利用確定的細(xì)胞因子組合促進(jìn)成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為脂肪細(xì)胞的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了利用確定的細(xì)胞因子組合促進(jìn)成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為脂肪細(xì)胞。組合物的起效因子為表皮生長(zhǎng)因子、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子、地塞米松、胰島素和PPARγ激動(dòng)劑。本發(fā)明探索出了用于誘導(dǎo)非脂肪前體細(xì)胞的成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為脂肪細(xì)胞的細(xì)胞因子組合，為了研究脂肪細(xì)胞分化提供了新的平臺(tái)，表明體內(nèi)的脂肪細(xì)胞來源可能不僅有脂肪前體細(xì)胞。本發(fā)明方法誘導(dǎo)過程簡(jiǎn)單，可以有效地將成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)為脂肪細(xì)胞。
【專利說明】利用確定的細(xì)胞因子組合促進(jìn)成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為脂肪細(xì)胞

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種細(xì)胞轉(zhuǎn)分化誘導(dǎo)細(xì)胞因子組合物及細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的培養(yǎng)方法，特別促進(jìn)成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為脂肪細(xì)胞確定的細(xì)胞因子組合物以及使用該組合物促進(jìn)成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為脂肪細(xì)胞培養(yǎng)方法。

【背景技術(shù)】
[0002]肥胖發(fā)生的原因是當(dāng)體內(nèi)能量失衡，攝入的能量大于消耗的能量時(shí)，過多的能量主要以脂肪的形式儲(chǔ)存起來，脂肪的重量增加從而導(dǎo)致肥胖的發(fā)生。脂肪主要儲(chǔ)存在機(jī)體的脂肪組織內(nèi)，脂肪組織的增多主要表現(xiàn)為脂肪細(xì)胞的體積變大和脂肪細(xì)胞數(shù)目的增加。但是脂肪細(xì)胞的體積是有一定限度的，不可能無限的變大，所以過多的能量?jī)?chǔ)存主要是依靠更多的新生的脂肪細(xì)胞。因此，脂肪細(xì)胞的分化便成為抑制肥胖的主要關(guān)注熱點(diǎn)。
[0003]小鼠的3T3-L1細(xì)胞系是目前運(yùn)用最廣泛的脂肪細(xì)胞分化研究體系，公認(rèn)的脂肪前體細(xì)胞系。在成脂因子IBMX，DEX和Insulin刺激下，絕大多數(shù)細(xì)胞都能夠被誘導(dǎo)分化為脂肪細(xì)胞。根據(jù)多年的研究，過氧化物酶體增生物激活受體Y (PPARy)是最關(guān)鍵的脂肪細(xì)胞分化轉(zhuǎn)錄因子，PPARY的敲除小鼠是胚胎致死的，由脂肪組織的缺陷造成。此外，脂肪前體細(xì)胞只需添加PPAR Y的配體也可促進(jìn)其分化為脂肪細(xì)胞。CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白家族(C/EBPs)也在脂肪細(xì)胞分化中起著重要作用。C/ΕΒΡβ和C/ΕΒΡδ在分化早期能夠促進(jìn)PPARy的表達(dá)，而C/ΕΒΡα能夠維持PPAR Y的表達(dá)。C/EBP a和PPAR Y —起可以直接激活許多脂肪細(xì)胞分化后的相關(guān)基因。近些年，除了 C/EBPa和PPARy外，還有很多其他的促進(jìn)脂肪細(xì)胞分化的轉(zhuǎn)錄激活因子被發(fā)現(xiàn)，像CREB，SREBP等等。
[0004]通常認(rèn)為脂肪細(xì)胞是由脂肪前體細(xì)胞分化而來，脂肪前體細(xì)胞也被認(rèn)為主要存在于脂肪組織的組織干細(xì)胞微環(huán)境中，當(dāng)需要新的脂肪細(xì)胞生成時(shí)，這些脂肪前體細(xì)胞便會(huì)分化為脂肪細(xì)胞，如同肌肉前體細(xì)胞，肝臟前體細(xì)胞等存在于肌肉和肝臟中。但是脂肪前體細(xì)胞的標(biāo)志基因到目前為止尚未有定論，因此也一直無法完美的從體內(nèi)分離出真正的脂肪前體細(xì)胞進(jìn)行研究。此外，在正常動(dòng)物和人類的機(jī)體內(nèi)，脂肪組織主要存在于腹腔內(nèi)和腹部的皮下內(nèi)。但是肥胖發(fā)生后，機(jī)體各個(gè)部位都會(huì)出現(xiàn)脂肪組織，腎臟周圍，腸系膜周圍，各個(gè)部位的皮下內(nèi)等等，同時(shí)腹腔內(nèi)的脂肪組織也會(huì)急劇增重。這些證據(jù)說明可能分化為脂肪細(xì)胞的細(xì)胞可能不僅有脂肪前體細(xì)胞，在一些特定條件下，一些非脂肪前體細(xì)胞的成纖維細(xì)胞也能夠分化為脂肪細(xì)胞。
[0005]通過將非脂肪前體細(xì)胞，如成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為脂肪細(xì)胞，可以更為清楚地了解脂肪細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化機(jī)制，進(jìn)而指導(dǎo)抑制肥胖藥物的開發(fā)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是: 一種促進(jìn)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的組合物，其起效因子為A、B、C、D和E，其在培養(yǎng)液中的終濃度分別為:
A:表皮生長(zhǎng)因子，終濃度10?30ng/ml ；
B:肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子，終濃度10?30ng/ml ；
C:地塞米松，終濃度100?200nM ；
D:胰島素，I?10 μ g/ml ；
E:PPAR Y激動(dòng)劑，終濃度為0.5?2 μ M。
[0007]作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，Α、Β、C、D、E在培養(yǎng)液中的終濃度分別為:
A:表皮生長(zhǎng)因子，終濃度20?30ng/ml ；
B:肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子，終濃度20?30ng/ml ；
C:地塞米松，終濃度150?200nM ；
D:胰島素,5?10 μ g/ml ；
E:PPAR Y激動(dòng)劑，終濃度為I?2 μ M。
[0008]PPARy激動(dòng)劑選自噻唑烷二酮類藥物，特別的，噻唑烷二酮類藥物選自環(huán)格列酮、恩格列酮和曲格列酮、吡格列酮、羅格列酮、法格列酮、達(dá)格列酮。
[0009]一種成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化誘導(dǎo)培養(yǎng)液，培養(yǎng)液中添加有上述的組合物。
[0010]一種將成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為脂肪細(xì)胞的培養(yǎng)方法，包括如下步驟:
1)分離成纖維細(xì)胞并培養(yǎng)在培養(yǎng)液中；
2)在培養(yǎng)液中加入上述的組合物，
3)繼續(xù)培養(yǎng)，得到脂肪細(xì)胞。
[0011]本發(fā)明的有益效果是:
本發(fā)明探索出了用于誘導(dǎo)非脂肪前體細(xì)胞的成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為脂肪細(xì)胞的細(xì)胞因子組合，為了研究脂肪細(xì)胞分化提供了新的平臺(tái)，表明體內(nèi)的脂肪細(xì)胞來源可能不僅有脂肪前體細(xì)胞。
[0012]本發(fā)明方法誘導(dǎo)過程簡(jiǎn)單，可以有效地將成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)為脂肪細(xì)胞。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0013]圖1是轉(zhuǎn)分化后的脂肪細(xì)胞圖；
圖2是小鼠鼠尾成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為脂肪細(xì)胞的試驗(yàn)結(jié)果；
圖3是最低和最高細(xì)胞因子濃度的細(xì)胞誘導(dǎo)結(jié)果圖。

【具體實(shí)施方式】
[0014]一種促進(jìn)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的組合物，其起效因子為A、B、C、D和E，其在培養(yǎng)液中的終濃度分別為:
A:表皮生長(zhǎng)因子，用于激活細(xì)胞的STAT5信號(hào)通路，終濃度10?30ng/ml ；
B:肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子，用于激活細(xì)胞的STAT5信號(hào)通路，終濃度10?30ng/ml ；
C:地塞米松，用于C/EBP δ的表達(dá)，終濃度100?200ηΜ ；
D:胰島素，加速脂滴的形成，I?10 μ g/ml ；
E:PPAR Y激動(dòng)劑，終濃度為0.5?2 μ M。
[0015]下面結(jié)實(shí)施例及試驗(yàn)數(shù)據(jù)，進(jìn)一步說明本發(fā)明。
[0016]本發(fā)明選用的NIH-3T3細(xì)胞系購自美國(guó)ATCC公司。
[0017]以下實(shí)施例中所用培養(yǎng)基配方如下:
1)細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基
高糖DMEM培養(yǎng)基(Hyclone)添加胎牛血清(終濃度為10 % v/v)和雙抗(青霉素和鏈霉素(Gibco)),雙抗?jié)舛葹?1% ν/ν) ο
[0018]_
2)誘導(dǎo)培養(yǎng)基
添加了細(xì)胞轉(zhuǎn)分化促進(jìn)因子的細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基；
3)油紅儲(chǔ)存液
0.7g油紅染料，200mL異丙醇，震蕩過夜，使用0.2 μ m過濾器過濾，4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0019]脂肪細(xì)胞的形態(tài)鑒定-油紅染色
油紅工作液:油紅儲(chǔ)存液和水以6:4的比例混合,然后再室溫下靜置20分鐘后用0.22Mm濾膜過濾。
[0020]I)將分化后的細(xì)胞從培養(yǎng)箱中取出，移除全部的細(xì)胞培養(yǎng)液；
2)加入500μ1的10%的福爾馬林，在室溫下放置5分鐘；
3)移除10%的福爾馬林，加入500μ1新鮮的福爾馬林，在室溫下至少孵育I個(gè)小時(shí)；
4)移除福爾馬林，然后加入500μ1的60%異丙醇，移除60%異丙醇，讓培養(yǎng)板晾干；
5)加入500μ1油紅工作液，孵育10分鐘；
6)移除油紅工作液，立即用水洗滌，用水洗滌4次
7)移除水，完全晾干，加入100%異丙醇萃取油紅，孵育10分鐘或者更長(zhǎng)；
8)將200μ1萃取后的異丙醇轉(zhuǎn)移到ELISA板中，500nm讀數(shù)，用于定量分析甘油三酯(TG)含量。
[0021]脂肪細(xì)胞的基因表達(dá)鑒定
RNA提取:利用Trizol法提取，具體操作如下:
1)將分化后的細(xì)胞取出，移除培養(yǎng)基，用PBS洗滌一次，然后加入ImlTrizol，裂解30分鐘，然后轉(zhuǎn)移到EP管中；
2)加入200μ I氯仿/ml Trizol,用力振蕩混勻15秒，室溫放置3分鐘，4 °C, 12, 000g離心15分鐘；
3)溶液分成三層，品分為三層:無色的上清水相、中間的白色層及粉紅色的下層有機(jī)相，小心吸取上清至新的離心管；
4)加入500μ I異丙醇，輕輕混勻，室溫放置10分鐘，4 V，12，000 g離心10分鐘；
5)小心去除上清，加入Iml75%乙醇(DEPC水配制)，輕輕混勻，懸浮沉淀，4 °C, 7500g離心5分鐘；
6)去除上清，自然烘干5分鐘左右，加入40μ I DEPC水溶解RNA沉淀；
7)取5μ I進(jìn)行電泳檢測(cè)提取RNA的質(zhì)量，28S條帶亮度是18S條帶兩倍的RNA是質(zhì)量較好的RNA,凝膠與電泳緩沖液需新鮮配制；
8)取2 μ I 測(cè)定 RNA 濃度，RNA 的濃度=OD260 X 稀釋倍數(shù) Χ0.04 μ g/μ L，OD260nm/OD280nm在1.8?2.0視為抽提的RNA的純度很高。
[0022]RNA逆轉(zhuǎn)錄:利用SuperScriptTM II RT逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA ;
熒光實(shí)時(shí)定量 PCR:采用 Takara 公司 SYBR? RT-PCR Kit (Perfect Real Time)定量PCR試劑盒，根據(jù)說明進(jìn)行定量PCR反應(yīng)。
[0023]反應(yīng)條件:
預(yù)變性:95 V 20秒；
變性:95 °C，10秒；
退火:60 °C, 20秒；
孵育:70 °C I秒；
根據(jù)基因的表達(dá)量重復(fù)38?45個(gè)循環(huán)，65?95 °C做溶解曲線，每0.5 °C讀一次板，時(shí)間為I秒。
[0024]實(shí)施例1 NIH-3T3細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化 ABCDE 組:
將復(fù)蘇的NIH-3T3細(xì)胞用細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)兩次，之后進(jìn)行誘導(dǎo)分化，以24孔板培養(yǎng)的一孔為例，細(xì)胞生長(zhǎng)匯聚后，培養(yǎng)基更換為細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基(0.5ml),誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，細(xì)胞因子的終濃度如下:
A:表皮生長(zhǎng)因子，終濃度20ng/ml ；
B:肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子，終濃度20ng/ml ；
C:地塞米松，終濃度10nM ；
D:胰島素,5 μ g/ml ；
E:羅格列酮，終濃度為I μΜ;
每?jī)商旄鼡Q一次誘導(dǎo)培養(yǎng)基，培養(yǎng)兩周。
[0025]空白對(duì)照組:
ΝΙΗ-3Τ3細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化培養(yǎng)條件同ABCDE組，不同之處在于其未使用細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基，僅使用細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基。
[0026]MDIR 誘導(dǎo)組:
ΝΙΗ-3Τ3細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化培養(yǎng)條件同AB⑶E組，不同之處在于其誘導(dǎo)培養(yǎng)中的中添加的細(xì)胞因子如下:
培養(yǎng)條件為在細(xì)胞長(zhǎng)滿后的開始兩天的誘導(dǎo)培養(yǎng)基是添加MDIR的生長(zhǎng)培養(yǎng)基，在后面的誘導(dǎo)培養(yǎng)基更換為添加IR的生長(zhǎng)培養(yǎng)基，每?jī)商鞊Q液一次。具體濃度如下:
IBMX (isobutylmethylxanthine, M):終濃度為 0.5mM ；
地塞米松Dexamethasone (D):終濃度為Iym;
胰島素Insulin (I):終濃度為5 μ g/ml ；
羅格列酮Rosiglitazone (R):終濃度為I μ M。
[0027]試驗(yàn)結(jié)果:
培養(yǎng)兩周后，轉(zhuǎn)分化的細(xì)胞照片如圖1 A所示，從圖中可以看出，傳統(tǒng)的成脂因子MDIR不能促進(jìn)非脂肪前體細(xì)胞的成纖維細(xì)胞分化為脂肪細(xì)胞(MIDR組)，而本發(fā)明的新的細(xì)胞因子組合可以促進(jìn)非脂肪前體細(xì)胞的成纖維細(xì)胞ΝΙΗ-3Τ3分化為脂肪細(xì)胞(AB⑶E組)。如圖所示，在添加誘導(dǎo)因子14天約有50%的細(xì)胞分化。隨著誘導(dǎo)時(shí)間的增長(zhǎng)，會(huì)有更多的細(xì)胞分化為脂肪細(xì)胞直至100% ； 分別檢測(cè)不同培養(yǎng)組中細(xì)胞中PPARy和aP2 mRNA的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果如圖1 B所示，空白對(duì)照組和MIDR誘導(dǎo)組中，沒有檢測(cè)到有PPAR Y和aP2表達(dá)，在AB⑶E組中，PPAR Y和aP2的表達(dá)量較大，說明該組中已經(jīng)形成了較大量的脂肪細(xì)胞；
分別檢測(cè)不同培養(yǎng)組中細(xì)胞中的TG含量，結(jié)果如圖1 C所示，從圖中可以清楚地看出，空白對(duì)照組和MIDR誘導(dǎo)組中幾乎檢測(cè)不到TG，僅有ABCDE組中的TG量較多，說明該組中已經(jīng)形成了較大量的脂肪細(xì)胞。
[0028]實(shí)施例2小鼠鼠尾成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化
鼠尾細(xì)胞的分離和培養(yǎng):室外取小鼠的鼠尾細(xì)胞3cm，用75%酒精浸泡30s，然后轉(zhuǎn)移到添加5倍雙抗的培養(yǎng)基中，在細(xì)胞操作臺(tái)中，將鼠尾轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)板中，然后用手術(shù)剪把鼠尾剪碎；加入37攝氏度預(yù)熱的培養(yǎng)基，5天后，可以看到有細(xì)胞貼壁，12天后，將細(xì)胞消化，鋪板到12孔培養(yǎng)板中，等待細(xì)胞匯聚。
[0029]組:
鼠尾成纖維細(xì)胞的分化:誘導(dǎo)分化步驟和實(shí)施例1的NIH-3T3細(xì)胞完全一致，培養(yǎng)5周并觀察。
[0030]空白對(duì)照組:培養(yǎng)步驟同實(shí)施例1的空白對(duì)照試驗(yàn)。
[0031]誘導(dǎo)組:誘導(dǎo)分化步驟同實(shí)施例1的MDIR誘導(dǎo)試驗(yàn)。
[0032]轉(zhuǎn)分化的細(xì)胞照片如圖2 A所示，從圖中可以看出傳統(tǒng)成脂因子MDIR不能促進(jìn)原代非脂肪前體細(xì)胞的成纖維鼠尾細(xì)胞分化為脂肪細(xì)胞，而本發(fā)明的細(xì)胞因子組合可以促進(jìn)其分化為脂肪細(xì)胞。在添加誘導(dǎo)因子35天約有30%的細(xì)胞分化為脂肪細(xì)胞。
[0033]分別檢測(cè)不同培養(yǎng)組中細(xì)胞中PPAR Y mRNA的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果如圖2 B所示，空白對(duì)照組和MIDR誘導(dǎo)組中，沒有檢測(cè)到有PPAR Y表達(dá)，在AB⑶E組中，PPAR Y的表達(dá)量較大，說明該組中已經(jīng)形成了較大量的脂肪細(xì)胞；
分別檢測(cè)不同培養(yǎng)組中細(xì)胞中的TG含量，結(jié)果如圖2 C所示，從圖中可以清楚地看出，空白對(duì)照組和MIDR誘導(dǎo)組中幾乎檢測(cè)不到TG，僅有ABCDE組中的TG量較多，說明該組中已經(jīng)形成了較大量的脂肪細(xì)胞。
[0034]實(shí)施例3
將復(fù)蘇的NIH-3T3細(xì)胞用細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)兩次，之后進(jìn)行誘導(dǎo)分化，以24孔板培養(yǎng)的一孔為例，細(xì)胞生長(zhǎng)匯聚后，培養(yǎng)基更換為細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基(0.5ml),誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，細(xì)胞因子的終濃度如下:
A:表皮生長(zhǎng)因子，終濃度10 ng/ml ；
B:肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子，終濃度10 ng/ml ；
C:地塞米松，終濃度100 nM ；
D:胰島素，I μ g/ml ；
E:羅格列酮，終濃度為0.5 μΜ；
每?jī)商旄鼡Q一次誘導(dǎo)培養(yǎng)基，培養(yǎng)四周。
[0035]實(shí)施例4
將復(fù)蘇的ΝΙΗ-3Τ3細(xì)胞用細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)兩次，之后進(jìn)行誘導(dǎo)分化，以24孔板培養(yǎng)的一孔為例，細(xì)胞生長(zhǎng)匯聚后，培養(yǎng)基更換為細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基(0.5ml),誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，細(xì)胞因子的終濃度如下: A:表皮生長(zhǎng)因子，終濃度30 ng/ml ；
B:肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子，終濃度30 ng/ml ；
C:地塞米松，終濃度200 nM ；
D:胰島素，10 μ g/ml ；
E:羅格列酮，終濃度為2 μΜ；
每?jī)商旄鼡Q一次誘導(dǎo)培養(yǎng)基，培養(yǎng)兩周。
[0036]實(shí)施例3和4誘導(dǎo)培養(yǎng)后的細(xì)胞照片如圖3所示，從圖中可以看出，兩實(shí)施例中均可以誘導(dǎo)出脂肪細(xì)胞。高濃度的細(xì)胞因子下，誘導(dǎo)的速率更快；低濃度下，也可以成功地誘導(dǎo)出脂肪細(xì)胞。
【權(quán)利要求】
1.一種促進(jìn)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的組合物，其起效因子為A、B、C、D和E，其在培養(yǎng)液中的終濃度分別為: A:表皮生長(zhǎng)因子，終濃度10?30ng/ml ； B:肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子，終濃度10?30ng/ml ； C:地塞米松，終濃度100?200nM ； D:胰島素，I?10 μ g/ml ； E:PPAR Y激動(dòng)劑，終濃度為0.5?2 μ M。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于:Α、B、C、D、E在培養(yǎng)液中的終濃度分別為: A:表皮生長(zhǎng)因子，終濃度20?30ng/ml ； B:肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子，終濃度20?30ng/ml ； C:地塞米松，終濃度150?200nM ； D:胰島素，5?10 μ g/ml ； E:PPAR Y激動(dòng)劑，終濃度為I?2 μ M。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的組合物，其特征在于=PPARy激動(dòng)劑選自噻唑烷二酮類藥物。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的組合物，其特征在于:噻唑烷二酮類藥物選自環(huán)格列酮、恩格列酮和曲格列酮、吡格列酮、羅格列酮、法格列酮、達(dá)格列酮。
5.一種成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化誘導(dǎo)培養(yǎng)液，其特征在于:所述培養(yǎng)液中添加有權(quán)利要求1?4任意一項(xiàng)所述的組合物。
6.一種將成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為脂肪細(xì)胞的培養(yǎng)方法，包括如下步驟: 1)分離成纖維細(xì)胞并培養(yǎng)在培養(yǎng)液中； 2)在培養(yǎng)液中加入權(quán)利要求1?4任意一項(xiàng)所述的組合物， 3)繼續(xù)培養(yǎng)，得到脂肪細(xì)胞。
【文檔編號(hào)】C12N5/077GK104342401SQ201310317410
【公開日】2015年2月11日 申請(qǐng)日期:2013年7月25日 優(yōu)先權(quán)日:2013年7月25日
【發(fā)明者】吳東海, 聶濤, 徐愛民, 李鵬 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院