抗豬圓環(huán)病毒2型的表達(dá)載體和轉(zhuǎn)基因豬及其構(gòu)建方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種抗豬圓環(huán)病毒2型的表達(dá)載體和轉(zhuǎn)基因豬及其構(gòu)建方法，屬于基因工程領(lǐng)域。所述表達(dá)載體是通過分別將H1啟動(dòng)子和pPB-sh2序列連接到pUC57-H1質(zhì)粒上，再將含有l(wèi)oxP-Neo/EGFP基因表達(dá)盒的融合片段連接到pPB-H1-sh2上構(gòu)建得到的。將該載體導(dǎo)入豬的基因組，并采用體細(xì)胞核移植技術(shù)生產(chǎn)出轉(zhuǎn)基因豬。本發(fā)明的表達(dá)載體具有piggyBac轉(zhuǎn)座子，極大地提高了轉(zhuǎn)基因效率，且將普通質(zhì)粒串聯(lián)重組的轉(zhuǎn)基因整合模式變成了單位點(diǎn)單拷貝整合，更好的模擬生物基因的內(nèi)環(huán)境。構(gòu)建的轉(zhuǎn)基因豬通過自身合成siRNA來降解PCV2mRNA，可從根本上抑制豬圓環(huán)病毒2型的感染。
【專利說明】抗豬圓環(huán)病毒2型的表達(dá)載體和轉(zhuǎn)基因豬及其構(gòu)建方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明涉及一種抗豬圓環(huán)病毒2型的表達(dá)載體及其構(gòu)建方法，以及抗豬圓環(huán)病毒2型的轉(zhuǎn)基因豬及其構(gòu)建方法。 【背景技術(shù)】
[0002]豬圓環(huán)病毒，屬于圓環(huán)病毒科，為單股環(huán)狀DNA病毒，分為I型和2型。其中豬圓環(huán)病毒I型(PCVl)不致病，豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)具有致病性。PCV2基因組為共價(jià)閉合、單股環(huán)狀的DNA分子，大小約為1767或1768個(gè)核苷酸。推測(cè)PCV2含有11個(gè)大小不一的開放性閱讀框(Open reading frames, ORFs)，其中0RF1、2、3、4、7和8具有一定的同源性，其余則無任何同源性。PCV2編碼的0RF1、5、7和10位于基因組DNA鏈上，5 — 3順時(shí)針方向相同；0RF2、3、4、6、8、9和11位于互補(bǔ)鏈上，5 — 3逆時(shí)針方向相同；這些基因組彼此重疊，最大限度利用病毒有限的遺傳分子，完成病毒的復(fù)制和包裝過程。11個(gè)ORFs中僅包含兩個(gè)主要功能性O(shè)RFs,分別編碼衣殼蛋白(Cap protein, Cap蛋白)和復(fù)制酶(Replicase, Rep)蛋白，在病毒的生命周期中起到兩個(gè)最主要的基本功能，即病毒基因組的復(fù)制和連續(xù)性包裝。Rep蛋白由PCV最大的開放閱讀框ORFl編碼，與該基因組的滾環(huán)復(fù)制有關(guān)，分子量分別為35.6kDa (PCVl)或35.8kDa (PCV2)。PCVl和PCV2比較，Rep蛋白氨基酸序列同源性達(dá)86%，這也是2種血清型PCV產(chǎn)生抗原交叉性的主要原因。若PCV2中復(fù)制必需的rep和r印’基因發(fā)生突變，可降低病毒DNA的復(fù)制，同時(shí)使病毒蛋白的合成減少90%以上。0RF2基因編碼的Cap蛋白是構(gòu)成病毒衣殼的唯一結(jié)構(gòu)蛋白和最主要的免疫原性蛋白。研究表明，0RF2可以用來區(qū)分PCVl與PCV2，通過合成肽分析免疫相關(guān)區(qū)域，發(fā)現(xiàn)病毒0RF2的25~43aa和169~187aa是兩型PCV之間的兩個(gè)共同的抗原表位。PCV2與PCVlCap蛋白之間雖然具有共同的抗原表位，但不存在交叉反應(yīng)。經(jīng)多肽掃描分析，Cap蛋白N-末端第65~87aa, 113~139aa、157~183aa和193~207aa為PCV2特異性的抗原位點(diǎn)
[0003]在養(yǎng)豬業(yè)疾病防控中，疫苗是人們用來對(duì)付疾病的最常用手段。而由于圓環(huán)病毒滅活疫苗與亞單位疫苗成本高、注射次數(shù)多和容易造成機(jī)體應(yīng)激等缺點(diǎn)，以及免疫效力有待提高，并不能大規(guī)模的免疫接種。在我國銷售進(jìn)口 PCV2疫苗單一頭份價(jià)格最高達(dá)48元人民幣，而國產(chǎn)滅活疫苗價(jià)格也在10元人民幣左右。絕大多數(shù)養(yǎng)豬戶是無法承受為單一疾病的預(yù)防而花費(fèi)如此的價(jià)格購買疫苗的。另外，雖然疫苗的使用在控制由PCV2感染而引起PMWS中獲得了一些成功，但是這種綜合征的發(fā)病病源是多樣的，而且在其它綜合征上并沒有突破，所以，從其他途徑尋找解決這個(gè)問題的方法顯得更有必要。
[0004]RNAi (RNA interference, RNAi ),又稱反義 RNA (ant1-sense RNA),是指在進(jìn)化過程中高度保守的、由雙鏈RNA (double-stranded RNA, dsRNA)誘發(fā)的同源mRNA高效特異性降解的現(xiàn)象。RNAi技術(shù)可以防止病毒入侵、抑制病毒復(fù)制、減少病毒RNA數(shù)量、阻斷病毒蛋白的表達(dá)，在抗病毒感染領(lǐng)域具有較大的潛力。
[0005]隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展，培育轉(zhuǎn)基因品種已成為可能。目前，常規(guī)育種技術(shù)在實(shí)現(xiàn)豬雜種優(yōu)勢(shì)利用、性能測(cè)定、遺傳評(píng)估及優(yōu)良品種培育方面取得了顯著成就，但其選擇周期長、遺傳進(jìn)展慢等問題一直是培育突破性新品種的“技術(shù)瓶頸”。隨著動(dòng)物基因組學(xué)、蛋白組學(xué)、分子標(biāo)記輔助選擇和動(dòng)物轉(zhuǎn)基因等生物技術(shù)的迅猛發(fā)展，豬種質(zhì)資源創(chuàng)新和新品種培育已進(jìn)入了一個(gè)新的發(fā)展時(shí)期。在這一時(shí)期，研究和開發(fā)豬品種培育新技術(shù)，建立起優(yōu)質(zhì)、高效、環(huán)保型及無公害等重要功能基因高效克隆、基因轉(zhuǎn)化、新品種快速擴(kuò)繁等的技術(shù)體系，是豬新品種培育并建立現(xiàn)代健康養(yǎng)豬業(yè)的前提條件。通過轉(zhuǎn)基因操作改良性狀的生物技術(shù)育種方法，直接針對(duì)育種目標(biāo)，目的性強(qiáng)、周期短，可以同時(shí)改良重要經(jīng)濟(jì)性狀。因此，轉(zhuǎn)基因育種是培育抗病型豬種的關(guān)鍵新技術(shù)，也切實(shí)可行。
[0006]在針對(duì)PCV2的RNAi防治策略上，2011年，李曼等分別構(gòu)建針對(duì)PCV2的rep和cap基因，設(shè)計(jì)并合成了 10對(duì)編碼PCV2特異的ShRNA的DNA寡核苷酸和I對(duì)PCV2非特異(SCR)的shRNA的DNA寡核苷酸，轉(zhuǎn)染PK15細(xì)胞后20h感染PCV2，結(jié)果表明，構(gòu)建的PCV2特異的siRNA表達(dá)質(zhì)粒均能不同程度地抑制PCV2DNA、mRNA及Rep與Cap蛋白在PK-15細(xì)胞內(nèi)的合成。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，針對(duì)128只8周齡BALB/c，感染病毒后檢測(cè)體重、血清中PCV2核酸陽性率以及組織中的PCV2載量，也表明質(zhì)粒能夠有效的抑制PCV2病毒的表達(dá)。
[0007]2008年，F(xiàn)eng, Z等分別針對(duì)PCV2的ORFl和0RF2構(gòu)建了 2個(gè)慢病毒載體表達(dá)shRNA，發(fā)現(xiàn)可以shRNA有效的抑制PCV2病毒的復(fù)制。進(jìn)而將shRNA注射小鼠體內(nèi)，再感染PCV2，在感染后21-28天，脾臟可檢測(cè)到PCV2病毒復(fù)制被有效抑制。
[0008]同年,Wang, H等根據(jù)rep基因設(shè)計(jì)2個(gè)siRNAs,根據(jù)cap基因設(shè)計(jì)I個(gè)siRNA,插入含U6啟動(dòng)子的pSIREN-RetroQZsGreen載體，并進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)和小鼠體內(nèi)試驗(yàn)，結(jié)果表明感染PCV2前或后轉(zhuǎn)染質(zhì)粒能有效抑制PCV2在Dulac細(xì)胞上的復(fù)制，抑制率最高可達(dá)99%以上；動(dòng)物試驗(yàn)中，肌肉注射10 μ g上述不同siRNA分子對(duì)小鼠體內(nèi)PCV2的復(fù)制有一定的抑制作用，其抑制率在26%至99%之間。
[0009]2007年，sun, M等針對(duì)PCV2的r印基因設(shè)計(jì)了 3個(gè)siRNA表達(dá)載體(pS-RepA, pS-RepB和pS-RepC),并在PK15細(xì)胞中進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)3個(gè)質(zhì)粒均能顯著降低PCV2病毒的復(fù)制，以pS-RepC的效果最為明顯。
[0010]2006年，Liu, J等設(shè)計(jì)shRNA表達(dá)載體在PK15細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后病毒mRNA含量顯著降低，接著用小鼠模型驗(yàn)證，通過淋巴結(jié)的病理變化及原位雜交均證明，shRNA表達(dá)載體可有效抑制PCV2的感染。
[0011]上述實(shí)驗(yàn)均未能在豬上進(jìn)行相關(guān)的檢驗(yàn)。作為一種對(duì)養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重?fù)p失的疾病，如果上述RNAi實(shí)驗(yàn)結(jié)果不能在豬上進(jìn)行驗(yàn)證，是不具有說服力的。
[0012]申請(qǐng)?zhí)枮?01210042295.X，發(fā)明名稱為“一種抗豬圓環(huán)病毒2型病轉(zhuǎn)基因豬的構(gòu)建方法”構(gòu)建的轉(zhuǎn)基因豬所使用的載體為pGK-zsGFP-shRNA，其調(diào)控shRNA表達(dá)的啟動(dòng)子為U6，其插入基因組的載體中含有氨芐抗性基因，因此，使得得到的轉(zhuǎn)基因豬的不利于后續(xù)轉(zhuǎn)基因生物安全性試驗(yàn)的展開，且該專利中，結(jié)果只檢測(cè)到了目的基因整合進(jìn)基因組，并未檢測(cè)是否正確表達(dá)siRNA，而這是該轉(zhuǎn)基因豬能否抗病的根本，因此，最終得到的轉(zhuǎn)基因豬能否抗病也是個(gè)未知數(shù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0013]基于此，為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明提供了一種抗豬圓環(huán)病毒2型的表達(dá)載體和轉(zhuǎn)基因豬及其構(gòu)建方法。[0014]為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采取了以下技術(shù)方案:
[0015]一種抗豬圓環(huán)病毒2型的表達(dá)載體的構(gòu)建方法，包括以下步驟:
[0016](I)、用XhoI和EcoRI酶切SEQ ID NO:1的Hl啟動(dòng)子和質(zhì)粒pCyL50，純化，連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，培養(yǎng)后挑選單克隆菌落進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，篩選陽性克隆，酶切鑒定，得到pPB-Hl 質(zhì)粒；
[0017](2)、以SEQ ID NO: 2和SEQ ID NO: 3作為模板及引物進(jìn)行重疊PCR擴(kuò)增得到序列號(hào)為SEQ ID NO:4的pPB-sh2序列，按步驟(I)相同的方法將pPB_sh2序列連接到pPB_Hl質(zhì)粒上,得到序列號(hào)為SEQ ID NO: 11的shRNA分子pPB-Hl_sh2 ；
[0018](3)、分別以質(zhì)粒 pcDNA3.1 (+)和 pT2AL200R175-CAGGS_EGFP 為模板，SEQ ID NO: 5和SEQ ID N0:6、及SEQ ID N0:7和SEQ ID NO:8為引物進(jìn)行第一次PCR擴(kuò)增，純化得到neo基因和EGFP ;各取10ng-200ng混合后作為模板進(jìn)行第二次PCR擴(kuò)增，純化得到neo-EGFP融合基因；用EcoR I和Xba I雙酶切pcDNA3.1 (+)和neo-EGFP融合基因，純化回收酶切產(chǎn)物，連接，構(gòu)建得到pcDNA3.l-Neo-T2A-EGFP載體；
[0019](4)、以 SEQ ID NO: 13 的質(zhì)粒為模板，SEQ ID N0:9 和 SEQ ID N0:10 為引物，PCR擴(kuò)增出含有l(wèi)oxP-Neo/EGFP基因表達(dá)盒的融合片段；按步驟(I)相同的方法將含有l(wèi)oxP-Neo/EGFP基因表達(dá)盒的融合片段連接到pPB_Hl-sh2上，得到抗豬圓環(huán)病毒2型的表達(dá)載體:pPB-Hl-sh2-CMV-Neo/EGFP，序列號(hào)為 SEQ ID NO: 12。
[0020]在其中一個(gè)實(shí)施例中，步驟⑵中重疊PCR擴(kuò)增的反應(yīng)程序?yàn)?98°C 3min ;98°C 10s,50°C 10s,72°C IOs ;30 個(gè)循環(huán)；72°C IOmin0
[0021]在其中一個(gè)實(shí)施例中，步驟(3)中所述第一次PCR的反應(yīng)程序?yàn)?98°C 2min ;98°C 10s，68°C 50s ;35 個(gè)循環(huán)；72°C IOmin ;所述第二次 PCR 的反應(yīng)程序?yàn)?98°C 2min ;98°C IOs ；68°C lmin40s ;35 個(gè)循環(huán)；72°C IOmin0
[0022]在其中一個(gè)實(shí)施例中，步驟(4)中所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)程序?yàn)?98°C 3min ;98°C 30s, 65°C 30s, 72°C 3min ;35 個(gè)循環(huán)；72°C IOmin
[0023]本發(fā)明還提供了上述構(gòu)建方法構(gòu)建得到的抗豬圓環(huán)病毒2型的表達(dá)載體。
[0024]本發(fā)明還提供了一種抗豬圓環(huán)病毒2型的轉(zhuǎn)基因豬的構(gòu)建方法，包括以下步驟:
[0025](I)、將表達(dá)載體pPB-Hl-sh2-CMV-Neo/EGFP與轉(zhuǎn)座酶質(zhì)粒mPB混合共轉(zhuǎn)染豬胎兒成纖維細(xì)胞系，篩選可穩(wěn)定表達(dá)載體的單克隆轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系；
[0026](2)、將獲得的單克隆轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系作為核供體細(xì)胞，注射到卵母細(xì)胞中，構(gòu)建重構(gòu)胚胎，采用常規(guī)育種技術(shù)進(jìn)行培育，即可得到抗豬圓環(huán)病毒2型的轉(zhuǎn)基因豬。
[0027]在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述轉(zhuǎn)染的步驟為:
[0028](I)、把表達(dá)載體pPB-Hl-sh2-CMV_Neo/EGFP與轉(zhuǎn)座酶質(zhì)粒mPB混合加入到1000 μ L Opt1-MEM? I 中，混勻；
[0029](2)、加入7 μ L用前混勻的PLUS?Reagents，混勻后靜置5min ；
[0030](3)、加入 21 μ L 用前混勻的 Lipofectamine?LTX，混勻后靜置 30min ；
[0031](4)、用DMEM洗單層細(xì)胞1_2次，加入1000 μ L DMEM，再把上述(3)的混合液左右輕晃混勻，4-6h后換上含有10%胎牛血清的細(xì)胞生長培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染48小時(shí)。
[0032]在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述表達(dá)載體pPB-Hl-sh2-CMV_Neo/EGFP與轉(zhuǎn)座酶質(zhì)粒mPB的摩爾數(shù)比為3:1。[0033]在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述可穩(wěn)定表達(dá)載體的單克隆轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系的篩選步驟為: [0034]轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，棄培養(yǎng)基，用PBS洗1-2遍單層細(xì)胞，加500 μ g/mLG418篩選濃度培養(yǎng)基4mL，隔天換液，置于39°C，5%C02，飽和濕度繼續(xù)培養(yǎng)至有單個(gè)的細(xì)胞克隆出現(xiàn)時(shí)，分離出單個(gè)的細(xì)胞克隆，并做擴(kuò)大培養(yǎng)，即得單克隆轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。
[0035]本發(fā)明還提供了上述構(gòu)建方法構(gòu)建得到的抗豬圓環(huán)病毒2型的轉(zhuǎn)基因豬。
[0036]本發(fā)明針對(duì)PCV2r印基因，篩選出可以有效抑制PCV2的siRNA (smallinterference RNA)序列，構(gòu)建由 Hl 啟動(dòng)子調(diào)控的 shRNA (short hairpin RNA) piggyBac轉(zhuǎn)座子表達(dá)載體pPB-Hl-Sh2-CMV-Neo/EGFP，再將該載體利用細(xì)胞工程技術(shù)導(dǎo)入豬的基因組，并采用體細(xì)胞核移植技術(shù)生產(chǎn)出轉(zhuǎn)基因豬。檢測(cè)結(jié)果表明:抗豬圓環(huán)病毒2型轉(zhuǎn)基因豬基因組中插入了目的基因，并且成功檢測(cè)到siRNA的表達(dá)。
[0037]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果:
[0038]1、本發(fā)明的表達(dá)載體具有可視化篩選neo-EGFP融合雙標(biāo)記、piggyBac高效轉(zhuǎn)座系統(tǒng)和Lox-Cre酶系統(tǒng)，piggyBac轉(zhuǎn)座子極大地提高了轉(zhuǎn)基因效率，且將普通質(zhì)粒串聯(lián)重組的轉(zhuǎn)基因整合模式變成了單位點(diǎn)單拷貝整合，更好的模擬生物基因的內(nèi)環(huán)境。EGFP綠色熒光標(biāo)記，便于檢測(cè)，其1xp重組位點(diǎn)，也可以方便后期刪除。
[0039]2、本發(fā)明構(gòu)建的轉(zhuǎn)基因豬通過自身合成siRNA來降解PCV2mRNA，可從根本上抑制豬圓環(huán)病毒2型的感染，顯著降低生產(chǎn)成本，提高養(yǎng)豬業(yè)的利潤，減少PCV2對(duì)人和環(huán)境的危害，而且獲得了抗豬圓環(huán)病毒2型的一種轉(zhuǎn)基因豬生物模型，有利于促進(jìn)養(yǎng)豬業(yè)疾病防控的進(jìn)一步研究。
[0040]3、采用本發(fā)明構(gòu)建的表達(dá)載體構(gòu)建的轉(zhuǎn)基因豬，表達(dá)載體上的氨芐基因在整合進(jìn)豬基因組時(shí)會(huì)被轉(zhuǎn)座酶切除，且檢測(cè)到siRNA在轉(zhuǎn)基因豬中特異性的表達(dá)，使得本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因豬更具有實(shí)用性和實(shí)踐性。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0041]圖1為實(shí)施例1中Hl啟動(dòng)子的PCR擴(kuò)增結(jié)果電泳鑒定圖譜，其中M為marker，I為Hl啟動(dòng)子的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；
[0042]圖2為實(shí)施例1中pPB-Hl-sh2質(zhì)粒的PCR擴(kuò)增結(jié)果及酶切電泳鑒定圖譜，其中M為marker，I為pPB-Hl_sh2質(zhì)粒，2為XhoI單酶切鑒定結(jié)果，3為XhoI和AscI雙酶切鑒定結(jié)果;
[0043]圖3為實(shí)施例1中l(wèi)oxP-Neo/EGFP基因表達(dá)盒的融合片段的PCR擴(kuò)增結(jié)果電泳鑒定圖譜，其中M為marker，I為EGFP-Neo融合雙標(biāo)記片段的PCR產(chǎn)物；
[0044]圖4為實(shí)施例1中抗豬圓環(huán)病毒2型的表達(dá)載體:pPB-Hl-sh2-CMV-Neo/EGFP的PCR擴(kuò)增結(jié)果電泳鑒定圖譜電泳，其中M為marker，I為質(zhì)粒pPB-Hl-sh2-CMV_Neo/EGFP，2為XhoI單酶切鑒定結(jié)果，3為SalI和AscI雙酶切鑒定結(jié)果；
[0045]圖5為實(shí)施例1中抗豬圓環(huán)病毒2型的表達(dá)載體:pPB-Hl-sh2-CMV-Neo/EGFP圖譜；
[0046]圖6為實(shí)施例2篩選的抗PCV2轉(zhuǎn)基因細(xì)胞(200x)，其中左為綠色熒光視野，右為白光視野；[0047]圖7為實(shí)施例3的轉(zhuǎn)基因豬綠色熒光檢測(cè)結(jié)果，其中A部分為活體照片，B部分為解剖照片，藍(lán)光為熒光燈藍(lán)光激發(fā)條件下所拍照片，自然光為自然條件下所拍照片；轉(zhuǎn)基因代表獲得的轉(zhuǎn)基因豬，野生型為同期出生的同品種杜洛克非轉(zhuǎn)基因豬。
[0048]圖8為實(shí)施例3的轉(zhuǎn)基因豬PCR、southern blot結(jié)果，其中A部分，M為DNAMarker, I至8為8只不同轉(zhuǎn)基因豬DNA樣品的pPB_sh2目的基因片段PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；9，10為非轉(zhuǎn)基因豬DNA對(duì)照；最后一條泳道是質(zhì)粒對(duì)照汸部分第一張圖代表目的基因片PCR擴(kuò)增電泳結(jié)果，第二張圖代表轉(zhuǎn)座酶質(zhì)粒PCR擴(kuò)增電泳結(jié)果，β-actin為內(nèi)參基因?qū)φ?；B部分，M為DIG標(biāo)記的Marker，IC是將帶有pPB_sh2基因的轉(zhuǎn)基因質(zhì)粒用于Southern雜交的I個(gè)拷貝的陽性對(duì)照，3C是將帶有pPB-sh2基因的轉(zhuǎn)基因質(zhì)粒用于Southern雜交的5個(gè)拷貝的陽性對(duì)照，5C是將帶有pPB-sh2基因的轉(zhuǎn)基因質(zhì)粒用于Southern雜交的10個(gè)拷貝的陽性對(duì)照；1至8為8只不同轉(zhuǎn)基因豬DNA的pPB-sh2基因片段southern blot雜交結(jié)果，9，10為非轉(zhuǎn)基因豬DNA對(duì)照。
[0049]圖9為實(shí)施例3的IPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其中A、B分別代表目的基因在4號(hào)染色體和2號(hào)染色體2個(gè)不同的整合位點(diǎn)示意圖；
[0050]圖10為實(shí)施例3的siRNA相對(duì)定量實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其中603201，603205, 603305為非轉(zhuǎn)基因豬;920603，31502，931503，931504，931506，931600，931601，931602，931603 為轉(zhuǎn)基因豬。
【具體實(shí)施方式】
[0051]以下結(jié)合附圖和具體實(shí)施例來詳細(xì)說明本發(fā)明。
[0052]如無特殊說明，以下實(shí)施例中所使用的試劑均來源于市售，操作方法均為現(xiàn)有常規(guī)操作方法。
[0053]實(shí)施例1抗豬圓環(huán)病毒2型的piggyBac轉(zhuǎn)座子表達(dá)載體:PPB-Hl-sh2-CMV-Neo/EGFP的構(gòu)建
[0054]包括以下步驟:
[0055](I)、合成Hl啟動(dòng)子序列
[0056]Hl啟動(dòng)子的序列來自于商業(yè)性載體pSilencer3.l-Hl-neo質(zhì)粒(Ambion公司)，其長度為99bp。在該Hl啟動(dòng)子序列的5'端加上酶切位點(diǎn)XhoI，3'端加上酶切位點(diǎn)EcoRI，委托公司合成其序列，合成得到Hl的序列為SEQ ID N0:1。將Hl啟動(dòng)子序列插入到質(zhì)粒PUC57 (金斯瑞生物科技有限公司)中，命名為PUC57-H1 ;設(shè)計(jì)引物(Hl-F:GAACCCACTGCTTACTGGCTTATCG ；H1-R:GGCTGGCAACTAGAAGGCACAGTCGAGGC)擴(kuò)增質(zhì)粒PUC57-H1中Hl啟動(dòng)子序列，然后回收PCR產(chǎn)物；由圖1可知，質(zhì)粒pUC57_Hl中Hl啟動(dòng)子擴(kuò)增序列大小與預(yù)期相符(約llObp)?；厥誋l啟動(dòng)子。
[0057](2)、 將Hl啟動(dòng)子序列連接到pCyL50載體(Sanger Institute贈(zèng)送)上；
[0058]將回收的Hl啟動(dòng)子片段與質(zhì)粒pCyL50分別用XhoI和EcoRI酶進(jìn)行酶切。酶切后純化，再利用TaKaRa連接試劑盒進(jìn)行連接。把連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5 α，培養(yǎng)后挑選單克隆菌落進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，通過菌液PCR初步驗(yàn)證是否獲得陽性克隆。再提取陽性克隆的質(zhì)粒，利用XhoI和EcoRI進(jìn)行酶切鑒定，并電泳檢測(cè)酶切結(jié)果。選擇酶切結(jié)果與預(yù)期相符的2-3個(gè)克隆送往上海英駿生物技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行正反兩個(gè)方向測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與目的序列一致，說明成功將Hl啟動(dòng)子連接到pCyL50載體上，即ρΡΒ_Η1質(zhì)粒構(gòu)建成功。
[0059](3)、擴(kuò)增目的基因pPB_sh2序列并連接到ρΡΒ_Η1質(zhì)粒上；
[0060]設(shè)計(jì)重疊延伸引物，并分別在兩端加入酶切位點(diǎn)EcoRI和AscI。
[0061]引物分別如下:
[0062]sh2~F:5’-ggaattcaccacatactggaaaccacttcaagagagtggtttccagtatgtggtttt-3>(SEQ ID NO:2)
[0063]sh2_R:5，-aggcgcgccttccaaaaaaaccacatactggaaaccactc-3’ (SEQ ID NO:3)
[0064]上游DNA 片段 sh2-R(SEQ ID NO:3)和下游 DNA 片段 sh2_F (SEQ ID NO:2)同時(shí)作為重疊延伸PCR的反應(yīng)模板。
[0065]重疊延伸PCR的反應(yīng)體系如下:
[0066]
【權(quán)利要求】
1.一種抗豬圓環(huán)病毒2型的表達(dá)載體的構(gòu)建方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)、用XhoI和EcoRI酶切SEQID NO:1的Hl啟動(dòng)子和質(zhì)粒pCyL50，純化，連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，培養(yǎng)后挑選單克隆菌落進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，篩選陽性克隆，酶切鑒定，得到PPB-Hl質(zhì)粒; (2)、以SEQID NO: 2和SEQ ID NO: 3作為模板及引物進(jìn)行重疊PCR擴(kuò)增得到序列號(hào)為SEQ ID NO:4的pPB-sh2序列，按步驟(I)相同的方法將pPB_sh2序列連接到ρΡΒ_Η1質(zhì)粒上，得到序列號(hào)為SEQ ID NO: 11的shRNA分子pPB-Hl_sh2 ； (3)、分別以質(zhì)粒pcDNA3.1(+)和 pT2AL200R175-CAGGS-EGFP 為模板，SEQ ID NO: 5 和SEQ ID NO: 6、及SEQ ID NO: 7和SEQ ID NO: 8為引物進(jìn)行第一次PCR擴(kuò)增，純化得到neo基因和EGFP ;各取10ng-200ng混合后作為模板進(jìn)行第二次PCR擴(kuò)增，純化得到neo-EGFP融合基因；用EcoR I和Xba I雙酶切pcDNA3.1 (+)和neo_EGFP融合基因，純化回收酶切產(chǎn)物，連接，構(gòu)建得到pcDNA3.l-Neo-T2A-EGFP載體； (4)、以SEQID NO: 13的質(zhì)粒為模板，SEQ ID N0:9和SEQ ID NO: 10為引物，PCR擴(kuò)增出含有l(wèi)oxP-Neo/EGFP基因表達(dá)盒的融合片段；按步驟(I)相同的方法將含有l(wèi)oxP-Neo/EGFP基因表達(dá)盒的融合片段連接到pPB-Hl-sh2上，得到抗豬圓環(huán)病毒2型的表達(dá)載體:pPB-Hl-sh2-CMV-Neo/EGFP，序列號(hào)為 SEQ ID NO: 12。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗豬圓環(huán)病毒2型的表達(dá)載體的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟⑵中重疊PCR擴(kuò)增的程序?yàn)?98°C 3min ；98°C 10s, 50°C 10s，72°C IOs ;30個(gè)循環(huán)；72°C IOmin。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗豬圓環(huán)病毒2型的表達(dá)載體的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟⑶中所述第一次PCR的反應(yīng)程序?yàn)?98°C 2min ；98°C 10s,68 °C 50s ；35個(gè)循環(huán)；72°C IOmin ;所述第二次PCR 的反應(yīng)程序?yàn)?98°C 2min ；98°C IOs ；68°C lmin40s ;35 個(gè)循環(huán)；72°C IOmin。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗豬圓環(huán)病毒2型的表達(dá)載體的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟(4)中所述 PCR 擴(kuò)增的反應(yīng)程序?yàn)?98°C 3min ；98°C 30s, 65°C 30s, 72°C 3min ;35 個(gè)循環(huán)；72°C IOmin。
5.權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的構(gòu)建方法構(gòu)建得到的抗豬圓環(huán)病毒2型的表達(dá)載體。
6.一種抗豬圓環(huán)病毒2型的轉(zhuǎn)基因豬的構(gòu)建方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)、將權(quán)利要求5所述的表達(dá)載體與轉(zhuǎn)座酶質(zhì)粒mPB混合共轉(zhuǎn)染豬胎兒成纖維細(xì)胞系，篩選可穩(wěn)定表達(dá)載體的單克隆轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系； (2)、將獲得的單克隆轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系作為核供體細(xì)胞，注射到卵母細(xì)胞中，構(gòu)建重構(gòu)胚胎，采用常規(guī)育種技術(shù)進(jìn)行培育，即可得到抗豬圓環(huán)病毒2型的轉(zhuǎn)基因豬。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的抗豬圓環(huán)病毒2型的轉(zhuǎn)基因豬的構(gòu)建方法，其特征在于，所述共轉(zhuǎn)染的步驟為: (1)、把表達(dá)載體pPB-Hl-sh2-CMV-Neo/EGFP與轉(zhuǎn)座酶質(zhì)粒mPB混合加入到1000 μ L Opt1-MEMd I 中，混勻； (2)、加入7μ L用前混勻的PLUS?Reagents，混勻后靜置5min ； (3)、加入21μ L用前混勻的Lipofectamine?LTX，混勻后靜置30min ；(4)、用DMEM洗單層細(xì)胞1-2次，加入1000 μ L DMEM，再把上述(3)的混合液左右輕晃混勻，4-6h后換上含有10%胎牛血清的細(xì)胞生長培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染48小時(shí)。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的抗豬圓環(huán)病毒2型的轉(zhuǎn)基因豬的構(gòu)建方法，其特征在于，所述表達(dá)載體pPB-Hl-sh2-CMV-Neo/EGFP與轉(zhuǎn)座酶質(zhì)粒mPB的摩爾數(shù)比為3:1。
9.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的抗豬圓環(huán)病毒2型的轉(zhuǎn)基因豬的構(gòu)建方法，其特征在于，所述可穩(wěn)定表達(dá)載體的單克隆轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系的篩選步驟為: 轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，棄培養(yǎng)基，用PBS洗1-2遍單層細(xì)胞，加500 μ g/mLG418篩選濃度培養(yǎng)基4mL，隔天換液，置于39°C，5%C02，飽和濕度繼續(xù)培養(yǎng)至有單個(gè)的細(xì)胞克隆出現(xiàn)時(shí)，分離出單個(gè)的細(xì)胞克隆，并做擴(kuò)大培養(yǎng)，即得單克隆轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。
10.權(quán)利要求6-9任一 項(xiàng)所述的構(gòu)建方法構(gòu)建得到的抗豬圓環(huán)病毒2型的轉(zhuǎn)基因豬。
【文檔編號(hào)】C12N5/10GK103468733SQ201310321355
【公開日】2013年12月25日 申請(qǐng)日期:2013年7月26日 優(yōu)先權(quán)日:2013年7月26日
【發(fā)明者】徐志謙, 鄒嫻, 張獻(xiàn)偉, 賀曉燕, 石俊松, 劉德武, 李紫聰, 吳珍芳 申請(qǐng)人:吳珍芳, 李紫聰