一種生產(chǎn)瑞替普酶的發(fā)酵培養(yǎng)基及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種用于生產(chǎn)瑞替普酶的發(fā)酵培養(yǎng)基及其制備方法，所述發(fā)酵培養(yǎng)基主要由KH2PO4、K2HPO4 ·2H2O、(NH4)2SO4、FeSO4·7H2O、CaCl2·2H2O、CoCl2·6H2O、CuSO4·5H2O、MnSO4·H2O、Na2MoO4·2H2O、20%酪蛋白、MgSO4、50mg/ml卡那霉素、葡萄糖、檸檬酸、消泡劑、酵母提取物和H2O組成，按照各組培養(yǎng)液組成要求在蒸餾水中溶解并用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值，最后在發(fā)酵罐中滅菌即得。本發(fā)明采用的發(fā)酵培養(yǎng)基減輕了現(xiàn)有工藝發(fā)酵中對(duì)菌體生長和蛋白表達(dá)的抑制作用，使瑞替普酶大腸桿菌表達(dá)水平高，穩(wěn)定性好，提高了瑞替普酶的產(chǎn)率。
【專利說明】一種生產(chǎn)瑞替普酶的發(fā)酵培養(yǎng)基及其制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】：
[0001] 本發(fā)明涉及一種用于生產(chǎn)瑞替普酶的發(fā)酵培養(yǎng)基及其制備方法，屬于微生物發(fā)酵 工程領(lǐng)域。

【背景技術(shù)】
[0002] 現(xiàn)今心腦血管疾病已是人類健康的最大威脅之一，患病人數(shù)逐年上升，而且發(fā)病 年齡也越發(fā)年輕化，田文靜等在"乳糖誘導(dǎo)瑞替普酶在大腸桿菌中的可溶性表達(dá)"（中國生 化藥物雜志，2011，32 (5))-文中指出全世界每年心血管疾病患者多達(dá)1300萬。在中國， 每年需要進(jìn)行腦梗塞、心肌梗塞等血栓類疾病治療的人數(shù)就上百萬，因此研制和生產(chǎn)高效 的溶栓藥就顯得十分必要。趙友春等在"第三代溶血栓藥物研究進(jìn)展"（藥學(xué)進(jìn)展，2004， 28(2) : 72-75)中介紹到，目前溶栓藥物已發(fā)展到第三代，具有快速溶栓，治愈率高，半衰期 長，副作用小等優(yōu)點(diǎn)，在臨床上具有較強(qiáng)的競爭性，但價(jià)格也比較昂貴，所以，生產(chǎn)出低成本 的溶血栓藥物具有顯著的經(jīng)濟(jì)效益和重大的社會(huì)意義。另外，趙友春等在"提高溶栓新藥瑞 替普酶生產(chǎn)得率的中試研究"（化工科技，2003，11(1): 15-17)-文中報(bào)道，目前多數(shù)是 對(duì)瑞替普酶菌株的構(gòu)建和復(fù)性純化研究，而鮮有報(bào)道實(shí)際生產(chǎn)中是如何進(jìn)行菌株工業(yè)化發(fā) 酵生產(chǎn)?，F(xiàn)有技術(shù)中，瑞替普酶的工業(yè)生產(chǎn)中主要采用大腸桿菌進(jìn)行培養(yǎng)，采用更有效的培 養(yǎng)技術(shù)來提高菌體的發(fā)酵密度，能夠提供產(chǎn)物的產(chǎn)率，而選擇合適的發(fā)酵培養(yǎng)基，不僅可以 減少培養(yǎng)體積，強(qiáng)化下游分離提取，還可以縮短生產(chǎn)周期，減少設(shè)備投資，從而降低生產(chǎn)成 本，極大地提高產(chǎn)品的市場競爭力。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 因此，本發(fā)明的目的是提供一種用于生產(chǎn)瑞替普酶的培養(yǎng)基。
[0004] 本發(fā)明的另一目的是提供上述用于生產(chǎn)瑞替普酶的培養(yǎng)基的制備方法。
[0005] 為達(dá)到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是：
[0006] 一種用于生產(chǎn)瑞替普酶的發(fā)酵培養(yǎng)基，主要由KH2P04、K2HP04 ? 2H20、（NH4)2S04、 FeS04 ? 7H20、CaCl2 ? 2H20、CoC12 ? 6H20、CuS04 ? 5H20、MnS04 ?H20、Na2Mo04 ? 2H20、20% 酪蛋 白、MgS04、卡那霉素、葡萄糖、檸檬酸、消泡劑、酵母提取物和4〇組成，其中培養(yǎng)基的主要組 成為：
[0007]A液：每升H20 中含KH2P04 2 5-40g、K2HP04 ? 2H20 57. 5-80g、（NH4)2S04 17. 5-25. 8g、FeS04 ? 7H20 0? 008-0. 015g;
[0008]B液：每升4〇 中含CaCl2 .2H20 0? 8-1. 6g、CoCl2 .6H20 1. 60-2. 93g、CuS04.5H20 1. 5-2. 5g、FeS04 ? 7H20 1. 80-2. 87g、MnS04 ?H20 1. 0-1. 93g、Na2Mo04 ? 2H20 1. 60-2. 67g;
[0009]C液：每升H20 中含 20% 酪蛋白 25. 0-42. 0ml、1MMgS04 1 6 . 0-37 . 0ml、50mg/ml 卡那霉素l〇. 0-23. 5ml、70% 葡萄糖 772. 5-867. 5ml、40%(NH4)2S04 80-120ml、5% 檸檬酸 L5-5. 0ml〇
[0010] 優(yōu)選地，上述用于生產(chǎn)瑞替普酶的發(fā)酵培養(yǎng)基，其中培養(yǎng)基的主要組成為：
[0011]A液：每升H20 中含KH2P04 30-35g、K2HP04 ? 2H20 62. 5-75. 0g、（NH4)2S04 20-23. 33g、FeS04 ? 7H20 0? 010-0. 013g;
[0012] B液：每升H20 中含CaCl2 ? 2H20 1. 0-1. 4g、CoCl2 ? 6H20 2. 0-2. 53g、CuS04 ? 5H20 1. 8-2. 2g、FeS04 ? 7H20 2. 0-2. 67g、MnS04 ?H20 1. 20-1. 73g、Na2Mo04 ? 2H20 1. 80-2. 47g;
[0013]C液：每升4〇 中含 20% 酪蛋白 30. 0-37. 0ml、lMMgS04 21. 5-32 . 0ml、50mg/ml卡 那霉素13.0-20.01111、70%葡萄糖797-8431111、40%(順4) 2504 90-1101111、5%檸檬酸2.5-4.01111。
[0014] 更加優(yōu)選地，上述用于生產(chǎn)瑞替普酶的發(fā)酵培養(yǎng)基，其中培養(yǎng)基的主要組成為 ：
[0015]A液：每升4〇 中含KH2P04 3 2 . 50g、K2HP04 ? 2H20 68. 75g、（NH4)2S04 21. 67g、 FeS04 ? 7H20 0. 012g；
[0016]B液：每升H20 中含CaCl2 ? 2H20 1. 20g、CoCl2 ? 6H20 2. 27g、CuS04 ? 5H20 2. 0g、 FeS04 ? 7H20 2. 33g、MnS04 ?H20 1. 47g、Na2Mo04 ? 2H20 2. 13g;
[0017]C液：每升4〇 中含 20% 酪蛋白 33.33ml、lMMgS04 26 . 67ml、50mg/ml卡那霉素 16. 67ml、70% 葡萄糖 800ml、40% (NH4)2S04 1 00ml、5% 檸檬酸 3. 33ml。
[0018] 更加優(yōu)選地，上述用于生產(chǎn)瑞替普酶的發(fā)酵培養(yǎng)基，其中培養(yǎng)基的主要組成為 ：
[0019]A液：每升H20 中含KH2P04 33. 0g、K2HP04 ? 2H20 70. 0g、（NH4)2S04 22.Og, FeS04 ? 7H20 0.Ollg；
[0020] B液：每升H20 中含CaCl2 ? 2H20 1. 3g、CoCl2 ? 6H20 2. 3g、CuS04 ? 5H20 1. 9g、 FeS04 ? 7H20 2. 5g、MnS04 ?H20 1. 4g、Na2Mo04 ? 2H20 2.Og;
[0021] C液：每升4〇 中含 20% 酪蛋白 35ml、lMMgS04 28ml、50mg/ml卡那霉素 18ml、70% 葡萄糖 821ml、40%(NH4)2S04 95ml、5% 檸檬酸 3. 0ml。
[0022] 上述用于生產(chǎn)瑞替普酶的發(fā)酵培養(yǎng)基，其中酵母提取物的濃度為12%-18%，每升 H20中含消泡劑為0. 3-0. 7ml。
[0023] 上述用于生產(chǎn)瑞替普酶的發(fā)酵培養(yǎng)基的制備方法，具體制備步驟如下：
[0024](1)A、B、C組分配制：
[0025]A液：1200ml，按上述各組分的配比精確稱取規(guī)定的重量份，在蒸餾水中溶解，用 氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH為7.0,然后定容至1200ml，即得；
[0026]B液：150ml，按上述各組分的配比精確稱取規(guī)定的重量份，在適量蒸餾水中溶解， 然后定容至150ml，即得；
[0027]C液：600ml，按上述各組分的配比精確稱取規(guī)定的重量份，其中70%葡萄糖加熱 溶解后，單獨(dú)在115°C下滅菌20min;其余組分除卡那霉素外，充分混勻，然后在121°C下滅 菌20min，冷卻后加入已滅菌的葡萄糖，混合均勻后，再加入卡那霉素，混勻，用蒸餾水補(bǔ)至 600ml，即得；
[0028] (2)酵母提取物配制：500ml，精確稱取規(guī)定的重量份，在蒸餾水中溶解，配制成濃 度為12-18%的溶液，115°C下滅菌20min，即得；
[0029] (3)在發(fā)酵罐中添加純化水8L、消泡劑5ml和1200mlA液、150mlB液，121°C下滅 菌20分鐘，冷卻至30°C時(shí)，再加入之前單獨(dú)滅菌的15%酵母提取物500ml和C液600ml，混 勻，即得。
[0030]利用本發(fā)明的培養(yǎng)基，在重組大腸桿菌發(fā)酵過程中避免或減少了乙酸的生產(chǎn)，減 輕了現(xiàn)有工藝發(fā)酵中對(duì)菌體生長和蛋白表達(dá)的抑制作用，使瑞替普酶大腸桿菌表達(dá)水平 高，穩(wěn)定性好，提高了瑞替普酶的單位產(chǎn)量，降低了生產(chǎn)成本，對(duì)大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)具有非常 重要的意義。

【具體實(shí)施方式】：
[0031] 下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明所述技術(shù)方案作進(jìn)一步的說明。
[0032] 制備實(shí)施例：
[0033] 下面制備實(shí)施例中制備各目的菌體的試劑所用的方法、儀器和操作方式均為本領(lǐng) 域常規(guī)的方法、儀器和操作方式，其中所用的各種試劑均為生化試劑、分析純，購自普通試 劑公司，主要設(shè)備等來源如下表1所示：
[0034]表1
[0035]

【權(quán)利要求】
1. 一種用于生產(chǎn)瑞替普酶的發(fā)酵培養(yǎng)基，其特征在于，由kh2po4、k 2hpo4 *2H20、 (NH4)2S04、FeS04 ? 7H20、CaCl2 ? 2H20、CoC12 ? 6H20、CuS04 ? 5H20、MnS04 ? H20、Na2Mo04 ? 2H20、 20%酪蛋白、MgS04、卡那霉素、葡萄糖、檸檬酸、消泡劑、酵母提取物和托0組成，其中主要組 成為： A 液：每升 H20 中含 KH2P04 2 5-40g、K2HP04 ? 2H20 57. 5-80g、（NH4)2S04 1 7 . 5-25 . 8g、 FeS04 ? 7H20 0? 008-0. 015g ; B 液：每升 H20 中含 CaCl2 ? 2H20 0? 8-1. 6g、CoCl2 ? 6H20 1. 60-2. 93g、CuS04 ? 5H20 1. 5-2. 5g、FeS04 ? 7H20 1. 80-2. 87g、MnS04 ? H20 1. 0-1. 93g、Na2Mo04 ? 2H20 1. 60-2. 67g ; C 液：每升 H20 中含 20% 酪蛋白 25. 0-42. 0ml、lM MgS04 1 6 . 0-37 . 0ml、50mg/ml 卡那霉 素10.0-23.51111、70%葡萄糖772.5-867.51111、40%(順4)250 4 80-1201111、5%檸檬酸1.5-5.01111。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于生產(chǎn)瑞替普酶的發(fā)酵培養(yǎng)基，其特征在于：其中主要組 成為： A 液：每升 H20 中含 KH2P04 30-35g、K2HP04 .2H20 62. 5-75. 0g、（NH4)2S04 20-23 . 33g、 FeS04 ? 7H20 0? 010-0. 013g ; B 液：每升 H20 中含 CaCl2 ? 2H20 1. 0-1. 4g、CoCl2 ? 6H20 2. 0-2. 53g、CuS04 ? 5H20 1. 8-2. 2g、FeS04 ? 7H20 2. 0-2. 67g、MnS04 ? H20 1. 20-1. 73g、Na2Mo04 ? 2H20 1. 80-2. 47g ; 〇液：每升1120中含20%酪蛋白 30.0-37.01111、1]\11%504 21.5-32 . 01111、5011^/1111卡那霉 素 13. 0-20. 0ml、70% 葡萄糖 797-843ml、40%(NH4)2S04 90-110ml、5% 檸檬酸 2. 5-4. 0ml。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的用于生產(chǎn)瑞替普酶的發(fā)酵培養(yǎng)基，其特征在于：其中主 要組成為： A 液：每升 H20 中含 KH2P04 3 2 . 50g、K2HP04 ? 2H20 68. 75g、（NH4)2S04 21. 67g、 FeS04 ? 7H20 0. 012g ； B 液：每升 H20 中含 CaCl2 ? 2H20 1. 20g、CoCl2 ? 6H20 2. 27g、CuS04 ? 5H20 2. 0g、 FeS04 ? 7H20 2. 33g、MnS04 ? H20 1. 47g、Na2Mo04 ? 2H20 2. 13g ; C液：每升1120 中含 20%酪蛋白 33. 33ml、lM MgS04 26 . 67ml、50mg/ml 卡那霉素 16. 67ml、 70% 葡萄糖 800ml、40%(NH4)2S04 1 00ml、5% 檸檬酸 3. 33ml。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的用于生產(chǎn)瑞替普酶的發(fā)酵培養(yǎng)基，其特征在于：其中各 組成為： A 液：每升 H20 中含 KH2P04 33. 0g、K2HP04 .2H20 70. 0g、（NH4)2S04 22. 0g、FeS04.7H20 0. Ollg ； B 液：每升1120 中含 CaCl2 .2H20 1. 3g、CoCl2 .6H20 2. 3g、CuS04.5H20 1. 9g、FeS04.7H20 2. 5g、MnS04 ? H20 1. 4g、Na2Mo04 ? 2H20 2. Og ; C液：每升1120中含20%酪蛋白35ml、lM MgS04 28ml、50mg/ml卡那霉素18ml、70%葡萄 糖 82 lml、40% (NH4) 2S04 95ml、5% 檸檬酸 3. 0ml。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于生產(chǎn)瑞替普酶的發(fā)酵培養(yǎng)基，其特征在于：酵母提取物 濃度為12%_18%，每升H20中含消泡劑為0. 3-0. 7ml。
6. 權(quán)利要求1-5任一所述的用于生產(chǎn)瑞替普酶的發(fā)酵培養(yǎng)基的制備方法，其特征在 于：具體制備步驟如下： (1)A、B、C組分配制： A液：1200ml，按上述各組分的配比精確稱取規(guī)定的重量份，在蒸餾水中溶解，用氫氧 化鈉調(diào)節(jié)pH為7. 0,然后定容至1200ml，即得； B液：150ml，按上述各組分的配比精確稱取規(guī)定的重量份，在適量蒸餾水中溶解，然后 定容至150ml，即得； C液：600ml，按上述各組分的配比精確稱取規(guī)定的重量份，其中70%葡萄糖加熱溶 解后，單獨(dú)在115°C下滅菌20min ;其余組分除卡那霉素外，充分混勻，然后在121°C下滅 菌20min，冷卻后加入已滅菌的葡萄糖，混合均勻后，再加入卡那霉素，混勻，用蒸餾水補(bǔ)至 600ml，即得； (2) 酵母提取物配制：500ml，精確稱取規(guī)定的重量份，在蒸餾水中溶解，配制成濃度為 12-18%的溶液，115°C下滅菌20min，即得； (3) 在發(fā)酵罐中添加純化水8L、消泡劑5ml和1200mlA液、150mlB液，121°C下滅菌20 分鐘，冷卻至30°C時(shí)，再加入之前單獨(dú)滅菌的15%酵母提取物500ml和C液600ml，混勻，即 得。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于生產(chǎn)瑞替普酶的發(fā)酵培養(yǎng)基的制備方法，其特征在于： 所述步驟中發(fā)酵罐容積為19L。
【文檔編號(hào)】C12N9/48GK104342421SQ201310323514
【公開日】2015年2月11日 申請日期:2013年7月30日 優(yōu)先權(quán)日:2013年7月30日
【發(fā)明者】竇啟玲 申請人:貴州益佰制藥股份有限公司