷腺苷的方法。而環(huán)磷腺苷為循環(huán)系統(tǒng)用藥，屬于 能量合劑的一種，臨床主要用于心力衰竭、心肌炎、病竇綜合征、冠心病及心肌病，也可用于 心律失常的輔助治療。
[0003] 下列方法是生產(chǎn)環(huán)磷腺苷的已知方法：
[0004] (1)堿性水解法
[0005] Davidlipkin等人在1959年曾用堿性水解的工藝方法制得了環(huán)磷腺苷。此法主 要是利用三磷酸腺苷（ATP) 100°C時在氫氧化鋇強堿水溶液中水解并關(guān)環(huán)制得環(huán)磷腺苷。
[0006] (2)活性酯類法
[0007] 河北大學(xué)韓文炎和屠宛蓉在1986年報道了環(huán)磷腺苷的改進合成工藝方法。5-腺 苷酸、4-嗎啡啉-N，N_二環(huán)己基脒和金屬鈉在乙二醇單甲醚溶劑中反應(yīng)，合成了環(huán)磷腺苷。
[0008] (3)DCC脫水法
[0009] M.Smith等在1961年用5-腺苷酸和4 一嗎啡啉一N，N-二環(huán)己基脒在吡啶溶劑 中，用DCC作脫水劑進行脫水反應(yīng)，使5-腺苷酸發(fā)生內(nèi)酯化反應(yīng)，產(chǎn)物的收率可達80%。-
[0010] ⑷三氯氧磷法
[0011] 1989年，Genieser等報道了腺苷與三氯氧磷反應(yīng)得到腺苷的合成工藝路線。中間 體腺苷二氯磷酸酯不經(jīng)過分離，加堿環(huán)化得到環(huán)磷腺苷。此法原料容易得到，反應(yīng)條件溫和 適中，但收率偏低（49% )。
[0012] 但以上方法全都屬于化學(xué)合成方法，難點在于反應(yīng)所需原料都具有毒性和污染， 且工業(yè)化生產(chǎn)過于昂貴。
[0013] 本發(fā)明的目的是提供發(fā)酵法生產(chǎn)環(huán)磷腺苷的方法，為了更適于工業(yè)化生產(chǎn)，本發(fā) 明還提供了含有腺苷酸環(huán)化酶基因的轉(zhuǎn)化子。利用該轉(zhuǎn)化子可以大量生產(chǎn)環(huán)磷腺苷。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0014] 本發(fā)明的目的是提出一種構(gòu)建環(huán)磷腺苷高產(chǎn)菌株并使之產(chǎn)生環(huán)磷腺苷的方法，依 此方法可有效的生產(chǎn)環(huán)磷腺苷。
[0015] 本發(fā)明的目的是通過如下的技術(shù)方案實現(xiàn)的：一種構(gòu)建重組環(huán)磷腺苷產(chǎn)生菌株的 方法，其特征在于包括以下過程：從十字花科蔬菜黑腐病菌jsim-3017獲得腺苷酸環(huán)化酶 基因并連接于表達載體PHT01。電轉(zhuǎn)化該載體于宿主菌枯草芽孢桿菌jsim-1025。在青霉素 平板上挑取不敏感的菌落。于斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)2-3天后，接種于裝有30ml液體發(fā)酵培養(yǎng)基 的250ml搖瓶，分1級或2級發(fā)酵，于28-36°C，轉(zhuǎn)速為200-220rpm的搖床中培養(yǎng)24-120h， 通過高壓液相色譜，檢測環(huán)磷腺苷產(chǎn)量，從而獲得高產(chǎn)的環(huán)磷腺苷產(chǎn)生菌。新的遺傳標(biāo)記 為：黃嘌呤、組氨酸、硫胺素三重缺陷型（縮寫為Xan-、His-、Thi_)，鳥苷酸還原酶、腺苷酸 脫氨酶缺失（GMPred-、Deam-)，8-氮鳥噪呤抗性（8-AGr)以及腺苷酸環(huán)化酶陽性。
[0016] 上述的篩選平板中青霉素的含量為：50iig/ml。
[0017]上述的液體發(fā)酵培養(yǎng)基組成及質(zhì)量含量為：葡萄糖30-100g，胰蛋白胨5_20g，K2HP045-8g，玉米漿l-3g，NaC12-10g溶于 1L自來水中，PH，5-9。
[0018] 本發(fā)明采用的通過重組得到的環(huán)磷腺苷高產(chǎn)菌株，設(shè)備簡單、方法宜行、效果良 好，發(fā)酵單位達到6-10g/L，最高可以達到12g/L。

【具體實施方式】
[0019] 實施例一
[0020] 本發(fā)明包括提取含有腺苷酸環(huán)化酶活性的蛋白基因，如序列號1所示氨基酸序列 的蛋白。
[0021] 含有腺苷酸環(huán)化酶基因的DNA片段可以從能夠產(chǎn)生環(huán)磷腺苷的微生物中獲得。任 何具有產(chǎn)生環(huán)磷腺苷的微生物都可以用于本發(fā)明。一株十字花科蔬菜黑腐病菌jsim-3017 是本
【發(fā)明者】擁有并保藏的。
[0022] 以下描述從十字花科蔬菜黑腐病菌jsim-3017獲得腺苷酸環(huán)化酶基因的方法。
[0023]通過常規(guī)DNA分離方法如苯酚方法（Biochem.Biophys.Acta, 72,619-629)，從十 字花科蔬菜黑腐病菌jsim-3017制備染色體DNA。
[0024] 可用常規(guī)方法合成引物PCR擴增序列1的DNA片段，跑膠回收PCR產(chǎn)物。
[0025] PCR引物序列如下：

【權(quán)利要求】
1. 一種環(huán)磷腺苷的生產(chǎn)方法，其特征是微生物發(fā)酵生產(chǎn)。
2. 依據(jù)權(quán)利要求1，其發(fā)酵菌株特征是以Bacillus subtilis JSM-1025腺苷產(chǎn)生菌 為宿主菌，采用基因重組方法，轉(zhuǎn)入能編碼腺苷酸環(huán)化酶的基因，得到新的工程菌。該突變 株不再積累腺苷而積累大量環(huán)磷腺苷。新的遺傳標(biāo)記為：黃嘌呤、組氨酸、硫胺素三重缺陷 型（縮寫為乂&11-、把8-、1111-)，鳥苷酸還原酶、腺苷酸脫氨酶缺失（61^代(1-、〇6 &111-)，8-氮 鳥嘌呤抗性（8-AGr)以及腺苷酸環(huán)化酶陽性。
3. 依據(jù)權(quán)利要求2,該編碼腺苷酸環(huán)化酶的基因源自一株十字花科蔬菜黑腐病菌 jsim-3017。
4. 依據(jù)權(quán)利要求1，所述的一種發(fā)酵產(chǎn)生環(huán)磷腺苷的方法，其特點在發(fā)酵培養(yǎng)基中，于 28-36°C，轉(zhuǎn)速為200-220rpm的搖床中培養(yǎng)24-120h。
5. 依據(jù)權(quán)利要求1，發(fā)酵培養(yǎng)基組成及質(zhì)量含量為：葡萄糖30-100g，胰蛋白胨5-20g， K2HP045-8g，玉米漿 l-3g，NaC12-10g 溶于 1L 自來水中。
6. 依據(jù)權(quán)利要求1，發(fā)酵過程中PH控制在5-9。
【文檔編號】C12P19/32GK104342468SQ201310311307
【公開日】2015年2月11日 申請日期:2013年7月24日 優(yōu)先權(quán)日:2013年7月24日
【發(fā)明者】朱曉宏, 朱曉慧, 魏薇, 單志萍, 孟妤, 陸茂林, 楊曉偉, 司竑飛 申請人:江蘇省微生物研究所有限責(zé)任公司