miR-7及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種miR-7及其應用。本發(fā)明通過三維膠原海綿支架培養(yǎng)細胞體系發(fā)現(xiàn)miR-7通過調控Klf4基因進而促進神經(jīng)干細胞分化，從而篩選到miR-7。在神經(jīng)干細胞內過表達或敲低miR-7，進一步證實miR-7具有促進神經(jīng)干細胞定向分化為神經(jīng)元的功能。
【專利說明】miR-7及其應用

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物【技術領域】，具體涉及一種miRNA及其應用。

【背景技術】
[0002] 當今顱腦和脊髓外傷、腦血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)先天性疾病和罹患神經(jīng)退變性疾病 人數(shù)急劇上升，人類一旦發(fā)生腦出血、腦梗塞、腦外傷、脊髓損傷等疾病后，損傷的神經(jīng)功能 難以自我修復，多遺留嚴重的后遺癥。神經(jīng)干細胞作為一種具備自我更新能力及多向分化 潛能的細胞，它來源于神經(jīng)組織并可生成神經(jīng)組織，在適當條件下可分化成神經(jīng)元、少突 膠質細胞和星形細胞。神經(jīng)干細胞為神經(jīng)系統(tǒng)功能重建和神經(jīng)再生提供了一條新的途徑， 具有廣泛的臨床應用前景。尋找促進神經(jīng)干細胞分化的因素對于組織再生、神經(jīng)系統(tǒng)退行 性疾病、腦外傷以及腦腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和治療有著非常重要的意義，許多研究發(fā)現(xiàn)小分子 化合物AICAR、生長因子FGF，生物材料石墨烯等具有促進神經(jīng)元分化的作用。


【發(fā)明內容】

[0003] 本發(fā)明的目的是提供一種miRNA及其應用，所述miRNA命名為miR-7。
[0004] 本發(fā)明提供的miRNA具有下述核苷酸序列之一：
[0005] 1)序列表中SEQID Ns . 1所示的核苷酸序列；
[0006] 2)與1)限定的核苷酸序列具有90%以上同源性，且參與神經(jīng)干細胞的分化或神 經(jīng)干細胞的自我更新的核苷酸序列；具體的，所述同源性為95%以上；再具體的為96%以 上；再具體的為97%以上；再具體的為98%以上；再具體的為99%以上。
[0007] 所述參與神經(jīng)干細胞的分化或神經(jīng)干細胞的自我更新，具體指所述miRNA是通過 調控其下游基因Klf4的表達來參與神經(jīng)干細胞的分化或神經(jīng)干細胞的自我更新。
[0008] 所述參與神經(jīng)干細胞的分化，具體指所述miRNA促進所述神經(jīng)干細胞的分化。
[0009] 所述參與神經(jīng)干細胞的自我更新，具體指所述miRNA抑制所述神經(jīng)干細胞的自我 更新。
[0010] 所述神經(jīng)干細胞具體為大鼠神經(jīng)干細胞。
[0011] 本發(fā)明的另一個目的是提供所述miRNA在制備具有下述任意一種功能的產品中 的應用：
[0012] 1)調節(jié)神經(jīng)干細胞的分化；
[0013] 2)調節(jié)神經(jīng)干細胞的自我更新；
[0014] 3)調節(jié)神經(jīng)干細胞的全能性。
[0015] 所述調節(jié)神經(jīng)干細胞的分化為促進神經(jīng)干細胞的分化；
[0016] 所述調節(jié)神經(jīng)干細胞的自我更新為抑制神經(jīng)干細胞的自我更新；
[0017] 所述調節(jié)神經(jīng)干細胞的全能性為抑制神經(jīng)干細胞的全能性。
[0018] 所述應用中，所述促進神經(jīng)干細胞分化具體指促進神經(jīng)干細胞分化為神經(jīng)元。
[0019] 本發(fā)明的另一個目的是提供所述的miRNA在制備具有調控Klf4、Nestin、 Vimentin、Map2和/或Tujl基因表達功能產品中的應用。
[0020] 具體的，所述調控Klf4、Nestin、Vimentin、Map2和/或Tujl基因表達指抑制 Klf4、Nestin和/或Vimentin基因的表達；和/或促進Map2和/或Tujl基因的表達。[0021] 本發(fā)明的再一個目的是提供一種篩選所述miRNA的方法，所述方法包括以下步 驟：
[0022] 1)將全能干細胞分別在二維培養(yǎng)體系或三維膠原海綿培養(yǎng)體系中培養(yǎng)；
[0023] 2)分析miRNA在步驟1)所述的兩個培養(yǎng)體系中培養(yǎng)的全能干細胞中的表達差異；
[0024] 3)選取表達差異達到統(tǒng)計學顯著水平的miRNA進行分離、測序即得。
[0025] 所述步驟1)中，所述三維膠原海綿培養(yǎng)體系具體指以膠原海綿為三維支架的培養(yǎng) 體系。
[0026] 所述膠原海綿購自美國美敦力公司（MedtronicSofamorDanekUSA,Inc)。
[0027] 所述方法中，所述全能干細胞具體為PA-1細胞或神經(jīng)干細胞。
[0028] 所述方法中，所述二維培養(yǎng)體系具體指常規(guī)的單層細胞平面培養(yǎng)體系。
[0029] 本發(fā)明通過三維膠原海綿支架培養(yǎng)細胞體系篩選到miR-7,miR-7通過調控Klf4 基因進而促進神經(jīng)干細胞分化，進而通過在神經(jīng)干細胞內過表達或敲低miR-7,檢測miR-7 表達情況對神經(jīng)干細胞分化的影響，進一步證實miR-7具有促進神經(jīng)干細胞定向分化為神 經(jīng)元的功能。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0030] 圖1為三維培養(yǎng)體系中表達下調的miRNA與PA-1細胞自我更新調控關鍵基因的 調控網(wǎng)絡圖。
[0031] 圖2為Real-timePCR方法檢測miR-7在三維培養(yǎng)體系（3D)或二維培養(yǎng)體系（2D) 培養(yǎng)的PA-1細胞內的表達情況，其中**表示P〈0. 01。
[0032] 圖3為Real-timePCR方法檢測三維培養(yǎng)體系（3D)或二維培養(yǎng)體系（2D)內大鼠 神經(jīng)干細胞自我更新及分化相關基因的表達情況，其中**表示P〈〇. 01。
[0033] 圖4為Real-timePCR方法檢測三維培養(yǎng)體系（3-D)和二維培養(yǎng)體系（2-D)內大 鼠神經(jīng)干細胞中miR-7 (圖4A)和Klf4基因（圖4B)的表達情況。
[0034] 圖5為Real-timePCR方法檢測過表達miR-7或敲低miR-7表達后，神經(jīng)干細胞 自我更新相關基因Nestin、Sox2、Vimentin和分化相關基因Tujl、Map2的表達情況，其中* 表示P〈0. 05, ** 表示P〈0. 01。
[0035] 圖6為免疫熒光檢測過表達miR-7或敲低miR-7表達后，神經(jīng)干細胞自我更新相 關基因Nestin(圖6A)，Sox2 (圖6B)，Vimentin(圖6C)和分化相關基因Tujl(圖6D)， Map2 (圖6E)，的表達情況，其中*表示P〈0. 05，#表示P〈0. 01。

【具體實施方式】
[0036] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0037] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0038] 下述實施例中如無特殊說明，所述液體與液體的比值為體積與體積比或體積百分 含量；所述液體與固體的比值為體積與質量比；所述固體與固體的比值為質量與質量比或 質量百分含量。
[0039] 膠原海綿購自美國美敦力公司（MedtronicSofamorDanekUSA,Inc)
[0040] 實施例1、以膠原海綿為支架的三維培養(yǎng)體系培養(yǎng)細胞
[0041](一）細胞的二維培養(yǎng)
[0042]PA-1細胞的二維培養(yǎng)：
[0043] PA-1細胞購自中國協(xié)和醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院，為ATCC細胞庫收錄（ATCC? CRL-1572?)。于37°C、5%C02、飽和濕度的C02培養(yǎng)箱中無菌培養(yǎng)（ThermoForma公司）。培 養(yǎng)基為高糖DMEM(Hyclone)，含體積百分比為10%的胎牛血清（Gibco)、青霉素100U/ml、鏈 霉素0.lmg/ml，在37°C、5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔日傳代。細胞傳代時用0. 25%的胰蛋白酶 進行消化。
[0044] 大鼠神經(jīng)干細胞的分離與二維培養(yǎng)：
[0045] 取8只SD乳鼠（出生12小時以內的乳鼠)(購自北京維通利華實驗動物技術有限公 司），在75%酒精中浸泡處死，在超凈臺內斷頭，取出端腦，將端腦轉移至預冷的含糖PBS(內 含0. 1M葡萄糖)中，仔細地剔除血管和腦膜，在預冷的含糖PBS中洗3次，將PBS吸干，彎剪 剪碎腦組織，將組織轉移至15ml離心管，加0. 25%胰酶，37°C消化40分鐘，消化20分鐘時 拿出來吹打一次，消化40分鐘后用胰酶抑制劑終止消化，加基礎培養(yǎng)基，吹散沉淀，注意盡 量不要產生氣泡，2〇〇目細胞篩過濾后，500g離心5分鐘，去掉上清，加入添加有B27、20ng/ mlbFGF和20ng/mlEGF的DMEM/F12培養(yǎng)基重懸細胞，接種于培養(yǎng)瓶中，置于37°C、5%C02、 飽和濕度的培養(yǎng)箱中懸浮培養(yǎng)，培養(yǎng)3天后換液，繼續(xù)培養(yǎng)至7天，形成直徑100-200ym的 神經(jīng)球。將含神經(jīng)球的懸浮培養(yǎng)基倒入離心管中，250g離心5分鐘，去掉上清，收集沉淀。 加入0. 25%胰酶消化，室溫孵育15-20分鐘，在第8分鐘時，輕輕將沉底的細胞團塊吹散，繼 續(xù)孵育，孵育至20分鐘后，用含體積百分比為10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基終止胰酶作 用，顯微鏡下計數(shù)細胞，細胞計數(shù)后按照1X105細胞/cm2密度將細胞接種在用多聚賴氨酸 處理(用lmg/ml多聚賴氨酸溶液將培養(yǎng)皿底部鋪滿，37°C孵育2小時后，洗掉多聚賴氨酸， 在超凈臺中吹干，用PBS洗2遍）的細胞培養(yǎng)板或培養(yǎng)皿中。神經(jīng)干細胞貼壁培養(yǎng)24小時 后，用PBS洗兩次，換為含體積百分比為2%的B27和30%葡萄糖的神經(jīng)干細胞分化培養(yǎng)基。
[0046](二）以膠原海綿為支架的三維培養(yǎng)體系培養(yǎng)細胞
[0047] 以膠原海綿為支架的PA-1細胞的三維培養(yǎng)：
[0048] 將二維培養(yǎng)的PA-1細胞用0. 25%的胰酶消化，顯微鏡下計數(shù)細胞，在每塊膠原海 綿上接種20yl的5X106/mL細胞，在37°C、5%C02培養(yǎng)箱中貼壁培養(yǎng)4小時后，將內含膠原 海綿材料的l〇cm的細胞皿內補充10ml內含體積百分比為10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng) 基，繼續(xù)培養(yǎng)7天，隔日換液。
[0049] 以膠原海綿為支架的大鼠神經(jīng)干細胞的三維培養(yǎng)：
[0050] 1、神經(jīng)干細胞懸浮培養(yǎng)(懸浮培養(yǎng)為三維成球培養(yǎng)方法）：
[0051] 神經(jīng)干細胞擴增培養(yǎng)基（100ml):
[0052]非必需氨基酸 100X1ml;丙酮酸鈉 100X1ml;雙抗 100X1ml;B2750X2ml; 30%Glu2ml;EGF(0?lmg/ml) 20ii1;bFGF(0?lmg/ml) 20ii1 ;肝素（0? 05g/2ml) 7. 32ii1 ; DMEM/F12(1:1)92. 07ml；
[0053] 培養(yǎng)條件：在37°C、5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7天擴增形成的神經(jīng)球，用0. 25%的胰酶 消化，室溫孵育15-20分鐘，在第8分鐘時，輕輕將沉底的細胞團塊吹散，繼續(xù)孵育，孵育至 20分鐘后，用含體積百分比為10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基終止胰酶作用。
[0054] 2、以膠原海綿為支架的三維培養(yǎng)體系培養(yǎng)細胞：
[0055] 顯微鏡下計數(shù)上述懸浮培養(yǎng)的細胞，每塊膠原海綿上接種20yl的5X107/mL細 胞，在37°C、5%C02培養(yǎng)箱中貼壁培養(yǎng)4小時后，將內含膠原海綿材料的10cm的細胞皿內補 充10ml內含體積百分比為10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)1天，第二日，將細 胞培養(yǎng)基更換為內含體積百分比為2%的B27和30%葡萄糖的神經(jīng)干細胞分化培養(yǎng)基中，培 養(yǎng)7天，隔代換液。
[0056] 實施例2、microRNA表達譜基因芯片檢測、miRNA-靶基因調控網(wǎng)絡構建及miR-7 的制備
[0057] (一）miRNA提取
[0058]利用mirVanaTMmiRNAIsolationmiRNA提取試劑盒（Cat#1560，Ambion)分別 提取由實施例1得到的二維培養(yǎng)體系和三維膠原海綿培養(yǎng)體系中培養(yǎng)的PA-1細胞的總 miRNA。根據(jù)試劑盒的說明提取和富集樣品的miRNA，具體操作步驟如下：
[0059] (1)收獲IX106 細胞，加入 1:10 (w/v)的Lysis/BindingBuffer，旋潤振蕩混勻。
[0060] (2)加入1/10體積的miRNAHomogenateAdditive。旋潤振蕩混勻或上下顛倒數(shù) 次，冰浴10分鐘。
[0061] (3)加入一倍體積的Acid-Phenol:Chloroform(體積是在沒有加入miRNA HomogenateAdditive前的體積)，旋潤振蕩30-60秒，以最大速度（10,000Xg)室溫離心5 分鐘，以確保液相分層，如分層不明顯，再次離心。
[0062] (4)將濾過液的上清液(水相）轉移到新的離心管中，注意轉移液體的體積。
[0063] (5 )加入1 /3體積的100 %乙醇，混勻。
[0064] (6)將細胞裂解液和乙醇混合液轉移到FilterCartridge，10,000Xg(10， OOOrpm)離心15秒，保留濾過液，濾過管可參照下述步驟（10)- (16)提取濾過管中殘留的 總RNA。
[0065] (7)濾過液中加入2/3體積的無水乙醇，混勻。
[0066] (8)將細胞裂解液和乙醇混合液轉移到FilterCartridge，10,000Xg(10， OOOrpm)離心15秒，棄濾過液，保留濾過管。
[0067] (9)如果體積大于700ii1，繼續(xù)將液體轉移到FilterCartridge后離心。
[0068] (10)加入 700u1miRNAWashSolutionl到FilterCartridge中，離心 5 - 10 秒，棄濾過液，保留收集管。
[0069] (11)加入 500u1WashSolution2/3 到FilterCartridge中，離心 5 - 10 秒，棄 濾過液，保留收集管。
[0070] (12)再加入 500u1WashSolution2/3 到FilterCartridge中，離心 5 - 10 秒洗 柱。
[0071] (13)為除盡FilterCartridge中液體，更換收集管(用戶自備）后以最大轉速離 心1分鐘。
[0072](14)將洗脫液或無核酸酶水預熱到95°C，洗脫液是無核酸酶的0.ImMEDTA(如果 影響實驗分析，可選用無核酸酶水替代)。
[0073] (15)將FilterCartridge轉移到提供的收集管中，直接將100ill預熱好的洗脫 液或是無核酸酶水加到膠床上，以最大轉速離心20-30秒洗脫RNA。
[0074] (16)為獲得更高產量的RNA，重復步驟（16)-次，將離心洗脫液收集到同一收集 管中。
[0075] (17)用1%變性的瓊脂糖凝膠電泳檢測所得到的總RNA，并用紫外分光光度計檢測 RNA的濃度和純度。
[0076] (18)剩余的含miRNA的洗脫液保存在_20°C。
[0077](二）microRNA表達譜基因芯片檢測
[0078] (1)芯片及探針的制備
[0079] 米用美國LC Sciences公司提供的(iParaflo? microRNA微陣列芯片，對Sanger miRBase數(shù)據(jù)庫最新報道的人的microRNA進行檢測，從而確保了對microRNA進行直接檢測 的高靈敏性和高特異性。
[0080] 芯片探針序列信息來自于SangermiRBaseReleasel9. 0版本數(shù)據(jù)庫（http:// microrna.sanger.ac.uk/sequences)〇
[0081] 每個檢測探針是由PGR(光敏試劑）化學試劑原位合成，包含了一段編碼區(qū)域和一 個延伸臂片段。編碼區(qū)域是一個經(jīng)化學修飾的核苷酸編碼片段，這些片段與靶miRNA或其 它靶RNA互補，可以提高檢測的靈敏度和特異性，同時還能提高雜交親和活性從而平衡探 針的Tm值。延伸臂片段能使與它連接的編碼片段片基有一定的距離，減少雜交空間阻礙。 每個探針在同張芯片里重復5個點，進一步提高了芯片的可靠性。
[0082] (2)芯片的雜交、顯色、洗滌和掃描
[0083] 分別將上述提取得到的二維培養(yǎng)體系和三維膠原海綿培養(yǎng)體系培養(yǎng)得到的PA-1 細胞的總miRNA，通過YM-lOO(Millipore)微離心過濾柱得到片段小于300nt的小RNA。 Poly(A)聚合酶在分離到的小RNA3 '端加上poly(A)尾巴，再連接一個寡聚核苷酸標記，使 用Cy3和Cy5特異性熒光標記進行雙樣品雜交試驗。用Cy3和Cy5特異性熒光分別標記二 維培養(yǎng)PA-1細胞和三維膠原海綿培養(yǎng)體系培養(yǎng)的PA-1細胞，
[0084] 將兩個標記好的樣品雜交到一張制備好的microRNA微陣列芯片上。雜交反應通 過微循環(huán)泵雜交儀器在IParaflo?'微流體芯片上過夜(AtacticTechnologies)。雜交使用 含有體積百分比為25%的甲酰胺的100iiL6xSSPE緩沖液（0. 90MNaCl、60mMNa2HP04、6mM EDTA、pH6. 8,溶劑為水），雜交溫度34°C。
[0085] 雜交后的芯片采用激光掃描儀（GenePix4000B，MolecularDevice)采集雜交圖 象；將采集的雜交圖像再經(jīng)Array-Pro(MediaCybernetics)軟件進行處理分析，把圖像信 號轉化為數(shù)字信號，得掃描圖譜；檢測樣品在掃描圖譜中會出現(xiàn)紅色，綠色或黃色的雜交 點，其中，紅色表不基因表達上調；綠色表不表不基因表達下調，黃色表不兩個樣本間的基 因表達量基本相當。
[0086] (3)芯片掃描結果的分析
[0087] 將上述獲得的掃描圖譜保存為標簽圖像文件格式（Tagged Image File Format, TIFF),通過Axon GenePix4000B Microarray Scanner將圖像的像素質轉化為數(shù)字信號，并 導出成分析軟件可識別得文件格式（.dat和.cel文件)。在進行芯片的比較分析前，對每一 張芯片進行扣除背景，計算重復點平均值和標準偏差，然后通過L0WESS (Locally-Weighted Regression)過濾進行標準化。對于雙色標記實驗，計算三維膠原海綿培養(yǎng)體系培養(yǎng)的PA-1細胞和二維培養(yǎng)PA-1細胞兩組樣本檢測信號的比值（log2)和t-test的p值。以p 值〈0. 01定義顯著差異性表達。
[0088] 芯片掃描分析結果顯示，共鑒定出326個在三維膠原海綿培養(yǎng)體系培養(yǎng)的PA-1細 胞中的miRNA的表達與在二維培養(yǎng)體系培養(yǎng)的PA-1細胞中的miRNA的表達有顯著性差異。
[0089] (4)miRNA-靶基因網(wǎng)絡的構建
[0090] 使用TargetScan(release6. 2)對上述鑒定出的326個miRNA的革巴基 因進行預測。對其中30個在三維膠原海綿培養(yǎng)體系中下調表達的miRNA，使用 Cytoscape(version3. 0. 1)網(wǎng)絡構建工具構建了這些miRNA對其靶基因即多能性因子 0ct4，Sox2，Klf4和Nanog的調控網(wǎng)絡，結果見圖1。圖1顯示，在網(wǎng)絡圖中，節(jié)點的大小與 節(jié)點的入度相關；邊的樣式與靶位點的保守性相關，從實體線到短劃線再到虛線表示保守 性依次降低；邊的粗細從細到粗對應于miRNA在三維膠原海綿培養(yǎng)體系培養(yǎng)的PA-1細胞中 的表達與在二維培養(yǎng)體系培養(yǎng)的PA-1細胞中的表達的差異倍數(shù)由小到大；其中，miR-7調 控的靶基因之一為Klf4,且miR-7在三維膠原海綿培養(yǎng)體系培養(yǎng)的PA-1細胞中的表達與在 二維培養(yǎng)體系培養(yǎng)的PA-1細胞中的表達的差異倍數(shù)較大。構建的miRNA-靶基因網(wǎng)絡結果 部分解釋了三維膠原海綿培養(yǎng)體系相較于二維培養(yǎng)體系，能更好的維持干細胞自我更新機 制的分子機理。
[0091] (5)miR-7的制備及Real-timeRT-PCR驗證芯片檢測結果
[0092] 抽取miRNA芯片中篩選的差異表達的miRNA-7進行Real-timePCR，驗證芯片結 果。
[0093] 分別提取由實施例1培養(yǎng)得到二維培養(yǎng)體系和三維膠原海綿培養(yǎng)體系中的PA-1 細胞的總miRNA，miNA提取方法同本實施例(一)所述。使用invitrogenmiRNA反轉錄試劑 盒（TaqmanmicroRNAreversetranscriptionkitcatN0. 4366596)將制備得到的miRNA 分別逆轉錄為相應的cDNA。反轉錄反應體系如表1所示。
[0094]表1
[0095]

【權利要求】
1. 一種miRNA，所述miRNA具有下述核苷酸序列之一： 1) 序列表中SEQ ID Ns . 1所示的核苷酸序列； 2) 與1)限定的核苷酸序列具有90%以上同源性，且參與神經(jīng)干細胞的分化或神經(jīng)干 細胞的自我更新的核苷酸序列；具體的，所述同源性為95%以上；再具體的為96%以上；再 具體的為97%以上；再具體的為98%以上；再具體的為99%以上。
2. 權利要求1所述的miRNA在制備具有下述任意一種功能的產品中的應用： 1) 調節(jié)神經(jīng)干細胞的分化； 2) 調節(jié)神經(jīng)干細胞的自我更新； 3) 調節(jié)神經(jīng)干細胞的全能性。
3. 根據(jù)權利要求2所述的應用，其特征在于： 所述調節(jié)神經(jīng)干細胞的分化為促進神經(jīng)干細胞的分化； 所述調節(jié)神經(jīng)干細胞的自我更新為抑制神經(jīng)干細胞的自我更新； 所述調節(jié)神經(jīng)干細胞的全能性為抑制神經(jīng)干細胞的全能性。
4. 權利要求1所述的miRNA在制備具有調控Klf4、Nestin、Vimentin、Map2和/或Tujl 基因表達功能產品中的應用。
5. -種篩選權利要求1所述miRNA的方法，所述方法包括以下步驟： 1) 將全能干細胞分別在二維培養(yǎng)體系或三維膠原海綿培養(yǎng)體系中培養(yǎng)； 2) 分析miRNA在步驟1)所述的兩個培養(yǎng)體系中培養(yǎng)的全能干細胞中的表達差異； 3) 選取表達差異達到統(tǒng)計學顯著水平的miRNA進行分離、測序即得。
【文檔編號】C12Q1/68GK104342439SQ201310311571
【公開日】2015年2月11日 申請日期:2013年7月23日 優(yōu)先權日:2013年7月23日
【發(fā)明者】崔熠, 肖志峰, 魏建樹, 陳冰, 陳同, 戴建武 申請人:中國科學院遺傳與發(fā)育生物學研究所