一種酮還原酶突變體及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種酮還原酶突變體及其制備方法，其源于釀酒酵母的野生型酮還原酶，能夠使5-羥基-3-氧代己酸酯轉(zhuǎn)化為對應(yīng)的順式3,5-二羥基己酸酯，具有I46V、S127N、Q144K中的一個(gè)或多個(gè)突變。本發(fā)明的酮還原酶突變體具有明顯的高比酶活，比野生型酮還原酶提高了2-100倍，利用該酶可生物催化5-羥基-3-氧代己酸酯以生產(chǎn)對應(yīng)的順式3,5-二羥基己酸酯；反應(yīng)條件溫和，對設(shè)備要求低，生產(chǎn)過程無需高溫或者冷卻，能耗低，由于酶催化具有高效，專一的選擇性，故以此法生產(chǎn)他汀類藥物關(guān)鍵中間體順式 3,5-二羥基己酸酯無副產(chǎn)物產(chǎn)生，純化方便；此外反應(yīng)絕大部分溶劑為水，三廢排放低，綠色環(huán)保。
【專利說明】一種酮還原酶突變體及其制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及酮還原酶突變體及其制備方法，特別涉及一種源于釀酒酵母的酮還原酶突變體及其高效制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002]阿托伐他汀鈣(商品名LIPIT0R由輝瑞公司銷售)、羅蘇伐他汀鈣(商品名CREST0R由阿斯利康公司銷售)以及匹伐他汀(商標(biāo)名Lipalo由Nissan Chemical及Kowa公司在日本銷售)，是重要的降膽固醇他汀類藥物。而立體異構(gòu)純的順式3，5-二羥基己酸酯是這些重要的他汀類藥物的關(guān)鍵的手性中間體。在已知的制備這些手性中間體的諸多途徑中，包括化學(xué)法和酶法，都具有很多缺點(diǎn)。由于化學(xué)法合成過程條件苛刻，副反應(yīng)多，產(chǎn)品分離純化難度大，得率低，成本高，使其難以成為用于商品規(guī)模合成的理想方法。采用酶法制備立體異構(gòu)純的順式3，5- 二羥基己酸酯需要使用具有立體選擇性的酮還原酶，但現(xiàn)有的野生型酮還原酶催化活性很較低，使用10g/L粗酶粉20小時(shí)僅可轉(zhuǎn)化lg/L的酮底物，也使其難以成為用于商品規(guī)模合成的理想方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的是提供一種酶催化活性高的酮還原酶及其制備方法。
[0004]實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的的技術(shù)方案是:釀酒酵母(Saccharomces cerevisiae)中天然存在的野生型酮還原酶，能夠使5-羥基-3-氧代己酸酯轉(zhuǎn)化為對應(yīng)的順式3，5- 二羥基己酸酯。本公開內(nèi)容的發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)包括在一定位置突變的酮還原酶與釀酒酵母(Saccharomces cerevisiae)產(chǎn)生的野生型酮還原酶(SEQ ID NO:2)相比表現(xiàn)出增加的催化活性?！耙吧屯€原酶”、“野生型KRED酶”及“野生型KRED酮還原酶”指由源自釀酒酵母(Saccharomces cerevisiae)的野生型酮還原酶基因SEQ ID N0:1編碼的，并具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的酮還原酶。該酶能立體選擇地還原5-羥基-3-氧代己酸酯的3-氧代基因以產(chǎn)生對應(yīng)的順式3，5- 二羥基己酸酯?！耙吧汀敝概c自然中所發(fā)現(xiàn)的一樣的材料或物質(zhì)的形式。例如野生型的蛋白質(zhì)或核酸序列是可以從自然界中的分離并且未經(jīng)過人為修飾的，在生物體中存在的原始序列形式?！霸黾拥拇呋钚浴敝冈隗w外或體內(nèi)試驗(yàn)中所測量的與野生型酮還原酶相比，表現(xiàn)出使底物(例如5-羥基-3-氧代己酸酯)向產(chǎn)物(例如順式3，5-二羥基己酸酯)轉(zhuǎn)化率增加的酮還原酶。
[0005]本發(fā)明提供一種酮還原酶突變體，其源于釀酒酵母(Saccharomces cerevisiae)的野生型酮還原酶，能夠立體選擇地還原5-羥基-3-氧代己酸酯的3-氧代基因以產(chǎn)生對應(yīng)的順式3，5- 二羥基己酸酯。所述酮還原酶突變體，與SEQ ID N0.2的野生型酮還原酶相比表現(xiàn)出更強(qiáng)的催化活性。酮還原酶突變體和編碼這種突變體的多核苷酸可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員通常使用的方法制備。突變體可以通過使編碼該酶的體外重組、多核苷酸誘變、DNA改組、易錯PCR和定向進(jìn)化方法等獲得。
[0006]上述酮還原酶突變體，具有選自以下特征中的一個(gè)或多個(gè)突變:I46V，S127N，Q144K。
[0007]上述酮還原酶突變體，優(yōu)先自序列SEQ ID N0.4。全長突變的酮還原酶對于保持酶的催化活性并不是必需的。相應(yīng)地，應(yīng)考慮酮還原酶突變體的截短的類似物和有催化活性的片段。例如，在一些實(shí)施方案中，C端或N端的數(shù)個(gè)氨基酸可以被刪去。任何特定的截短的類似物或片段可以利用相應(yīng)的試驗(yàn)來評估催化活性。同樣的，額外的氨基酸殘基可以被添加到一個(gè)或兩個(gè)末端而不影響催化活性。額外序列可以是功能性的或非功能性的。例如，額外氨基酸序列可以被用來幫助純化，做為標(biāo)記，或執(zhí)行一些其它的功能。因此，本公開內(nèi)容的酮還原酶突變體可以是融合蛋白的形式，其中酮還原酶突變體(或其片段)諸如通過助溶標(biāo)簽(如SUMO蛋白)、純化標(biāo)簽(如結(jié)合金屬的His標(biāo)簽)和細(xì)菌定位信號(如分泌信號)的實(shí)例而非限制的方式被融合到其它蛋白質(zhì)。
[0008]本發(fā)明提供一種酮還原酶突變體，其酮還原酶活性比野生型酮還原酶的活性至少增強(qiáng)2-100倍。
[0009]上述酮還原酶酶基因突變體，其優(yōu)選自SEQ ID N0.3，其已經(jīng)過序列優(yōu)化以適于在大腸桿菌中表達(dá)。在一些實(shí)施方案中，多核苷酸包括被優(yōu)化用于在特定類型的宿主細(xì)胞中表達(dá)的密碼子。用于各種不同類型的微生物的密碼子的使用和偏好性是已知的，因?yàn)槠涫怯糜谠谶@些微生物的表達(dá)特定的氨基酸的優(yōu)化的密碼子。
[0010]本發(fā)明提供一種重組質(zhì)粒，其優(yōu)選自SEQ ID N0.5，比pET系列及pQE系列表達(dá)載體相比其具有更嚴(yán)謹(jǐn)?shù)谋磉_(dá)控制。在一些實(shí)施方案中，控制序列包括啟動子、前導(dǎo)序列、多腺苷酸化序列、前肽序列、信號肽序列和轉(zhuǎn)錄終止子等。對于細(xì)菌宿主細(xì)胞，指導(dǎo)編碼序列的轉(zhuǎn)錄的適合的啟動子包括但不限于從噬菌體T5、噬菌體T7、噬菌體lambda、大腸桿菌lacUV5操縱子、大腸桿菌trp操縱子、大腸桿菌tac操縱子等。
[0011]本發(fā)明提供一種宿主細(xì)胞，優(yōu)選自大腸桿菌W3110，DH1，和JM109中的一種。表達(dá)酮還原酶突變體的表達(dá)載體可以包含允許載體整合到宿主細(xì)胞基因組中或者載體在細(xì)菌中獨(dú)立于基因組自主復(fù)制的元件。為整合到宿主細(xì)胞基因組中，載體可以通過recombineering重組工程使載體整合到基因組中。
[0012]本發(fā)明提供一種制備酮還原酶突變體的方法，其特征在于包括以下步驟:(a)構(gòu)建表達(dá)酮還原酶突變體的基因工程菌，所述基因工程菌包括宿主細(xì)胞，表達(dá)載體以及酮還原酶突變體基因；(b)篩選得到所述基因工程菌；(C)培養(yǎng)所述基因工程菌；(d)誘導(dǎo)表達(dá)所述基因工程菌；(e)收集和制備酮還原酶突變體。
[0013]所述步驟(a)為將來自釀酒酵母(Saccharomces cerevisiae)的編碼野生型酮還原酶的多核苷酸(SEQ ID NO:I)進(jìn)行序列優(yōu)化后通過全基因合成的方式獲得。將優(yōu)化后的編碼酮還原酶的多核苷酸克隆到表達(dá)載體(SEQ ID N0.5)的啟動子的控制下，得到可以表達(dá)野生型酮還原酶的質(zhì)粒。將所得質(zhì)粒通過標(biāo)準(zhǔn)方法轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DHl中。所用克隆方法為同源重組的方式，所用到的擴(kuò)增引物為:
[0014]F:5' ATTAAAGAGGAGAAATTAACATATGTCTTTCCACCAGCAGTTCTTCA 3’；
[0015]R:5’ AACAGGAGTCCAAGCTCAGCTTATTAAACTTTCTGAGCAGCGTAGTTG 3’。類似的，將編碼酮還原酶突變體的多核苷酸(SEQ ID NO:3)克隆到表達(dá)載體(SEQ ID N0.5)的啟動子的控制下，得到可以表達(dá)酮還原酶突變體的質(zhì)粒。將所得質(zhì)粒通過標(biāo)準(zhǔn)方法轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DHl中。
[0016]所述步驟(c)為挑取含有目的表達(dá)載體的大腸桿菌單菌落接種于1ml高壓滅菌后的第一培養(yǎng)基中，30°C，250rpm過夜培養(yǎng)；次日取IL三角瓶，按1:100的接種比例接入到10ml高壓滅菌后的第二培養(yǎng)基中，于30°C中培養(yǎng)至菌體OD 5_6，立刻將三角瓶置于25°C搖床中，250rpm培養(yǎng)lh，加入IPTG至終濃度0.1mM，并于25°C，250rpm繼續(xù)培養(yǎng)15h。
[0017]所述第一培養(yǎng)基為:胰蛋白胨10 g/L,酵母提取物5 g/L,磷酸氫二鈉3.55 g/L,磷酸二氫鉀3.4 g/L,氯化銨2.68 g/L，硫酸鈉0.71 g/L,七水硫酸鎂0.493 g/L,六水氯化鐵0.027 g/L,甘油5g/L,葡萄糖0.8g/L,滅菌后添加氨節(jié)青霉素至100mg/L。
[0018]所述第二培養(yǎng)基為:胰蛋白胨10 g/L,酵母提取物5 g/L,磷酸氫二鈉3.55 g/L,磷酸二氫鉀3.4 g/L，氯化銨2.68 g/L，硫酸鈉0.71 g/L，七水硫酸鎂0.493 g/L，六水氯化鐵 0.027 g/L,甘油 5g/L，葡萄糖 0.3g/L。
[0019]本發(fā)明具有積極的效果:(1)本發(fā)明的酮還原酶突變體具有明顯的高比酶活，比野生型酮還原酶提高了 2-100倍，利用該酶可生物催化5-羥基-3-氧代己酸酯以生產(chǎn)對應(yīng)的順式3，5- 二羥基己酸酯；(2)本發(fā)明反應(yīng)條件溫和，對設(shè)備要求低，生產(chǎn)過程無需高溫或者冷卻，能耗低，由于酶催化具有高效，專一的選擇性，故以此法生產(chǎn)他汀類藥物關(guān)鍵中間體順式3，5-二羥基己酸酯無副產(chǎn)物產(chǎn)生，純化方便；(3)反應(yīng)絕大部分溶劑為水，三廢排放低，綠色環(huán)保。

【具體實(shí)施方式】
[0020](實(shí)施例1)
[0021]野生型及酮還原酶突變體表達(dá)載體的構(gòu)建
[0022]將來自釀酒酵母(Saccharomces cerevisiae)的編碼野生型酮還原酶的多核苷酸(SEQ ID NO: I)進(jìn)行序列優(yōu)化后通過全基因合成的方式獲得。將優(yōu)化后的編碼酮還原酶的多核苷酸克隆到表達(dá)載體(SEQ ID N0.5)的啟動子的控制下，得到可以表達(dá)野生型酮還原酶的質(zhì)粒。將所得質(zhì)粒通過標(biāo)準(zhǔn)方法轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DHl中。所用克隆方法為同源重組的方式，所用到的擴(kuò)增引物為:
[0023]F:5’ ATTAAAGAGGAGAAATTAACATATGTCTTTCCACCAGCAGTTCTTCA 3’ ；
[0024]R:5’ AACAGGAGTCCAAGCTCAGCTTATTAAACTTTCTGAGCAGCGTAGTTG 3’ 。
[0025]類似的，將編碼酮還原酶突變體的多核苷酸(SEQ ID NO:3)克隆到表達(dá)載體(SEQID N0.5)的啟動子的控制下，得到可以表達(dá)酮還原酶突變體的質(zhì)粒。將所得質(zhì)粒通過標(biāo)準(zhǔn)方法轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DHl中。
[0026]酮還原酶突變體的制備
[0027]挑取含有目的表達(dá)載體的大腸桿菌DHl單菌落接種于1ml高壓滅菌后的培養(yǎng)基中:胰蛋白胨10 g/L,酵母提取物5 g/L,磷酸氫二鈉3.55 g/L,磷酸二氫鉀3.4 g/L,氯化銨2.68 g/L,硫酸鈉0.71 g/L,七水硫酸鎂0.493 g/L,六水氯化鐵0.027 g/L,甘油5g/L，葡萄糖0.8g/L，滅菌后添加氨芐青霉素至100mg/L。30°C，250rpm過夜培養(yǎng)。次日取IL三角瓶，按1:100的接種比例接入到10ml高壓滅菌后的培養(yǎng)基中:胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，磷酸氫二鈉3.55 g/L，磷酸二氫鉀3.4 g/L，氯化銨2.68 g/L，硫酸鈉0.71 g/L，七水硫酸鎂0.493 g/L，六水氯化鐵0.027 g/L，甘油5g/L，葡萄糖0.3g/L。滅菌后添加卡那霉素至50mg/L。于30°C中培養(yǎng)至菌體OD 5-6，立刻將三角瓶置于25°C搖床中，250rpm培養(yǎng)lh。加入IPTG至終濃度0.1mM,并于25°C，250rpm繼續(xù)培養(yǎng)15h。
[0028]培養(yǎng)結(jié)束后，將培養(yǎng)液于4°C，6000g下離心20min最終得到濕菌體2.2g。然后將沉淀用蒸餾水清洗兩次，收集菌體。再次用蒸餾水重懸，在超聲破碎儀下破碎至澄清。破碎后于4°C，12000g下離心30min，收集上清，預(yù)冷至_70°C后用冷凍干燥機(jī)制備凍干粉。最終得到粗酶凍干粉0.35g。
[0029]酮還原酶活性的測定
[0030]由于NADPH在340nm處有吸收峰，而NADP在340nm處無吸收峰，故可通過檢測反應(yīng)過程中NADPH吸光值的變化，而計(jì)算酮還原酶的活性。酮還原酶活力測定體系為:3ml反應(yīng)體系中，依次加入1.5ml 10mM pH7.0 PBS緩沖液，加入終濃度0.2mM NADPH，2mM 6-氰基-(5R)-羥基-3-氧代己酸叔丁酯，加雙蒸水補(bǔ)至2.9ml，充分混勻后置于25°C水浴中。將實(shí)施2中制備的酮還原酶干粉按適當(dāng)?shù)谋壤♂尯螅?0ul加入反應(yīng)體系中，混勻后于340nm處檢測每分鐘的吸光度變化值。參照NADPH標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算酮還原酶的酶活。單位酶活(U)定義為每分鐘生成lymol NADP所需要的酶量。用同樣方法檢測野生型酮還原酶的酶活。根據(jù)檢測的結(jié)果計(jì)算得到改進(jìn)后的酮還原酶突變體比野生型酮還原酶酶活提升了92.8 倍。
[0031]以上所述的具體實(shí)施例，對本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果進(jìn)行了進(jìn)一步詳細(xì)說明，所應(yīng)理解的是，以上所述僅為本發(fā)明的具體實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所做的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0032]序列表
[0033]<110>南京朗恩生物科技有限公司
[0034]<120> 一種酮還原酶突變體及其制備方法
[0035]〈130〉2013
[0036]〈160〉4
[0037]〈170〉PatentIn vers1n 3.3
[0038]〈210〉I
[0039]〈211〉939
[0040]〈212〉DNA
[0041]〈213〉釀酒酵母(Saccharomces cerevisiae)
[0042]〈400〉I
[0043]atgtcatttc accaacagtt ctttaccttg aataatggaa ataaaatccc cgcaatcgcc 60
[0044]atcattggga caggtactag atggtataaa aacgaagaaa cggatgctac cttttcgaac 120
[0045]agtttggtcg aacagattgt ttatgctctg aagttacctg gcattattca cattgatgct 180
[0046]gctgagatct acagaacata tccagaagtt gggaaggcac ttagcctcac cgaaaaacca 240
[0047]agaaatgcaa tattcttgac agacaagtac tcacctcaaa tcaagatgtc agattcccca 300
[0048]gcggatggac tagatttagc tttgaagaag atgggcactg actatgtcga tctatacctt 360
[0049]ttgcatagcc catttgtttc caaagaggtc aacgggttaa gtttggagga agcctggaag 420
[0050]gacatggagc aattgtacaa atcaggtaaa gctaaaaata tcggtgtttc caactttgct 480
[0051]gtggaagact tgcaaagaat tctgaaagtt gcggaagtca agccccaagt taatcaaatt 540
[0052]gagttcagtc ccttcttgca gaatcaaaca ccagggatct acaaattttg ccaagaacat 600
[0053]gatatattgg tagaagcata ctcgccacta ggtcccttac aaaagaaaac agcacaagat 660
[0054]gactctcaac cgtttttcga atacgtgaaa gagttatccg agaaatatat caaatctgaa 720
[0055]gcccaaatta tcctacgttg ggtgaccaaa cgtggcgtgt tgcctgtaac cacctcttcc 780
[0056]aaacctcaaa gaatttctga cgcgcaaaat ttattctctt tcgacttgac ggctgaggaa 840
[0057]gtcgataaga taacggagtt gggcttggaa catgaaccgc taagattgta ttggaataaa 900
[0058]ttgtacggta aatacaacta cgctgctcaa aaagtataa939
[0059]〈210〉2
[0060]〈211〉312
[0061]〈212〉PRT
[0062]〈213〉釀酒酵母(Saccharomces cerevisiae)
[0063]〈400〉2
[0064]Met Ser Phe His Gln Gln Phe Phe Thr Leu Asn Asn Gly Asn Lys lie
[0065]151015
[0066]Pro Ala lie Ala lie lie Gly Thr Gly Thr Arg Trp Tyr Lys Asn Glu
[0067]202530
[0068]Glu Thr Asp Ala Thr Phe Ser Asn Ser Leu Val Glu Gln lie Val Tyr
[0069]354045
[0070]Ala Leu Lys Leu Pro Gly lie lie His lie Asp Ala Ala Glu lie Tyr
[0071]505560
[0072]Arg Thr Tyr Pro Glu Val Gly Lys Ala Leu Ser Leu Thr Glu Lys Pro
[0073]65707580
[0074]Arg Asn Ala lie Phe Leu Thr Asp Lys Tyr Ser Pro Gln lie Lys Met
[0075]859095
[0076]Ser Asp Ser Pro Ala Asp Gly Leu Asp Leu Ala Leu Lys Lys Met Gly
[0077]100105110
[0078]Thr Asp Tyr Val Asp Leu Tyr Leu Leu His Ser Pro Phe Val Ser Lys
[0079]115120125
[0080]Glu Val Asn Gly Leu Ser Leu Glu Glu Ala Trp Lys Asp Met Glu Gln
[0081]130135140
[0082]Leu Tyr Lys Ser Gly Lys Ala Lys Asn lie Gly Val Ser Asn Phe Ala
[0083]145150155160
[0084]Val Glu Asp Leu Gln Arg lie Leu Lys Val Ala Glu Val Lys Pro Gln
[0085]165170175
[0086]Val Asn Gln lie Glu Phe Ser Pro Phe Leu Gln Asn Gln Thr Pro Gly
[0087]180185190
[0088]lie Tyr Lys Phe Cys Gln Glu His Asp lie Leu Val Glu Ala Tyr Ser
[0089]195200205
[0090]Pro Leu Gly Pro Leu Gln Lys Lys Thr Ala Gln Asp Asp Ser Gln Pro
[0091]210215220
[0092]Phe Phe Glu Tyr Val Lys Glu Leu Ser Glu Lys Tyr lie Lys Ser Glu
[0093]225230235240
[0094]Ala Gln lie lie Leu Arg Trp Val Thr Lys Arg Gly Val Leu Pro Val
[0095]245250255
[0096]Thr Thr Ser Ser Lys Pro Gln Arg lie Ser Asp Ala Gln Asn Leu Phe
[0097]260265270
[0098]Ser Phe Asp Leu Thr Ala Glu Glu Val Asp Lys lie Thr Glu Leu Gly
[0099]275280285
[0100]Leu Glu His Glu Pro Leu Arg Leu Tyr Trp Asn Lys Leu Tyr Gly Lys
[0101]290295300
[0102]Tyr Asn Tyr Ala Ala Gln Lys Val
[0103]305310
[0104]〈210〉 3
[0105]〈211〉942
[0106]〈212〉DNA
[0107]〈213〉人工序列
[0108]〈400〉3
[0109]atgtctttcc accagcagtt cttcaccctg aacaacggta acaaaatccc ggctatcgct 60
[0110]atcatcggta ccggtacccg ttggtacaaa aacgaagaaa ccgacgctac cttctctaac 120
[0111]tctctggttg aacaggttgt ttacgctctg aaactgccgg gtatcatcca catcgacgct 180
[0112]gctgaaatct accgtaccta cccggaagtt ggtaaagctc tgtctctgac cgaaaaaccg 240
[0113]cgtaacgcta tcttcctgac cgacaaatac tctccgcaga tcaaaatgtc tgactctccg 300
[0114]gctgacggtc tggacctggc tctgaaaaaa atgggtaccg actacgttga cctgtacctg 360
[0115]ctgcactctc cgttcgttaa caaagaagtt aacggtctgt ctctggaaga agcttggaaa 420
[0116]gacatggaaa aactgtacaa atctggtaaa gctaaaaaca tcggtgtttc taacttcgct 480
[0117]gttgaagacc tgcagcgtat cctgaaagtt gctgaagtta aaccgcaggt taaccagatc 540
[0118]gaattctctc cgttcctgca gaaccagacc ccgggtatct acaaattctg ccaggaacac 600
[0119]gacatcctgg ttgaagctta ctctccgctg ggtccgctgc agaaaaaaac cgctcaggac 660
[0120]gactctcagc cgttcttcga atacgttaaa gaactgtctg aaaaatacat caaatctgaa 720
[0121]gctcagatca tcctgcgttg ggttaccaaa cgtggtgttc tgccggttac cacctcttct 780
[0122]aaaccgcagc gtatctctga cgctcagaac ctgttctctt tcgacctgac cgctgaagaa 840
[0123]gttgacaaaa tcaccgaact gggtctggaa cacgaaccgc tgcgtctgta ctggaacaaa 900
[0124]ctgtacggta aatacaacta cgctgctcag aaagtttaat aa942
[0125]〈210〉4
[0126]〈211〉312
[0127]〈212〉PRT
[0128]〈213〉人工序列
[0129]〈400〉4
[0130]Met Ser Phe His Gln Gln Phe Phe Thr Leu Asn Asn Gly Asn Lys lie
[0131]151015
[0132]Pro Ala lie Ala lie lie Gly Thr Gly Thr Arg Trp Tyr Lys Asn Glu
[0133]202530
[0134]Glu Thr Asp Ala Thr Phe Ser Asn Ser Leu Val Glu Gln Val Val Tyr
[0135]354045
[0136]Ala Leu Lys Leu Pro Gly lie lie His lie Asp Ala Ala Glu lie Tyr
[0137]505560
[0138]Arg Thr Tyr Pro Glu Val Gly Lys Ala Leu Ser Leu Thr Glu Lys Pro
[0139]65707580
[0140]Arg Asn Ala lie Phe Leu Thr Asp Lys Tyr Ser Pro Gln lie Lys Met
[0141]859095
[0142]Ser Asp Ser Pro Ala Asp Gly Leu Asp Leu Ala Leu Lys Lys Met Gly
[0143]100105110
[0144]Thr Asp Tyr Val Asp Leu Tyr Leu Leu His Ser Pro Phe Val Asn Lys
[0145]115120125
[0146]Glu Val Asn Gly Leu Ser Leu Glu Glu Ala Trp Lys Asp Met Glu Lys
[0147]130135140
[0148]Leu Tyr Lys Ser Gly Lys Ala Lys Asn lie Gly Val Ser Asn Phe Ala
[0149]145150155160
[0150]Val Glu Asp Leu Gln Arg lie Leu Lys Val Ala Glu Val Lys Pro Gln
[0151]165170175
[0152]Val Asn Gln lie Glu Phe Ser Pro Phe Leu Gln Asn Gln Thr Pro Gly
[0153]180185190
[0154]lie Tyr Lys Phe Cys Gln Glu His Asp lie Leu Val Glu Ala Tyr Ser
[0155]195200205
[0156]Pro Leu Gly Pro Leu Gln Lys Lys Thr Ala Gln Asp Asp Ser Gln Pro
[0157]210215220
[0158]Phe Phe Glu Tyr Val Lys Glu Leu Ser Glu Lys Tyr lie Lys Ser Glu
[0159]225230235240
[0160]Ala Gln lie lie Leu Arg Trp Val Thr Lys Arg Gly Val Leu Pro Val
[0161]245250255
[0162]Thr Thr Ser Ser Lys Pro Gln Arg lie Ser Asp Ala Gln Asn Leu Phe
[0163]260265270
[0164]Ser Phe Asp Leu Thr Ala Glu Glu Val Asp Lys lie Thr Glu Leu Gly
[0165]275280285
[0166]Leu Glu His Glu Pro Leu Arg Leu Tyr Trp Asn Lys Leu Tyr Gly Lys
[0167]290295300
[0168]Tyr Asn Tyr Ala Ala Gln Lys Val
[0169]305310
[0170]〈210〉5
[0171]〈211〉3390
[0172]〈212〉DNA
[0173]〈213〉人工序列
[0174]〈400〉5
[0175]ctcgagaaat cataaaaaat ttatttgctt tgtgagcgga taacaattataatatgtgga60
[0176]attgtgagcg ctcacaattc cacagaattc attaaagagg agaaattaacatatgaagct120
[0177]taattagctg agcttggact cctgttgata gatccagtaa tgacctcagaactccatctg180
[0178]gatttgttca gaacgctcgg ttgccgccgg gcgtttttta ttggtgagaatccaagctag240
[0179]cttggcgaga ttttcaggag ctaaggaagc taaaatggag aaaaaaatcactggatatac300
[0180]caccgttgat atatcccaat ggcatcgtaa agaacatttt gaggcatttcagtcagttgc360
[0181]tcaatgtacc tataaccaga ccgttcagct ggatattacg gcctttttaaagaccgtaaa420
[0182]gaaaaataag cacaagtttt atccggcctt tattcacatt cttgcccgcctgatgaatgc480
[0183]tcatccggaa tttcgtatgg caatgaaaga cggtgagctg gtgatatgggatagtgttca540
[0184]cccttgttac accgttttcc atgagcaaac tgaaacgttt tcatcgctctggagtgaata600
[0185]ccacgacgat ttccggcagt ttctacacat atattcgcaa gatgtggcgtgttacggtga660
[0186]aaacctggcc tatttcccta aagggtttat tgagaatatg tttttcgtctcagccaatcc720
[0187]ctgggtgagt ttcaccagtt ttgatttaaa cgtggccaat atggacaacttcttcgcccc780
[0188]cgttttcacc atgggcaaat attatacgca aggcgacaag gtgctgatgccgctggcgat840
[0189]tcaggttcat catgccgttt gtgatggctt ccatgtcggc agaatgcttaatgaattaca900
[0190]acagtactgc gatgagtggc agggcggggc gtaatttttt taaggcagttattggtgccc960
[0191]ttaaacgcct ggggtaatga ctctctagct tgaggcatca aataaaacgaaaggctcagt1020
[0192]cgaaagactg ggcctttcgt tttatctgtt gtttgtcggt gaacgctctcctgagtagga1080
[0193]caaatccgcc ctctagagct gcctcgcgcg tttcggtgat gacggtgaaaacctctgaca1140
[0194]catgcagctc ccggagacgg tcacagcttg tctgtaagcg gatgccgggagcagacaagc1200
[0195]ccgtcagggc gcgtcagcgg gtgttggcgg gtgtcggggc gcagccatgacccagtcacg1260
[0196]tagcgatagc ggagtgtata ctggcttaac tatgcggcat cagagcagattgtactgaga1320
[0197]gtgcaccata tgcggtgtga aataccgcac agatgcgtaa ggagaaaataccgcatcagg1380
[0198]cgctcttccg cttcctcgct cactgactcg ctgcgctcgg tcgttcggctgcggcgagcg1440
[0199]gtatcagctc actcaaaggc ggtaatacgg ttatccacag aatcaggggataacgcagga1500
[0200]aagaacatgt gagcaaaagg ccagcaaaag gccaggaacc gtaaaaaggccgcgttgctg1560
[0201]gcgtttttcc ataggctccg cccccctgac gagcatcaca aaaatcgacgctcaagtcag1620
[0202]aggtggcgaa acccgacagg actataaaga taccaggcgt ttccccctggaagctccctc1680
[0203]gtgcgctctc ctgttccgac cctgccgctt accggatacc tgtccgcctttctcccttcg1740
[0204]ggaagcgtgg cgctttctca tagctcacgc tgtaggtatc tcagttcggtgtaggtcgtt1800
[0205]cgctccaagc tgggctgtgt gcacgaaccc cccgttcagc ccgaccgctgcgccttatcc1860
[0206]ggtaactatc gtcttgagtc caacccggta agacacgact tatcgccactggcagcagcc1920
[0207]actggtaaca ggattagcag agcgaggtat gtaggcggtg ctacagagttcttgaagtgg1980
[0208]tggcctaact acggctacac tagaaggaca gtatttggta tctgcgctctgctgaagcca 2040
[0209]gttaccttcg gaaaaagagt tggtagctct tgatccggca aacaaaccaccgctggtagc2100
[0210]ggtggttttt ttgtttgcaa gcagcagatt acgcgcagaa aaaaaggatctcaagaagat2160
[0211]cctttgatct tttctacggg gtctgacgct cagtggaacg aaaactcacgttaagggatt2220
[0212]ttggtcatga gattatcaaa aaggatcttc acctagatcc ttttaaattaaaaatgaagt2280
[0213]tttaaatcaa tctaaagtat atatgagtaa acttggtctg acagttaccaatgcttaatc2340
[0214]agtgaggcac ctatctcagc gatctgtcta tttcgttcat ccatagttgcctgactcccc2400
[0215]gtcgtgtaga taactacgat acgggagggc ttaccatctg gccccagtgctgcaatgata 2460
[0216]ccgcgagacc cacgctcacc ggctccagat ttatcagcaa taaaccagccagccggaagg 2520
[0217]gccgagcgca gaagtggtcc tgcaacttta tccgcctcca tccagtctattaattgttgc2580
[0218]cgggaagcta gagtaagtag ttcgccagtt aatagtttgc gcaacgttgttgccattgct2640
[0219]acaggcatcg tggtgtcacg ctcgtcgttt ggtatggctt cattcagctccggttcccaa 2700
[0220]cgatcaaggc gagttacatg atcccccatg ttgtgcaaaa aagcggttagctccttcggt2760
[0221]cctccgatcg ttgtcagaag taagttggcc gcagtgttat cactcatggttatggcagca 2820
[0222]ctgcataatt ctcttactgt catgccatcc gtaagatgct tttctgtgactggtgagtac2880
[0223]tcaaccaagt cattctgaga atagtgtatg cggcgaccga gttgctcttgcccggcgtca 2940
[0224]atacgggata ataccgcgcc acatagcaga actttaaaag tgctcatcattggaaaacgt3000
[0225]tcttcggggc gaaaactctc aaggatctta ccgctgttga gatccagttcgatgtaaccc3060
[0226]actcgtgcac ccaactgatc ttcagcatct tttactttca ccagcgtttctgggtgagca 3120
[0227]aaaacaggaa ggcaaaatgc cgcaaaaaag ggaataaggg cgacacggaaatgttgaata 3180
[0228]ctcatactct tcctttttca atattattga agcatttatc agggttattgtctcatgagc3240
[0229]ggatacatat ttgaatgtat ttagaaaaat aaacaaatag gggttccgcgcacatttccc3300
[0230]cgaaaagtgc cacctgacgt ctaagaaacc attattatca tgacattaacctataaaaat3360
[0231]aggcgtatca cgaggccctt tcgtcttcac3390
【權(quán)利要求】
1.一種酮還原酶突變體，其源于釀酒酵母的野生型酮還原酶，能夠使5-羥基-3-氧代己酸酯轉(zhuǎn)化為對應(yīng)的順式3，5-二羥基己酸酯，具有以下特征中的一個(gè)或多個(gè)突變:I46V、S127N、Q144K。
2.一種如權(quán)利要求1所述的酮還原酶突變體,其序列為SEQ ID N0.4。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的酮還原酶突變體，其酮還原酶活性比野生型酮還原酶的活性至少增強(qiáng)2-100倍。
4.一種多核苷酸，其編碼如權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的重組多肽。
5.如權(quán)利要求4所述的多核苷酸，其序列為SEQID N0.3。
6.—種重組質(zhì)粒,其包括表達(dá)載體連接權(quán)利要求5所述的多核苷，所述載體序列為SEQID N0.5。
7.—種宿主細(xì)胞，其包含權(quán)利要求6所述的重組質(zhì)粒。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的宿主細(xì)胞，其特征在于:所述細(xì)胞是大腸桿菌，為大腸桿菌W3110, DHU JM109 中的一種。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的宿主細(xì)胞，其中所述重組質(zhì)粒的密碼子已經(jīng)為在所述宿主細(xì)胞中表達(dá)而進(jìn)行了優(yōu)化。
10.一種如權(quán)利要求1、所述酮還原酶突變體的制備方法，包括以下步驟:(a)采用釀酒酵母構(gòu)建表達(dá)酮還原酶突變體的基因工程菌，所述基因工程菌包括宿主細(xì)胞，表達(dá)載體以及酮還原酶突變體基因，所述宿主細(xì)胞為大腸桿菌W3110，DH1，和JM109中的一種；(b)篩選得到所述基因工程菌；(c)培養(yǎng)所述基因工程菌；(d)誘導(dǎo)表達(dá)所述基因工程菌；(e)收集和制備酮還原酶突變體。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述酮還原酶突變體的制備方法，其特征在于:所述步驟(c)為挑取含有目的表達(dá)載體的大腸桿菌單菌落接種于1ml高壓滅菌后的第一培養(yǎng)基中，30°C,250rpm過夜培養(yǎng)；次日取IL三角瓶，按1:100的接種比例接入到10ml高壓滅菌后的第二培養(yǎng)基中，于30°C中培養(yǎng)至菌體OD 5-6，立刻將三角瓶置于25°C搖床中，250rpm培養(yǎng)Ih，加入IPTG至終濃度0.1mM,并于25°C，250rpm繼續(xù)培養(yǎng)15h。
12.—種生產(chǎn)他汀類藥物的關(guān)鍵的手性中間體的方法，包括在與權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的酮還原酶突變體的存在下，使5-羥基-3-氧代己酸酯還原成對應(yīng)的順式3，5- 二羥基己酸酯。
【文檔編號】C12N9/04GK104342410SQ201310319519
【公開日】2015年2月11日 申請日期:2013年7月26日 優(yōu)先權(quán)日:2013年7月26日
【發(fā)明者】丁雪峰 申請人:南京朗恩生物科技有限公司