一種采用微流控芯片構(gòu)建三維神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的裝置及其制備和使用方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種采用微流控芯片構(gòu)建三維神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的裝置及其制備和使用方法。所述裝置包括微流控芯片、用于黏附神經(jīng)細(xì)胞的微球和基底，其中所述微流控芯片包括一層或多層PDMS彈性層并具有通孔，所述PDMS彈性層具有供神經(jīng)細(xì)胞突起延伸的微流管道，所述通孔與基底形成用于容納微球的小室。本發(fā)明的裝置制備簡(jiǎn)單，使用其形成的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)具有多級(jí)結(jié)構(gòu)、高度有序且相互連通的特征，較現(xiàn)有方法更接近體內(nèi)真實(shí)情況，且細(xì)胞觀察方便。
【專利說(shuō)明】一種采用微流控芯片構(gòu)建三維神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的裝置及其制備和使用方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，更具體地涉及在體外構(gòu)建三維神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型的方法。

【背景技術(shù)】
[0002]在具有神經(jīng)系統(tǒng)的生物體內(nèi)，各器官、系統(tǒng)的功能和各種生理過(guò)程都在神經(jīng)系統(tǒng)的直接或間接調(diào)節(jié)控制下，互相聯(lián)系、相互影響、密切配合成為一個(gè)完整統(tǒng)一的有機(jī)體，實(shí)現(xiàn)和維持正常的生命活動(dòng)。此外，神經(jīng)系統(tǒng)還要對(duì)體內(nèi)各種功能不斷進(jìn)行迅速而完善的調(diào)整從而使生物體適應(yīng)體內(nèi)外環(huán)境的變化。因此，神經(jīng)系統(tǒng)是生物體內(nèi)起主導(dǎo)作用的重要功能調(diào)節(jié)系統(tǒng)。在高等動(dòng)物，尤其是在哺乳動(dòng)物中，神經(jīng)系統(tǒng)是一個(gè)由成千上萬(wàn)個(gè)神經(jīng)細(xì)胞相互連接形成的多級(jí)三維網(wǎng)絡(luò)，對(duì)其組織結(jié)構(gòu)和工作原理的研究對(duì)于生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、藥學(xué)、組織工程學(xué)等來(lái)說(shuō)都非常重要。目前存在的體外神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建方法包括神經(jīng)細(xì)胞的有序圖案化和神經(jīng)突的可控誘導(dǎo)。
[0003]微流控技術(shù)已發(fā)展為研究細(xì)胞生物學(xué)的有用工具，其可以精確的控制、監(jiān)控和操縱細(xì)胞外微環(huán)境，從而實(shí)現(xiàn)神經(jīng)細(xì)胞在二維平面上的圖案化以及神經(jīng)突的誘導(dǎo)。
[0004]中國(guó)發(fā)明專利(CN101748061A)公開(kāi)了一種建立神經(jīng)細(xì)胞之間單細(xì)胞水平連接的裝置和生長(zhǎng)連接方法，在覆有促神經(jīng)細(xì)胞黏附的蛋白質(zhì)條帶的基底上放置具有微凹槽單元的聚二甲基硅氧烷(PDMS)印章，將神經(jīng)細(xì)胞送入微凹槽單元并黏附在蛋白質(zhì)條帶上，其突起則沿蛋白條帶定向生長(zhǎng)而不發(fā)生分支，從而獲得神經(jīng)細(xì)胞單細(xì)胞水平的單線連接。
[0005]Nature Methods (NATURE METHODS, AUGUST2005, VOL.2N0.8，599)曾報(bào)道過(guò)利用微流控裝置長(zhǎng)期培養(yǎng)和局限原代中樞神經(jīng)細(xì)胞。所用的微流控裝置由PDMS芯片和玻璃片基底組成，構(gòu)建了兩個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)區(qū)域以及連接它們的微槽。將神經(jīng)細(xì)胞種在其中一個(gè)區(qū)域后，由于微槽的局限性，只有神經(jīng)軸突會(huì)伸展到另一個(gè)區(qū)域中，這種裝置可以用于構(gòu)建中樞神經(jīng)軸突損傷和再生模型。這項(xiàng)技術(shù)可以在二維的平面可控誘導(dǎo)神經(jīng)突的連接，但這并不能真實(shí)反應(yīng)體內(nèi)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的組織和功能。因?yàn)檎鎸?shí)的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)不可能是二維的，而是在三維空間存在的。
[0006]目前已有的在體外構(gòu)建三維神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的方法有利用direct-write assembly技術(shù)制備的光聚合水凝膠三維支架，神經(jīng)細(xì)胞在這種支架內(nèi)形成分支網(wǎng)絡(luò)(Adv.Funct.Mater.2011，21，47 - 54)。還有使用硅硼玻璃微球自組裝的基底支持神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)的技術(shù)(Ehud Y Isacoff, NATURE METHODS，AUGUST2008，VOL.5N0.8，735)，可形成三維的毫米級(jí)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，為了提高神經(jīng)細(xì)胞在硅硼玻璃微球上的黏附性，在其表面包覆了一層多聚賴氨酸。雖然這樣可以在一定程度上模擬體內(nèi)三維神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)成，但這只是低級(jí)別的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)不可控且細(xì)胞類型分布相對(duì)雜亂，而體內(nèi)真實(shí)的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)是多級(jí)別的，且不同級(jí)別的網(wǎng)絡(luò)上具有特定的細(xì)胞亞型，由低級(jí)別的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)按照高度有序的模式相互連接組成，并且具有標(biāo)志性的軸突樹(shù)突極化、興奮性抑制性分化以及突觸發(fā)生，同時(shí)不同級(jí)別的網(wǎng)絡(luò)上都可測(cè)得明顯的神經(jīng)活動(dòng)。
[0007]因此，本領(lǐng)域中需要可以在體外構(gòu)建具有多級(jí)結(jié)構(gòu)的、高度有序且相互連通的三維神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的裝置，其可實(shí)現(xiàn)體外神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)與功能的高度統(tǒng)一，最大可能的模擬體內(nèi)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的真實(shí)組織構(gòu)成。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明提供一種體外培養(yǎng)三維神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的裝置及其制備方法，并利用這種裝置構(gòu)建具有良好的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)育的三維神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，可以檢測(cè)到神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)中具有標(biāo)志性的軸突樹(shù)突極化、興奮性抑制性分化以及突觸發(fā)生，而且可在不同級(jí)別的網(wǎng)絡(luò)上都測(cè)得明顯的神經(jīng)活動(dòng)，同時(shí)提出了在神經(jīng)組織工程、腦機(jī)接口、藥物篩選平臺(tái)構(gòu)建上的可能應(yīng)用。
[0009]本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
[0010]在本發(fā)明的第一方面，提供了一種體外培養(yǎng)三維神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的裝置，所述裝置包括微流控芯片、用于黏附神經(jīng)細(xì)胞的微球和基底，其中所述微流控芯片包括一層或多層PDMS彈性層并具有通孔，所述PDMS彈性層具有供神經(jīng)細(xì)胞突起延伸的微流管道，所述通孔與基底形成用于容納微球的小室；所述微球優(yōu)選為均一直徑；所述小室優(yōu)選為圓形、長(zhǎng)方形或串珠形；以及所述基底優(yōu)選為玻璃基底、PDMS基底或聚苯乙烯基底。
[0011]在本發(fā)明的裝置中，所述微球的直徑可以為30-140微米，優(yōu)選為40-100微米，更優(yōu)選為40-70微米。
[0012]在本發(fā)明的裝置中，所述微球是硅硼玻璃微球和水凝膠微球中的任意一種。
[0013]在本發(fā)明的裝置中，所述通孔橫截面的邊長(zhǎng)或直徑為微球直徑的100-102倍，優(yōu)選20-80倍，更優(yōu)選40-60倍；
[0014]在本發(fā)明的裝置中，所述微流管道高度可以為3微米-10微米，優(yōu)選為4-8微米，最優(yōu)選為5微米。
[0015]在本發(fā)明的裝置中，所述微流管道寬度優(yōu)選為5-50微米，更優(yōu)選為10-40微米，最優(yōu)選為20-30微米。
[0016]在本發(fā)明的裝置中，當(dāng)采用多層PDMS彈性層時(shí)，下層PDMS彈性層的厚度為40-80微米，優(yōu)選50-70微米，更優(yōu)選60微米，且總厚度為200微米至3毫米，優(yōu)選為500微米至2.5毫米，更優(yōu)選為I毫米至1.5毫米；在一些實(shí)施方案中，總厚度可以為500微米、600微米、700微米、800微米、900微米、I毫米、1.1毫米、1.2毫米、1.3毫米、1.4毫米、1.5毫米、
1.6毫米、1.7毫米、1.8毫米、1.9毫米、2.0毫米、2.1毫米、2.2毫米、2.3毫米、2.4毫米、
2.5暈米、2.6暈米、2.7暈米、2.8暈米、2.9暈米或3.0暈米。
[0017]在本發(fā)明的裝置中，當(dāng)采用單層PDMS彈性層時(shí)，厚度為150微米至3毫米，優(yōu)選為500微米至2.5毫米，更優(yōu)選為I毫米至1.5毫米；在一些實(shí)施方案中，厚度可以為150微米、200微米、250微米、300微米、350微米、400微米、450微米、500微米、600微米、700微米、800微米、900微米、I毫米、1.1毫米、1.2毫米、1.3毫米、1.4毫米、1.5毫米、1.6毫米、
1.7暈米、1.8暈米、1.9暈米、2.0暈米、2.1暈米、2.2暈米、2.3暈米、2.4暈米、2.5暈米、
2.6毫米、2.7毫米、2.8毫米、2.9毫米或3.0毫米
[0018]在第二方面，本發(fā)明提供了根據(jù)第一方面所述的裝置的制備方法，其特征在于，所述方法包括(a)經(jīng)光刻方法得到模板，用PDMS對(duì)模板上的圖案進(jìn)行翻模，得到具有微流管道的所述PDMS彈性層；(b)任選地，將多層所述PDMS彈性層同向疊合，通過(guò)氧等離子體處理使相鄰兩層之間鍵合，并使相鄰兩層中所述微流管道的方向成30?90度夾角，優(yōu)選為90度夾角；(c)在所述PDMS彈性層上打通孔；和((1)將所述PDMS彈性層有圖案的一面與基底貼合，通孔與基底形成所述小室。
[0019]其中同向是指每層PDMS彈性層上有圖案的一面均朝向同一方向。
[0020]在第三方面，本發(fā)明提供了根據(jù)第一方面所述的裝置的使用方法，其特征在于，所述方法包括微球的自組裝、將神經(jīng)細(xì)胞種植在所述微球的表面和將黏附有神經(jīng)細(xì)胞的微球放入小室中進(jìn)行培養(yǎng)。
[0021]優(yōu)選地，為了保證微球和神經(jīng)細(xì)胞組成的結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，在種植神經(jīng)細(xì)胞之前先種植膠質(zhì)細(xì)胞，提高神經(jīng)細(xì)胞的黏附性。
[0022]優(yōu)選地，種植在所述微球的表面的神經(jīng)細(xì)胞為原代神經(jīng)細(xì)胞
[0023]在第四方面，本發(fā)明提供了根據(jù)第一方面所述的裝置在神經(jīng)細(xì)胞和分子生物學(xué)、神經(jīng)組織工程、腦機(jī)接口和藥物篩選中的應(yīng)用。
[0024]有益效果:
[0025](I)本發(fā)明的裝置制備和使用方法都簡(jiǎn)單易行，便于推廣應(yīng)用。
[0026](2)采用本發(fā)明的裝置形成的三維神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)具有多級(jí)結(jié)構(gòu)、高度有序且相互連通的特征，并且形成了標(biāo)志性的軸突樹(shù)突極化、興奮性抑制性分化以及突觸發(fā)生，并且在較低級(jí)別的自組裝三維網(wǎng)絡(luò)中和有序連接的高級(jí)別神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)中均測(cè)得明顯的神經(jīng)活動(dòng)。
[0027](3)采用本發(fā)明的裝置形成的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)較現(xiàn)有方法更接近體內(nèi)真實(shí)情況，且細(xì)胞觀察方便。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0028]圖1顯示硅硼玻璃微球的自組裝以及神經(jīng)細(xì)胞在硅硼玻璃上生長(zhǎng)。圖1A是硅硼玻璃微球自組裝過(guò)程的示意圖。圖1B-1E是神經(jīng)細(xì)胞在硅硼玻璃微球上粘附并生長(zhǎng)的掃描電鏡照片。
[0029]圖2顯示在自組裝的硅硼玻璃微球支架上形成三維神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)及三維神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)中的功能分化。圖2A是支架上生長(zhǎng)的三維神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的熒光照片。圖2B是三維神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)中神經(jīng)細(xì)胞興奮性和抑制性功能分化的統(tǒng)計(jì)圖。
[0030]圖3顯示膠質(zhì)細(xì)胞包裹的水凝膠微球自組裝支架上，生成三維神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。
[0031]圖4顯示本發(fā)明的裝置中微流控小室的幾何限制幫助硅硼玻璃微球支架的組裝，以及微流控芯片引導(dǎo)下的兩個(gè)小室中三維神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)間的有序連接以及多級(jí)別神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)在芯片中生長(zhǎng)。圖4A是微流控芯片引導(dǎo)下，兩個(gè)小室中分別組裝成有序三維神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，并在兩者間生成有序連接的示意圖。圖4B是在微流控芯片中生成的多級(jí)別三維神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的熒光照片。圖4C是一個(gè)小室中的三維神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)向另一個(gè)小室中伸出突起以形成連接的熒光照片。
[0032]圖5顯示本發(fā)明的裝置的制備過(guò)程以及采用本發(fā)明的裝置所制備的多級(jí)三維神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)中多層、多方向的相互連接。圖5A是多層微流控芯片制備過(guò)程的示意圖。圖5B是在本發(fā)明裝置中多級(jí)三維神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)多層、多方向連接的熒光照片。
[0033]圖6顯示本發(fā)明的裝置中，微流控芯片兩個(gè)小室內(nèi)三維支架上生長(zhǎng)的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)可進(jìn)行鈣信號(hào)測(cè)量的實(shí)例。圖6A是鈣信號(hào)熒光序列中的一幀照片。圖6B是圖6A中9號(hào)和12號(hào)神經(jīng)細(xì)胞鈣信號(hào)的序列。圖6C是圖6A中所有神經(jīng)細(xì)胞兩兩之間在時(shí)域上的相關(guān)系數(shù)矩陣。圖6D是圖6A中所有神經(jīng)細(xì)胞兩兩之間的歸一化距離矩陣。

【具體實(shí)施方式】
[0034]下面結(jié)合附圖并通過(guò)【具體實(shí)施方式】來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案。
[0035]實(shí)施例1原代神經(jīng)細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞的獲取和培養(yǎng)
[0036](一)原代神經(jīng)細(xì)胞
[0037]1.分離全腦。取懷孕16-18天的SD大鼠的胚胎。用眼科鑷剝除胎鼠頭部皮膚和頭蓋軟骨，取出全腦，置于解剖液中。解剖液為無(wú)I丐、鎂的hanks緩沖液,提前置于冰上預(yù)冷。
[0038]2.分離特定組織，如大腦皮層或海馬組織。于解剖鏡下用尖頭鑷劃斷大腦兩個(gè)半球間的胼胝體，去除蛛網(wǎng)膜。若需分離大腦皮層，則將兩個(gè)大腦半球的皮層部分剝離，置于冰上的解剖液中。若需分離取海馬組織，則在去除蛛網(wǎng)膜后，將兩個(gè)大腦半球內(nèi)的海馬分別剝離，置于冰上的解剖液中。
[0039]3.消化。用眼科剪將取出的步驟2中取出的組織剪碎，加入不含酚紅的胰蛋白酶，在37°C水浴消化15分鐘，以破壞細(xì)胞之間的連接。胰蛋白酶溶液工作濃度為0.25%。
[0040]4.制備細(xì)胞懸液。消化結(jié)束后,用預(yù)熱的含血清的種植液終止消化。種植液為DMEM/F12培養(yǎng)基混合10%胎牛血清。用種植液洗2_3遍，以徹底去除胰酶。用移液器吹打，使細(xì)胞成為較為均勻的懸液。
[0041]5.離心。將細(xì)胞懸液靜置約2分鐘，使未能消化完全的細(xì)小組織塊沉淀。取上層細(xì)胞懸液離心3分鐘，轉(zhuǎn)速為1300轉(zhuǎn)/分鐘。
[0042]6.重懸。棄上清液，加入適量種植液，用移液器吹打均勻，得到的細(xì)胞懸液可用于原代神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)。
[0043]7.培養(yǎng)。置于37°C, 5% 二氧化碳的無(wú)菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在顯微鏡下觀察,待細(xì)胞貼壁后，將種植液置換為預(yù)熱的培養(yǎng)液。培養(yǎng)液為neurobasal培養(yǎng)基混合2%B27因子和l%GlutaMAX-l。長(zhǎng)期培養(yǎng)時(shí)，每3天用預(yù)熱的培養(yǎng)液半量換液一次。
[0044](二)原代星形膠質(zhì)細(xì)胞
[0045]1.細(xì)胞懸液制備。取出生第二天的SD大鼠，參照“原代神經(jīng)細(xì)胞”1-4步。得到較為均勻的細(xì)胞懸液。其中第2步中分離的組織為大腦皮層。
[0046]2.過(guò)濾、離心。將細(xì)胞懸液靜置約2分鐘，使未能消化完全的細(xì)小組織塊沉淀。取上層細(xì)胞懸液，用200目的濾網(wǎng)過(guò)濾，過(guò)濾后得到的細(xì)胞懸液離心2分鐘，轉(zhuǎn)速為1100轉(zhuǎn)/分鐘。
[0047]3.重懸。棄上清液，加入適量種植液，用移液器吹打均勻，得到的細(xì)胞懸液加入六孔板中，置于37°C, 5% 二氧化碳的無(wú)菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0048]4.梯度貼壁。將六孔板中的細(xì)胞懸液移入另一個(gè)六孔板中,六孔板提前用多聚賴氨酸孵育兩小時(shí)以上。注意避免絮狀物。
[0049]5.純化。24小時(shí)后，給六孔板中的細(xì)胞換液。之后每3天換一次液。待細(xì)胞在六孔板底面基本鋪滿后，將胰酶加入孔板，然后迅速吸出，以除去部分混雜的神經(jīng)細(xì)胞。待細(xì)胞重新貼壁后，將六孔板置于37°C搖床震蕩10小時(shí)，轉(zhuǎn)速為220轉(zhuǎn)/分鐘，之后迅速換液，可除去神經(jīng)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞。重復(fù)搖床處理步驟至六孔板中只剩下星形膠質(zhì)細(xì)胞。
[0050]6.種植。純化后的細(xì)胞，需使用時(shí)，用預(yù)熱的磷酸鹽緩沖液洗一遍，加入預(yù)熱的胰酶于37°C下消化5分鐘，加入種植液終止消化。用移液器將孔板中的細(xì)胞吹打均勻，將細(xì)胞懸液收集至離心管中離心2分鐘，轉(zhuǎn)速為1100轉(zhuǎn)/分鐘。棄上清，加入適量種植液吹打均勻，所得細(xì)胞懸液即可用于原代星形膠質(zhì)細(xì)胞種植。
[0051]7.培養(yǎng)。純化后的細(xì)胞或種植后的細(xì)胞需長(zhǎng)期培養(yǎng)時(shí)，每3天用預(yù)熱的種植液換一次液。
[0052]實(shí)施例2玻璃微球的自組裝以及細(xì)胞的種植
[0053]微球的自組裝
[0054]將微球的懸浮液滴在玻璃片的表面，微球在重力驅(qū)動(dòng)下從基底開(kāi)始組裝，組裝滿底層后再逐層組裝上層，通過(guò)對(duì)基底大小和微球總體積的計(jì)算，可以調(diào)控組裝的層數(shù)(見(jiàn)圖1A)。
[0055]具體為:
[0056]I玻璃微球的前處理:將63微米硅硼玻璃微球(MO-SCI Specialty Products)放到75%的乙醇溶液中過(guò)夜滅菌，并用蒸餾水洗滌三次除去乙醇。然后將微球放入多聚賴氨酸(PDL)溶液中孵育過(guò)夜，用蒸餾水洗滌三次備用。
[0057]其中，上述硅硼玻璃微球的直徑也可以是45微米、90微米、125微米。
[0058]2用吸管將玻璃微球的PDL懸浮液滴在玻璃片上，微球在重力驅(qū)動(dòng)下從基底開(kāi)始組裝，成為緊致的單層結(jié)構(gòu)。將原代星形膠質(zhì)細(xì)胞或神經(jīng)細(xì)胞懸液種植于微球的單層組裝結(jié)構(gòu)上。
[0059]3.粘附細(xì)胞的微球的組裝。待細(xì)胞貼壁后將粘附了細(xì)胞的微球收集，重新撒在具有幾何限制的微流控芯片的小室中，使微球攜帶細(xì)胞形成三維自組裝結(jié)構(gòu)。通過(guò)調(diào)控微球的數(shù)量來(lái)控制三維結(jié)構(gòu)的層數(shù)。
[0060]其中，上述幾何限制的微流控芯片的小室形狀可以是圓形、長(zhǎng)方形、串珠形其中任意一種。幾何限制的邊長(zhǎng)或直徑應(yīng)在微球直徑的100-102倍之間，對(duì)于微球形成規(guī)則的組裝結(jié)構(gòu)最為有效，若該尺寸恰為微球直徑的整數(shù)倍，則理論上可實(shí)現(xiàn)完美組裝。
[0061]4.載有細(xì)胞的三維結(jié)構(gòu)的長(zhǎng)期培養(yǎng)。根據(jù)細(xì)胞的不同種類，參照原代細(xì)胞培養(yǎng)的條件選擇培養(yǎng)基和換液。
[0062]實(shí)施例3水凝膠微球的自組裝及細(xì)胞的種植(見(jiàn)圖3 )
[0063]實(shí)驗(yàn)步驟參照實(shí)施例2。水凝膠微球可購(gòu)買商品化產(chǎn)品。也可由微流控芯片制備，具體方法可參照[Lab on a Chip, 2008, 8, 2, 198-220.] 0其尺寸范圍參照實(shí)施例2。區(qū)別在于第一步:滅菌的酒精劑量需增大，防止在水凝膠微球中含水量較高的影響下，低于有效滅菌濃度范圍。酒精滅菌后水洗時(shí)間每遍延長(zhǎng)至I小時(shí)以上，保證水凝膠內(nèi)的酒精充分?jǐn)U散出來(lái)。多聚賴氨酸孵育后種植細(xì)胞前，用種植液孵育5小時(shí)以上并更換一次種植液,保證水凝膠內(nèi)的液體為適于細(xì)胞生存的滲透壓。
[0064]圖3顯示水凝膠微球支架上形成的三維神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的熒光照片。水凝膠微球自組裝形成三維支架后，在支架表面種植一層原代膠質(zhì)細(xì)胞，待膠質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)至包裹大部分支架表面后，種植神經(jīng)細(xì)胞，并培養(yǎng)至形成三維神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。GFAP為膠質(zhì)細(xì)胞特異性抗體，Tujl為神經(jīng)細(xì)胞特異性抗體。
[0065]實(shí)施例4
[0066]單層微通道連接的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)
[0067]I微流控芯片的制備
[0068]I)聚二甲基硅氧烷芯片模板的制備，主要過(guò)程為光刻，即利用光刻膠在紫外線照射下可改變性質(zhì)的特點(diǎn)制作與設(shè)計(jì)好的掩模上的圖案完全一致的光刻膠硅片模板，具體制備方法可參照[Y.Xia, G.Whitesides, Annual Review of Materials Science,1998，28，15]，在商用晶面為〈111〉的單晶硅片上制備具有一個(gè)微凸型結(jié)構(gòu)；
[0069]2)聚二甲基硅氧烷芯片的制備，方法為軟刻蝕技術(shù)，制備材料為聚二甲基硅氧烷(PDMS, polydimethylsiloxane, 184silicone elastomer,購(gòu)自 Dow Corning),其在普通狀態(tài)下是透明而粘稠的液體，經(jīng)與固化劑反應(yīng)(184silicone elastomer curing agent,購(gòu)自Dow Corning)并加熱后可固化。利用F1DMS可以將娃片模板上的突起圖形轉(zhuǎn)換為對(duì)應(yīng)的凹型圖形，從而得到一與所述凸型條微結(jié)構(gòu)相對(duì)應(yīng)的聚二甲基硅氧烷芯片，其下表面的微凹槽的高度為5微米，寬度在5-50微米范圍內(nèi)選取，間距在30-50微米范圍內(nèi)選取。
[0070]3)在PDMS芯片上打通孔，其中通孔的數(shù)目為2個(gè)或以上，通孔直徑為微球直徑的10-1O2倍之間，通孔邊緣的最近距離可在500-2000微米之間調(diào)節(jié)。之后將芯片有圖案的一面貼合在玻璃片上，通孔與玻璃基底形成小室。
[0071]其中，通孔的形狀可以是圓形、長(zhǎng)方形、串珠形其中的任意一種。
[0072]2細(xì)胞培養(yǎng)
[0073]在神經(jīng)細(xì)胞黏附在微球上后，我們小心的收集黏附有神經(jīng)細(xì)胞的微球，并把它們加入微流芯片的小室內(nèi)(見(jiàn)圖4A)。用含2%B27和l%Glutamax-l的Neurobasal神經(jīng)培養(yǎng)基(GIBC0)，每四天替換一半。
[0074]實(shí)施例5
[0075]多層微通道連接神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(見(jiàn)圖5)
[0076]I多層微通道芯片的制備
[0077]I)通過(guò)光刻的方法獲得翻模模板，模板基底為硅片，凸起圖案由光刻膠構(gòu)成；
[0078]2)將模板放到勻膠機(jī)上，倒入液態(tài)的PDMS，轉(zhuǎn)速為1200-2000轉(zhuǎn)/分鐘，之后將載有PDMS的模板放入烘箱中，加熱固化后得到相應(yīng)厚度為80-40微米的PDMS薄膜，薄膜的一面具有微流通道，其中通道的高度可以在5-10微米范圍內(nèi)選擇，寬度可在5-50微米范圍內(nèi)選擇，每片芯片上通道數(shù)量在12-1O3數(shù)量級(jí)。
[0079]3)將兩片上述PDMS薄膜經(jīng)過(guò)氧等離子體處理后鍵合成一個(gè)多層微通道芯片，一片有圖案的一面與另一片無(wú)圖案的一面貼合，并且上下兩層通道方向相互垂直；
[0080]4)在PDMS芯片上打通孔，其中通孔的數(shù)目為2個(gè)以上，通孔直徑為微球直徑的10-1O2倍之間，通孔邊緣的最近距離可在500-2000微米之間調(diào)節(jié)。之后將芯片有圖案的一面貼合在玻璃片上，通孔與玻璃基底形成小室。
[0081]其中，通孔的形狀可以是圓形、長(zhǎng)方形、串珠形其中的任意一種。
[0082]2細(xì)胞培養(yǎng)
[0083]在神經(jīng)細(xì)胞黏附在微球上后，我們小心的收集黏附有神經(jīng)細(xì)胞的微球，并把它們加入微流芯片的小室內(nèi)。用含2%B27和l%Glutamax-l的Neurobasal神經(jīng)培養(yǎng)基(GIBC0)，
每四天替換一半。
[0084]實(shí)施例6
[0085]微通道芯片上多級(jí)別神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模擬不同腦區(qū)間相互作用
[0086]在芯片內(nèi)不同小室種植不同亞型的神經(jīng)細(xì)胞(如海馬區(qū)中的椎體神經(jīng)細(xì)胞和大腦皮層中的神經(jīng)細(xì)胞等)，誘導(dǎo)各小室的低級(jí)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)之間形成連接，構(gòu)建含不同細(xì)胞類型的高級(jí)別三維神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，從而模擬生理和病理狀態(tài)下不同腦區(qū)之間的神經(jīng)細(xì)胞的連接和相互作用。
[0087]具體為:
[0088]I微通道芯片的制備
[0089]參照實(shí)施例4和實(shí)施例5中微流控芯片制備和多層微通道芯片制備的步驟。根據(jù)需要選擇芯片層數(shù)。
[0090]2細(xì)胞培養(yǎng)
[0091]I)細(xì)胞選取和分離。根據(jù)具體研究?jī)?nèi)容選定腦區(qū)，分離細(xì)胞的步驟參照實(shí)施例1中原代神經(jīng)細(xì)胞部分。
[0092]2)在神經(jīng)細(xì)胞黏附在微球上后，我們小心的收集黏附有神經(jīng)細(xì)胞的微球，并把它們加入微流芯片的小室內(nèi)。用含2%B27和l%Glutamax_l的Neurobasal神經(jīng)培養(yǎng)基(GIBC0)，每四天替換一半。
[0093]實(shí)施例7
[0094]掃描電子顯微鏡表征實(shí)施例2中神經(jīng)細(xì)胞在自組裝結(jié)構(gòu)單元上生長(zhǎng)情況
[0095]具體步驟:
[0096]在37°C將黏附著神經(jīng)細(xì)胞的微球用D-PBS洗滌一次，之后用2.5%戊二醛水溶液在室溫條件下固定4小時(shí)。樣品依次在25%，50%, 70%, 85%, 95%和100%酒精中梯度脫水，每個(gè)濃度30分鐘。經(jīng)過(guò)臨界點(diǎn)干燥(CPD030Critical Point Dryer, Bal-Tec),通過(guò)掃描電子顯微鏡(FEI quanta200)觀察單個(gè)和多個(gè)微球上神經(jīng)細(xì)胞的粘附和生長(zhǎng)情況(見(jiàn)圖1B-1E)。
[0097]實(shí)施例8
[0098]激光共聚焦顯微鏡觀察實(shí)施例2中幾何限制微球自組裝體上形成的三維神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)
[0099]具體步驟:
[0100]在37°C將樣品用D-PBS洗滌一次，之后用4%多聚甲醛固定30分鐘。細(xì)胞膜用0.3%Triton X-100滲透15分鐘。在用10%山羊血清進(jìn)行非特異性封閉I小時(shí)后，用神經(jīng)細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞特異性抗體(作用于神經(jīng)細(xì)胞的抗體有Tujl (Sigma)，sm1-312 (Covance)，MAP2 (Millipore), CaMKII (Invitrogen), GABA (Sigma),膠質(zhì)細(xì)胞抗體有 GFAP (Sigma))在 4。。下孵育過(guò)夜，之后用相應(yīng)的二抗染色用于觀察(Alexa Fluor488, 633或555 (sigma))。
[0101]圖2A中，用神經(jīng)細(xì)胞特異性抗體Tujl標(biāo)記了形成的三維神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，顯示了自組裝多層支架上神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的生長(zhǎng)情況。
[0102]本發(fā)明還表征了神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)中神經(jīng)細(xì)胞的功能分化情況。圖2B給出了四批細(xì)胞的統(tǒng)計(jì)結(jié)果，每批60-110個(gè)神經(jīng)細(xì)胞。結(jié)果顯示興奮性和抑制性神經(jīng)細(xì)胞占總體的比例大約分別為70%和30%，與體內(nèi)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)和體外二維神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)研究文獻(xiàn)報(bào)道相符，說(shuō)明三維神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)形成了很好的功能性分化和興奮-抑制平衡。
[0103]實(shí)施例9
[0104]激光共聚焦顯微鏡觀察實(shí)施例4中三維神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的結(jié)構(gòu)
[0105]以不同的熒光染料標(biāo)記不同小室中的三維神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，從而觀察各低級(jí)別神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)之間的連接形成高級(jí)別神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的方式和各神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)之間的相互作用。
[0106]圖4B 為綠色突光活細(xì)胞染料 Tubulin tracker Green (Molecular Probes),標(biāo)記活的神經(jīng)細(xì)胞的細(xì)胞骨架中的微管。具體實(shí)驗(yàn)步驟如下:
[0107]1.將樣品用預(yù)熱的無(wú)鈣鎂的hanks緩沖溶液洗一次；
[0108]2.用DMSO溶解Tubulin tracker Green和等體積的20%濃度的F127,其中Tubulin tracker Green 的最終工作濃度為 250nM ；
[0109]3.將樣品在37°C，5%C02培養(yǎng)箱中避光孵育30分鐘；
[0110]4.用hanks緩沖液洗去沒(méi)有結(jié)合的染料，在熒光顯微鏡下用488nm激發(fā)光觀察。
[0111]圖4C為脂溶性紅色熒光染料DiI (Molecular Probes)標(biāo)記神經(jīng)細(xì)胞的細(xì)胞膜。將分離的神經(jīng)細(xì)胞懸液與DiI染料混合，其中DiI工作濃度為I?5nM，將染色后的細(xì)胞種植與微球上培養(yǎng)成三維神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。
[0112]圖4A示意了兩個(gè)低級(jí)別網(wǎng)絡(luò)中即微球自組裝體的神經(jīng)細(xì)胞通過(guò)微流控通道相互連接。
[0113]實(shí)施例10
[0114]激光共聚焦顯微鏡觀察實(shí)施例5中三維神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的結(jié)構(gòu)。
[0115]圖5A示意了多層芯片上三維神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建過(guò)程。圖5B中綠色熒光為TubulinTracker Green,標(biāo)記神經(jīng)細(xì)胞的微管(同實(shí)施例9)。
[0116]結(jié)果顯示，微球支架上自組裝的低級(jí)別神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)定位在小室中，隨著神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)，網(wǎng)絡(luò)中伸出突起，在上下兩層微流控通道的調(diào)控下沿通道內(nèi)生長(zhǎng)，并進(jìn)入其他自組裝神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的區(qū)域，從而形成更高級(jí)別的多方向連接的更復(fù)雜的三維神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。
[0117]實(shí)施例11
[0118]三維神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的信號(hào)檢測(cè)(圖6)
[0119]用鈣成像的方法對(duì)神經(jīng)活動(dòng)進(jìn)行表征。
[0120]鈣成像的原理是神經(jīng)活動(dòng)發(fā)放時(shí)，神經(jīng)細(xì)胞鈣庫(kù)內(nèi)儲(chǔ)存的鈣離子會(huì)大量進(jìn)入胞漿，活動(dòng)發(fā)放結(jié)束時(shí)，胞漿內(nèi)過(guò)量的鈣離子重新回到鈣庫(kù)，因此鈣離子的濃度與神經(jīng)活動(dòng)過(guò)程相偶聯(lián)。鈣離子染料Fluo4用熒光標(biāo)記了鈣離子，因此熒光強(qiáng)度的增減反映了鈣離子的濃度，進(jìn)而反映了神經(jīng)活動(dòng)的過(guò)程。沿時(shí)間軸對(duì)同一位置進(jìn)行等間隔拍攝，拍攝間隔小于I秒，持續(xù)時(shí)間為10分鐘。圖6A為該序列中的一張。圖中的圓圈標(biāo)記了所有熒光強(qiáng)度有變化的神經(jīng)細(xì)胞，用數(shù)字人為對(duì)其進(jìn)行標(biāo)號(hào)，方便后續(xù)統(tǒng)計(jì)。陰影分別標(biāo)記了兩組神經(jīng)細(xì)胞，每組內(nèi)的神經(jīng)細(xì)胞活動(dòng)發(fā)放在頻域上具有很好的一致性。從所有神經(jīng)細(xì)胞中隨機(jī)選取兩個(gè)，示意了其活動(dòng)發(fā)放曲線(圖6B)?？v軸是鈣信號(hào)的熒光強(qiáng)度，橫軸是時(shí)間。隨后對(duì)兩兩神經(jīng)細(xì)胞之間發(fā)放曲線的相關(guān)性(圖6C)和歸一化距離(圖6D)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，分別得出一個(gè)沿對(duì)角線對(duì)稱的矩陣。橫軸和縱軸都是按序號(hào)排列的神經(jīng)細(xì)胞。最后，對(duì)兩兩神經(jīng)細(xì)胞活動(dòng)的相關(guān)性和距離再次做相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)隨著神經(jīng)細(xì)胞之間距離的增大，活動(dòng)相關(guān)性減小。這與著名的Hebb定律相吻合,即連接在一起的神經(jīng)細(xì)胞活動(dòng)一致。
[0121] 申請(qǐng)人:聲明，本發(fā)明通過(guò)上述實(shí)施例來(lái)說(shuō)明本發(fā)明的詳細(xì)結(jié)構(gòu)特征以及方法，但本發(fā)明并不局限于上述詳細(xì)結(jié)構(gòu)特征以及方法，即不意味著本發(fā)明必須依賴上述詳細(xì)結(jié)構(gòu)特征以及方法才能實(shí)施。所屬【技術(shù)領(lǐng)域】的技術(shù)人員應(yīng)該明了，對(duì)本發(fā)明的任何改進(jìn)，對(duì)本發(fā)明所選用部件的等效替換以及輔助部件的增加、具體方式的選擇等，均落在本發(fā)明的保護(hù)范圍和公開(kāi)范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種體外培養(yǎng)三維神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的裝置，其特征在于，所述裝置包括微流控芯片、用于黏附神經(jīng)細(xì)胞的微球和基底，其中所述微流控芯片包括一層或多層聚二甲基硅氧烷(PDMS)彈性層并具有通孔，所述PDMS彈性層具有供神經(jīng)細(xì)胞突起延伸的微流管道，所述通孔與基底形成用于容納微球的小室；所述微球優(yōu)選為均一直徑；所述小室優(yōu)選為圓形、長(zhǎng)方形或串珠形；以及所述基底優(yōu)選為玻璃基底、PDMS基底或聚苯乙烯(PS)基底。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的裝置，其特征在于，所述微球的直徑為30-140微米，優(yōu)選為40-100微米，更優(yōu)選為40-70微米。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的裝置，其特征在于，所述微球是硅硼玻璃微球和水凝膠微球中的任意一種。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的裝置，其特征在于，所述通孔橫截面的邊長(zhǎng)或直徑為微球直徑的1c1-1O2倍，優(yōu)選20-80倍，更優(yōu)選40-60倍。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的裝置，其特征在于，所述微流管道高度為3微米-10微米,優(yōu)選為4-8微米,最優(yōu)選為5微米。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)所述的裝置，其特征在于，所述微流管道寬度優(yōu)選為5-50微米，更優(yōu)選為10-40微米，最優(yōu)選為20-30微米。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的裝置，其特征在于，當(dāng)采用多層PDMS彈性層時(shí)，下層PDMS彈性層的厚度為40-80微米，優(yōu)選50-70微米，更優(yōu)選60微米，且總厚度為200微米至3毫米，優(yōu)選為500微米至2.5毫米，更優(yōu)選為I毫米至1.5毫米；當(dāng)采用單層PDMS彈性層時(shí)，厚度為150微米至3毫米，優(yōu)選為500微米至2.5毫米，更優(yōu)選為I毫米至1.5毫米。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)所述的裝置的制備方法，其特征在于，所述方法包括Ca)經(jīng)光刻方法得到模板，用PDMS對(duì)模板上的圖案進(jìn)行翻模，得到具有微流管道的所述PDMS彈性層；(b)任選地，將多層所述PDMS彈性層同向疊合，通過(guò)氧等離子體處理使相鄰兩層之間鍵合，并使相鄰兩層中所述微流管道的方向?yàn)?0?90度夾角，優(yōu)選為90度夾角；(c)在所述PDMS彈性層上打通孔；和(d)將所述PDMS彈性層有圖案的一面與基底貼合，通孔與基底形成所述小室。
9.根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)所述的裝置的使用方法，其特征在于，所述方法包括微球的自組裝、將神經(jīng)細(xì)胞種植在所述微球的表面和將黏附有神經(jīng)細(xì)胞的微球放入小室中進(jìn)行培養(yǎng)；其中在種植神經(jīng)細(xì)胞之前優(yōu)選地先種植膠質(zhì)細(xì)胞；所述神經(jīng)細(xì)胞優(yōu)選為原代神經(jīng)細(xì)胞。
10.根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)所述的裝置在神經(jīng)細(xì)胞和分子生物學(xué)、神經(jīng)組織工程、腦機(jī)接口和藥物篩選中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12M3/00GK104342369SQ201310317246
【公開(kāi)日】2015年2月11日 申請(qǐng)日期:2013年7月25日 優(yōu)先權(quán)日:2013年7月25日
【發(fā)明者】蔣興宇, 黃卓, 劉文文, 孫一, 鄭文富 申請(qǐng)人:國(guó)家納米科學(xué)中心