miRNA檢測方法及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種miRNA檢測方法及應(yīng)用。具體地，本發(fā)明提供了一種檢測miRNA的新方法(稱為aLHCD)，該方法包括：(a)將含miRNA的樣品與雙發(fā)夾核酸雜交探針進(jìn)行液相雜交，從而形成含“miRNA-雜交探針”的第一復(fù)合物的液相混合物；(b)對第一復(fù)合物，用限制性內(nèi)切酶進(jìn)行消化，形成一端保留發(fā)夾結(jié)構(gòu)區(qū)的第二復(fù)合物；(c)用單鏈外切酶對第二復(fù)合物進(jìn)行消化，形成第三復(fù)合物；(d)以經(jīng)雙重消化的核酸探針為模板，用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；(e)檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的存在與否和/或數(shù)量，得出待測miRNA的檢測結(jié)果。本發(fā)明方法具有高特異、高靈敏和便利性等特點(diǎn)，不僅可同時(shí)檢測多種miRNA，還可區(qū)分miRNA及其前體。本發(fā)明方法可應(yīng)用于生物學(xué)檢測和臨床醫(yī)學(xué)。
【專利說明】miRNA檢測方法及應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體地涉及一種檢測miRNA的新方法（稱為aLHCD)、及 其在生物學(xué)檢測和臨床醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] miRNA是約22個(gè)堿基長的微型非編碼RNA，它的產(chǎn)生是一個(gè)梯級的過程。RNA 聚合酶II或III轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的長非編碼RNA(稱為pri-miRNAs)，首先由RNA酶DR0SHA剪 切，產(chǎn)生約60-70bp長的前體分子（稱為pre-miRNAs)，再經(jīng)由DICER剪切，產(chǎn)生成熟的 miRNA[D.P.Bartel,Cell,116 (2), 281(2004),K.Okamura,WileyInterdiscipRevRNA, 3(3)，351 (2011)】。
[0003] 現(xiàn)今，業(yè)已證明miRNA是基因表達(dá)調(diào)控的一個(gè)關(guān)鍵子，它可影響幾乎每個(gè)細(xì)胞 生物學(xué)事件，并能參與大部分的人類疾病【Y.Huang,X.J.Shen，Q.Zouetal.，JPhysiol Biochem，67(1)，129(2010)】。
[0004] 由于miRNA如此重要，對其研究呈爆炸性的增長，但miRNA檢測方法的研究明顯滯 后于miRNA自身的研究。
[0005]MiRNA檢測方法明顯滯后的原因，主要是由miRNA自身獨(dú)特的特點(diǎn)所決定的 【K.A.Cissell，S.Shrestha，andS.K.Deo,AnalyticalChemistry79 (13)，4754 (2007) ;M.de Planell-SaguerandM.C.Rodicio,AnalChimActa699 (2), 134 (2011)]：一是miRNA分子喊 基序列特別短，雜交時(shí)的退火溫度低，從而影響雜交的嚴(yán)緊性；二是miRNA與其家族成員僅 有幾個(gè)堿基乃至單個(gè)堿基的區(qū)別，與其多個(gè)靶基因也有相似的序列，與其前體更是有完全 相同的序列【P.ChughandD.P.Dittmer,WileyInterdiscipRevRNA3 (5) ,601 (2012) ;H. Zhou,M.L.Arcila,Z.Lietal.,NucleicAcidsRes40 (13), 5864 (2012) ;M.Thomas,J. Lieberman,andA.Lai,NatStructMolBioll7(10), 1169(2010)】，這對miRNA的檢測特異 性提出了極大的挑戰(zhàn)；三是miRNA沒有poly-A尾巴和5'帽子，這阻止了常規(guī)方法對其特異 性的純化，從而影響檢測的靈敏度和特異性；四是miRNA極短的堿基序列也使引物的設(shè)計(jì) 十分困難，從而影響PCR方法的運(yùn)用；五是不同的GC含量需要不同的退火溫度，特別是對 miRNA這樣很小的分子而言更為明顯，這就嚴(yán)重影響了多個(gè)miRNA的同時(shí)檢測。
[0006] 盡管困難重重，各種各樣的miRNA檢測方法也涌現(xiàn)出來【K.A.Cisselland S.K.Deo,AnalBioanalChem394 (4), 1109 (2009) ;S.TakadaandH.Asahara,Mod Rheumatol(2012)】。目前為止，常用的miRNA檢測方法主要有三大類，其中Northern blotting被看成是檢測單個(gè)miRNA的金標(biāo)準(zhǔn)，PCR適合高靈敏的檢測，芯片適合高通量 的分析【P.ChughandD.P.Dittmer,WileyInterdiscipRevRNA3 (5) ,601 (2012) ;M.de Planell-SaguerandM.C.Rodicio,AnalChimActa699 (2), 134 (2011);E.vanRooij,Circ Resl08 (2), 219 (2011)】。但是Northernblotting方法操作復(fù)雜，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，靈敏度低，不 適合高通量分析。stemloop-PCR因?yàn)橐锏脑O(shè)計(jì)有很大的困難限制了它的應(yīng)用。芯片雖 然可用于多通量的分析，但特異性和可重復(fù)性低。
[0007] 總之，目前的方法很難做到對miRNA高特異、高靈敏和便利性的檢測【P.Chugh andD.P.Dittmer,ffileyInterdiscipRevRNA3 (5), 601 (2012);K.A.Cisselland S.K.Deo,AnalBioanalChem394(4), 1109(2009)】。因此，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)高特異、高 靈敏和便利性的、可同時(shí)檢測多種miRNA的方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的就是提供一種高特異、高靈敏和便利性的、可同時(shí)檢測多種miRNA 的方法。
[0009] 在本發(fā)明的第一方面，提供了一種miRNA檢測方法，包括步驟：
[0010] (a)將含miRNA的樣品與核酸雜交探針進(jìn)行液相雜交，從而形成含"miRNA-雜交探 針"的第一復(fù)合物的液相混合物，其中所述的核酸雜交探針為雙發(fā)夾核酸探針，并且所述的 雙發(fā)夾核酸探針具有：
[0011] (i)位于5'端的第一發(fā)夾結(jié)構(gòu)區(qū)；
[0012] (ii)位于3'端的第二發(fā)夾結(jié)構(gòu)區(qū)；以及
[0013] (iii)位于所述第一發(fā)夾結(jié)構(gòu)區(qū)和第二發(fā)夾結(jié)構(gòu)區(qū)之間的、與待檢測的miRNA互 補(bǔ)的互補(bǔ)結(jié)合區(qū)；
[0014] (b)對所述的"miRNA-雜交探針"第一復(fù)合物，用限制性內(nèi)切酶進(jìn)行消化，從而從 所述第一復(fù)合物中切除第一發(fā)夾結(jié)構(gòu)區(qū)或第二發(fā)夾結(jié)構(gòu)區(qū)，形成一端保留發(fā)夾結(jié)構(gòu)區(qū)的、 經(jīng)酶切的第二復(fù)合物，其中所述的限制性內(nèi)切酶僅切除第一發(fā)夾結(jié)構(gòu)區(qū)或第二發(fā)夾結(jié)構(gòu)區(qū) 而不切割第一復(fù)合物的其他區(qū)域；
[0015] (c)用單鏈外切酶對所述第二復(fù)合物進(jìn)行消化，從而切除所述第二復(fù)合物中在步 驟（b)中切除發(fā)夾結(jié)構(gòu)區(qū)所暴露出的核酸單鏈，形成第三復(fù)合物，并同時(shí)切除多余的未雜 交探針，其中所述第三復(fù)合物由經(jīng)雙重消化后的核酸探針和miRNA構(gòu)成；
[0016] ⑷以所述的經(jīng)雙重消化的核酸探針為模板，用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從而獲得PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物，其中所述擴(kuò)增產(chǎn)物含有對應(yīng)于所述待測miRNA序列的核酸序列區(qū)；
[0017] (e)檢測所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的存在與否和/或數(shù)量，從而得出待測miRNA的檢測結(jié) 果。
[0018] 在另一優(yōu)選例中，所述的檢測結(jié)果為定性或定量結(jié)果。
[0019] 在另一優(yōu)選例中，所述的互補(bǔ)是完全互補(bǔ)。
[0020] 在另一優(yōu)選例中，在步驟（d)中，所述的PCR擴(kuò)增為橋接PCR擴(kuò)增。
[0021] 在另一優(yōu)選例中，在步驟（d)中，在所述的橋接PCR擴(kuò)增中同時(shí)使用橋接引物對和 通用引物對，其中，橋接引物對特異性結(jié)合于所述的經(jīng)雙重消化的核酸探針，而所述通用引 物對特異性結(jié)合于所述橋接引物對的外側(cè)。
[0022] 在另一優(yōu)選例中，所述的橋接引物對由第一橋接引物和第二橋接引物構(gòu)成，其中 第一橋接引物特異性結(jié)合于所述經(jīng)雙重消化的核酸探針中殘留的發(fā)夾結(jié)構(gòu)區(qū)，而第二橋接 引物特異性結(jié)合于所述經(jīng)雙重消化的核酸探針中互補(bǔ)結(jié)合區(qū)。
[0023] 在另一優(yōu)選例中，在步驟（d)中，通過親和素_生物素復(fù)合物信號放大技術(shù)，檢測 所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0024] 在另一優(yōu)選例中，所述的通用引物對的部分或全部引物帶有生物素標(biāo)記；
[0025] 或者所述的通用引物對的上游引物和/或下游引物帶有生物素標(biāo)記。
[0026] 在步驟（d)中，通過親和素_生物素復(fù)合物信號放大技術(shù)，檢測所述PCR擴(kuò)增產(chǎn) 物。
[0027] 在另一優(yōu)選例中，在步驟（e)中，通過標(biāo)記酶顯色進(jìn)行顯色判讀；或通過印跡法或 macroarray方法進(jìn)行檢測。
[0028] 在另一優(yōu)選例中，所述的限制性內(nèi)切酶是識別6個(gè)堿基的限制性內(nèi)切酶；
[0029] 而所述的單鏈外切酶為3'到5'的外切酶。
[0030] 在另一優(yōu)選例中，所述的限制性內(nèi)切酶為BamHI;和/或單鏈外切酶為Exol。
[0031] 在另一優(yōu)選例中，所述的限制性內(nèi)切酶在所述的第一復(fù)合物上僅具有一個(gè)對應(yīng)的 酶切位點(diǎn)，且所述酶切位點(diǎn)位于第一或第二發(fā)夾結(jié)構(gòu)區(qū)的配對區(qū)。
[0032] 在另一優(yōu)選例中，所述方法具有選自下組的一個(gè)或多個(gè)特征：
[0033] ?第一發(fā)夾結(jié)構(gòu)區(qū)具有雙鏈的第一莖部區(qū)和單鏈的第一莖環(huán)區(qū)（loop);
[0034] ?第二發(fā)夾結(jié)構(gòu)區(qū)具有雙鏈的第二莖部區(qū)和單鏈的第二莖環(huán)區(qū)（loop);
[0035] ?所述各莖部區(qū)的長度為6_12bp，較佳地7-10bp;
[0036] ?所述各莖環(huán)區(qū)的長度為4-12bp，較佳地4-10bp，更佳地4-8bp;
[0037] ?所述的互補(bǔ)結(jié)合區(qū)與所述第一發(fā)夾結(jié)構(gòu)區(qū)和/或第二發(fā)夾結(jié)構(gòu)區(qū)之間存在 〇-3bp的間隔區(qū)；較佳地，間隔區(qū)的長度為l_2bp;
[0038] ?所述互補(bǔ)結(jié)合區(qū)的長度與待檢測的miRNA的長度一致，為18_30bp。
[0039] 在本發(fā)明的第二方面，提供了一種用于檢測miRNA的試劑盒，所述試劑盒含有：
[0040] (a)用于與miRNA進(jìn)行雜交的核酸雜交探針，其中所述的核酸雜交探針為雙發(fā)夾 核酸探針，并且所述的雙發(fā)夾核酸探針具有：
[0041] (i)位于5'端的第一發(fā)夾結(jié)構(gòu)區(qū)；
[0042] (ii)位于3'端的第二發(fā)夾結(jié)構(gòu)區(qū)；以及
[0043] (iii)位于所述第一發(fā)夾結(jié)構(gòu)區(qū)和第二發(fā)夾結(jié)構(gòu)區(qū)之間的、與待檢測的miRNA互 補(bǔ)的互補(bǔ)結(jié)合區(qū)；
[0044] (b)使用說明書。
[0045] 在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒還含有一種或多種以下組分：
[0046]?用于擴(kuò)增反應(yīng)的試劑；
[0047]?用于酶切反應(yīng)的試劑；
[0048] ?用于顯色反應(yīng)的試劑。
[0049] 在另一優(yōu)選例中，所述的用于酶切反應(yīng)的試劑包括限制性內(nèi)切酶和/或單鏈外切 酶。
[0050] 在另一優(yōu)選例中，所述試劑盒中含有二種或多種針對不同miRNA的核酸雜交探 針。
[0051] 在本發(fā)明的第三方面，提供了一種用于與miRNA進(jìn)行雜交的核酸雜交探針，所述 的核酸雜交探針為雙發(fā)夾核酸探針，并且所述的雙發(fā)夾核酸探針具有：
[0052] (i)位于5'端的第一發(fā)夾結(jié)構(gòu)區(qū)；
[0053] (ii)位于3'端的第二發(fā)夾結(jié)構(gòu)區(qū)；以及
[0054] (iii)位于所述第一發(fā)夾結(jié)構(gòu)區(qū)和第二發(fā)夾結(jié)構(gòu)區(qū)之間的、與待檢測的miRNA互 補(bǔ)的互補(bǔ)結(jié)合區(qū)。
[0055] 在另一優(yōu)選例中，所述的核酸雜交探針具有選自下組的一個(gè)或多個(gè)特征 ：
[0056] ?第一發(fā)夾結(jié)構(gòu)區(qū)具有雙鏈的第一莖部區(qū)和單鏈的第一莖環(huán)區(qū)（loop);
[0057] ?第二發(fā)夾結(jié)構(gòu)區(qū)具有雙鏈的第二莖部區(qū)和單鏈的第二莖環(huán)區(qū)（loop);
[0058] ?所述各莖部區(qū)的長度為6_12bp，較佳地7-10bp ;
[0059] ?所述各莖環(huán)區(qū)的長度為4-12bp，較佳地4-10bp，更佳地4-8bp;
[0060] ?所述互補(bǔ)結(jié)合區(qū)的長度與待檢測的miRNA的長度一致，為18-30bp。
[0061] 所述的互補(bǔ)結(jié)合區(qū)與所述第一發(fā)夾結(jié)構(gòu)區(qū)和/或第二發(fā)夾結(jié)構(gòu)區(qū)之間存在〇_3bp 的間隔區(qū)；較佳地，間隔區(qū)的長度為l_2bp。
[0062] 在另一優(yōu)選例中，所述第一發(fā)夾結(jié)構(gòu)區(qū)的序列為 5'-ACGTGCGAAAACGCGCGAT-3'（SEQIDN0. :1)。
[0063] 在另一優(yōu)選例中，所述第二發(fā)夾結(jié)構(gòu)區(qū)的序列為5'-TTTATAGGATCCAATAAAAATTGGA TCCTATAC-3'（SEQIDN0. :2)。
[0064] 在本發(fā)明的第四方面，提供了一種探針組合，所述組合包括二種或多種針對不同 miRNA的、本發(fā)明第三方面中所述的核酸雜交探針。
[0065] 應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文（如實(shí)施例）中具 體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0066] 圖1顯示了本發(fā)明方法的流程示意圖。
[0067] 圖2顯示了本發(fā)明一個(gè)實(shí)例中所用核酸雜交探針和引物的序列，其中包括探針的 發(fā)夾結(jié)構(gòu)區(qū)序列、PCR搭橋序列、BIOTIN標(biāo)記的PCR通用引物；
[0068] 圖3顯示了本發(fā)明方法與常規(guī)northernblotting方法對比，本方法的檢測靈敏 度。其中，本發(fā)明方法顯示的是線性動(dòng)力學(xué)范圍內(nèi)的靈敏度，即單獨(dú)用PCR，可達(dá)到lamol水 平（fg級水平）；本發(fā)明方法顯示的顯色反應(yīng)，即PCR后再用ABC檢測放大信號，顯色靈敏 度至少為20zmol(ag級水平）。圖3A顯示了PCR反應(yīng)的線性動(dòng)力學(xué)范圍；圖3B顯示了PCR 反應(yīng)的線性相關(guān)及相關(guān)系數(shù)；圖3C顯了顯色反應(yīng)不同條件下的檢測靈敏度。圖3D顯示了 現(xiàn)有技術(shù)中，常規(guī)Northernblotting法（即Northern印跡法）檢測miR-65的靈敏度。 其中顯示常規(guī)northernblotting的檢測靈敏度僅為lfmol(pg級水平）。其中，按圖中所 不量的Rn〇-miR-65寡聚脫氧核苷酸及其5pmol反義探針通過傳統(tǒng)的基于放射性同位素的 Northern印跡法在42°C下雜交。放射自顯影時(shí)間為12小時(shí)。圖中，Rno表示大鼠。
[0069] 圖4顯示了實(shí)際應(yīng)用中本發(fā)明方法（aLHCD)比常規(guī)Northern印跡法更靈 敏。其中，來自于JEG-3,MG-63,U-20S，5637和T24細(xì)胞的總RNA，使用不同方法分別與 rn〇-mir_29aDNA探針進(jìn)行雜交。（A)使用傳統(tǒng)的基于放射性同位素的Northern印跡法。 (B)使用aLHCD法，PCR擴(kuò)增進(jìn)行20個(gè)循環(huán)。Northern印跡法的起始RNA的20iig，aLHCD 為1iig。Northern印跡法的探針量為5pmol，aLHCD為4pmol。Northern印跡法的雜交溫 度為42°C，aLHCD為45°C。放射自顯影的時(shí)間為12h，使用BCIP/NBT顯色時(shí)間為2min。
[0070] 圖5顯色了本發(fā)明方法與常規(guī)Stem-loop法對比，本方法可有效區(qū)分特定類型 miRNA及其前體。其中的特定類型miRNA是指成熟體miRNA位于前體序列的3'末端。圖 5A通過展示序列方式顯示了這種特定miRNA及其前體都可與常規(guī)的RT-Primer匹配結(jié)合， 導(dǎo)致無法區(qū)分。圖5B通過展示序列方式顯示了這種特定miRNA可與本發(fā)明的特異性探針 匹配結(jié)合，miRNA前體不可與本發(fā)明的特異性探針匹配結(jié)合，從而導(dǎo)致可以有效區(qū)分。圖5C 用實(shí)驗(yàn)證明方式顯示，用常規(guī)方法（Stem-loopmethod)無法區(qū)分miRNA及其前體，而用本 發(fā)明方法（LH-PCR)可以對兩種miRNA及其前體進(jìn)行有效區(qū)分。
[0071] 圖6顯示了本發(fā)明方法可以有效區(qū)分miR-122及其前體。圖中，Rno表示大鼠。圖 6A通過展示序列方式顯示了miR-122前體不能與本發(fā)明探針結(jié)合，而成熟的miR-122則可 與本發(fā)明探針結(jié)合。圖6B通過實(shí)驗(yàn)證明方式顯示了對本發(fā)明可有效區(qū)分miR-122及其前 體。其中，preRNA表示miRNA-122的前體。
[0072] 圖7顯示本發(fā)明方法可在實(shí)際樣品應(yīng)用中可以有效區(qū)分miR-138及其前體。圖 7A通過展示序列方式顯示了miR-138前體不能與本發(fā)明探針結(jié)合，而成熟的miR-138則可 與本發(fā)明探針結(jié)合。圖7B通過實(shí)驗(yàn)證明方式顯示了本發(fā)明可有效區(qū)分miR-138及其前體。 其中，pre表示miRNA-138的前體。
[0073] 圖8顯示了本發(fā)明方法可以有效區(qū)分同一miRNA家族中的不同成員。圖8A通過展 示序列方式顯示了miR-200家族中的不同成員中，僅miR-200b可與本發(fā)明探針完全匹配。 圖8B通過實(shí)驗(yàn)證明方式顯示了本發(fā)明可有效將miR-200b與同一家族中不同成員區(qū)分開。 圖8C通過序列展示方式顯示了miR-29家族中的不同成員中，僅miR-29a可與本發(fā)明探針 完全匹配。圖8D通過實(shí)驗(yàn)證明方式顯示了本發(fā)明可有效將miR-29a與同一家族中不同成 員區(qū)分開。
[0074] 圖9顯示了用本發(fā)明方法對不同組織中多個(gè)miRNA的檢測結(jié)果。

【具體實(shí)施方式】
[0075] 本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，首次開發(fā)了一種新型的檢測miRNA的方法（取 名liquidhybridizationandcolordevelopmentwithsignalamplification,簡寫為 aLHCD)。該方法采用設(shè)計(jì)獨(dú)特的雙發(fā)夾探針，利用獨(dú)特的兩步特異性酶切，通過獨(dú)特的橋接 PCR擴(kuò)增，并與液相雜交顯色法（LHCD)系統(tǒng)連接起來，從而構(gòu)成一個(gè)完整的檢測系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn) 了對miRNA的高特異，高靈敏，多通量和便利化檢測，使用安全，操作簡單。在此基礎(chǔ)上完成 了本發(fā)明。
[0076]aLHCD方法解決了目前的blotting方法，PCR方法和microarray方法對miRNA檢 測的困難，提供了一個(gè)可多樣化使用的方法，即aLHCD可以根據(jù)用戶需要變成blotting方 法，PCR方法和macroarray方法，這為miRNA的檢測提供了一個(gè)高潛能的方法。而且本發(fā) 明的aLHCD方法所用的試劑均為商品化中的大眾試劑，使用方便安全，實(shí)驗(yàn)操作簡單，很容 易推廣使用。
[0077] 術(shù)語
[0078] aLHCD或LH-CD指liquid hybridization and color development with signal amplification,即液相雜交信號放大顯色。
[0079]ABC指親和素-生物素復(fù)合物（avidin-biotincomplex)。
[0080] IHC指免疫組化（immunohistochemistry)。
[0081]AP指喊性憐酸酶（alkalinephosphatase)。
[0082]BCIP/NBT指 5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸 / 硝基四氮唑藍(lán)（5-brom〇-4-chlor〇-3-indolyl-phosphate/nitrobluetetrazolium)〇
[0083]TBS指Tris緩沖液（tris-bufferedsaline)。
[0084] 如本文所用，術(shù)語"本發(fā)明探針"、"雙發(fā)夾核酸雜交探針"或"具有雙發(fā)夾結(jié)構(gòu)的核 酸雜交探針"可互換使用，指具有以下結(jié)構(gòu)（區(qū)）的雙發(fā)夾核酸探針：
[0085] (i)位于5'端的第一發(fā)夾結(jié)構(gòu)區(qū)；
[0086] (ii)位于3'端的第二發(fā)夾結(jié)構(gòu)區(qū)；以及
[0087] (iii)位于所述第一發(fā)夾結(jié)構(gòu)區(qū)和第二發(fā)夾結(jié)構(gòu)區(qū)之間的、與待檢測的miRNA互 補(bǔ)的互補(bǔ)結(jié)合區(qū)。
[0088] 如本文所用，術(shù)語"本發(fā)明方法"指aLHCD法或其變化形式 LH-PCR，LH_macroarray〇
[0089] 檢測方法
[0090] 本發(fā)明提供了一種可用于檢測微小RNA(miRNA)的新方法（aLHCD)。
[0091] 本發(fā)明檢測方法是采用創(chuàng)新設(shè)計(jì)的雙發(fā)夾DNA探針與提取的RNA進(jìn)行液相雜交， 然后用BAMHI和EX0I兩步酶切后，用引物進(jìn)行橋接PCR擴(kuò)增，再進(jìn)行親和素生物素復(fù)合物 (ABC)信號放大，最后通過標(biāo)記酶顯色進(jìn)行顯色判讀。從而形成了一個(gè)高特異，高靈敏，多通 量和便利化的新型miRNA檢測系統(tǒng)。
[0092] 參見圖1。在本發(fā)明中，一個(gè)典型的miRNA檢測方法包括如下基本步驟：
[0093] (1)設(shè)計(jì)特殊的雜交探針。
[0094] (2)將設(shè)計(jì)的特殊探針與待檢測樣品進(jìn)行液相雜交。
[0095] (3)雜交后的混合液采用特定的酶進(jìn)行第一次酶切。
[0096] (4)酶切后的雜交液采用另一種酶進(jìn)行第二次酶切。
[0097](5)酶切后的混合液采用PCR擴(kuò)增進(jìn)行信號放大。
[0098](6) PCR反應(yīng)液采用另一種酶進(jìn)行第三次酶切。
[0099] (7)第三次酶切的混合液采用親和素生物素復(fù)合物系統(tǒng)（ABC)進(jìn)行進(jìn)一步信號放 大。
[0100] (8)最后通過標(biāo)記酶顯色再次進(jìn)行信號放大及判讀。
[0101] 如果aLHCD用作PCR方法，則步驟（6)為用DNA凝膠成像系統(tǒng)檢測。
[0102] 在本發(fā)明中，核酸雜交探針具有雙發(fā)夾結(jié)構(gòu)（通常位于兩端）。
[0103] 在本發(fā)明中，用于第一步酶切的限制性內(nèi)切酶沒有特別限制，代表性的例子包括： 例如BamHI或其他限制性內(nèi)切酶。
[0104] 在本發(fā)明中，用于第二步酶切的單鏈外切酶沒有特別限制，代表性的例子包括：例 如EX0I等能消化DNA單鏈的酶。
[0105] 較佳地，PCR擴(kuò)增時(shí)，至少包括一對PCR擴(kuò)增標(biāo)記引物和一對搭橋引物。
[0106] 在本發(fā)明中，用于第三步酶切的單鏈外切酶沒有特別限制，代表性的例子包括：例 如EX0I等能消化DNA單鏈的酶。
[0107] 在本發(fā)明中，可以用常規(guī)方法對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測，例如通過印跡法方法，PCR方 法和macroarray方法。
[0108] -種優(yōu)選的檢測方法是，對第三步酶切后的混合液進(jìn)行生物素親合素復(fù)合物系統(tǒng) (ABC)或其它系統(tǒng)進(jìn)行信號放大，從而進(jìn)行檢測。例如，對上述混合液再進(jìn)行標(biāo)記酶顯色進(jìn) 行信號放大和判讀。
[0109] 在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)例中，使用雙發(fā)夾DNA探針與提取的RNA進(jìn)行液相雜交， 然后用BAMHI和EX0I兩步酶切后，用引物進(jìn)行橋接PCR擴(kuò)增，再進(jìn)行親和素生物素復(fù)合 物（ABC)信號放大，最后通過標(biāo)記酶顯色進(jìn)行顯色判讀，例如，通過AP(堿性磷酸酶）或 HRP(辣根過氧化物酶）顯色。
[0110] 基本原理
[0111] 本發(fā)明的基本原理說明如下：
[0112] (1)探針兩端的雙發(fā)夾結(jié)構(gòu)提供雜交時(shí)的空間阻礙，防止miRNA前體與之雜交，同 時(shí)這個(gè)設(shè)計(jì)還有利于防止其它核酸分子的非特異雜交，再是為后續(xù)步驟的PCR放大信號提 供接頭。
[0113] 例如，探針的5'發(fā)夾所加序列為：

【權(quán)利要求】
1. 一種miRNA檢測方法，其特征在于，包括步驟： (a) 將含miRNA的樣品與核酸雜交探針進(jìn)行液相雜交，從而形成含"miRNA-雜交探針" 的第一復(fù)合物的液相混合物，其中所述的核酸雜交探針為雙發(fā)夾核酸探針，并且所述的雙 發(fā)夾核酸探針具有： (i) 位于5'端的第一發(fā)夾結(jié)構(gòu)區(qū)； (ii) 位于3'端的第二發(fā)夾結(jié)構(gòu)區(qū)；以及 (iii) 位于所述第一發(fā)夾結(jié)構(gòu)區(qū)和第二發(fā)夾結(jié)構(gòu)區(qū)之間的、與待檢測的miRNA互補(bǔ)的 互補(bǔ)結(jié)合區(qū)； (b) 對所述的"miRNA-雜交探針"第一復(fù)合物，用限制性內(nèi)切酶進(jìn)行消化，從而從所述 第一復(fù)合物中切除第一發(fā)夾結(jié)構(gòu)區(qū)或第二發(fā)夾結(jié)構(gòu)區(qū)，形成一端保留發(fā)夾結(jié)構(gòu)區(qū)的、經(jīng)酶 切的第二復(fù)合物，其中所述的限制性內(nèi)切酶僅切除第一發(fā)夾結(jié)構(gòu)區(qū)或第二發(fā)夾結(jié)構(gòu)區(qū)而不 切割第一復(fù)合物的其他區(qū)域； (c) 用單鏈外切酶對所述第二復(fù)合物進(jìn)行消化，從而切除所述第二復(fù)合物中在步驟 (b)中切除發(fā)夾結(jié)構(gòu)區(qū)所暴露出的核酸單鏈，形成第三復(fù)合物，并同時(shí)切除多余的未雜交探 針，其中所述第三復(fù)合物由經(jīng)雙重消化后的核酸探針和miRNA構(gòu)成； (d) 以所述的經(jīng)雙重消化的核酸探針為模板，用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從而獲得PCR擴(kuò)增 產(chǎn)物，其中所述擴(kuò)增產(chǎn)物含有對應(yīng)于所述待測miRNA序列的核酸序列區(qū)； (e) 檢測所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的存在與否和/或數(shù)量，從而得出待測miRNA的檢測結(jié)果。
2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟（d)中，所述的PCR擴(kuò)增為橋接PCR 擴(kuò)增。
3. 如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，在步驟（d)中，在所述的橋接PCR擴(kuò)增中同 時(shí)使用橋接引物對和通用引物對，其中，橋接引物對特異性結(jié)合于所述的經(jīng)雙重消化的核 酸探針，而所述通用引物對特異性結(jié)合于所述橋接引物對的外側(cè)。
4. 如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述的橋接引物對由第一橋接引物和第二 橋接引物構(gòu)成，其中第一橋接引物特異性結(jié)合于所述經(jīng)雙重消化的核酸探針中殘留的發(fā)夾 結(jié)構(gòu)區(qū)，而第二橋接引物特異性結(jié)合于所述經(jīng)雙重消化的核酸探針中互補(bǔ)結(jié)合區(qū)。
5. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟（d)中，通過親和素-生物素復(fù)合物 信號放大技術(shù)，檢測所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
6. 如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述的通用引物對的部分或全部引物帶有 生物素標(biāo)記； 或者所述的通用引物對的上游引物和/或下游引物帶有生物素標(biāo)記。 在步驟（d)中，通過親和素-生物素復(fù)合物信號放大技術(shù)，檢測所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
7. 如權(quán)利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于，在步驟（e)中，通過標(biāo)記酶顯色進(jìn) 行顯色判讀；或通過印跡法或macroarray方法進(jìn)行檢測。
8. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法具有選自下組的一個(gè)或多個(gè)特征： ?第一發(fā)夾結(jié)構(gòu)區(qū)具有雙鏈的第一莖部區(qū)和單鏈的第一莖環(huán)區(qū)（loop); ?第二發(fā)夾結(jié)構(gòu)區(qū)具有雙鏈的第二莖部區(qū)和單鏈的第二莖環(huán)區(qū)（loop); ?所述各莖部區(qū)的長度為6-12bp，較佳地7-10bp ; ?所述各莖環(huán)區(qū)的長度為4-12bp，較佳地4-10bp，更佳地4-8bp ; ?所述的互補(bǔ)結(jié)合區(qū)與所述第一發(fā)夾結(jié)構(gòu)區(qū)和/或第二發(fā)夾結(jié)構(gòu)區(qū)之間存在〇-3bp的 間隔區(qū)；較佳地，間隔區(qū)的長度為l_2bp ; ?所述互補(bǔ)結(jié)合區(qū)的長度與待檢測的miRNA的長度一致，為18-30bp。
9. 一種用于檢測miRNA的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒含有： (a) 用于與miRNA進(jìn)行雜交的核酸雜交探針，其中所述的核酸雜交探針為雙發(fā)夾核酸 探針，并且所述的雙發(fā)夾核酸探針具有： (i) 位于5'端的第一發(fā)夾結(jié)構(gòu)區(qū)； (ii) 位于3'端的第二發(fā)夾結(jié)構(gòu)區(qū)；以及 (iii) 位于所述第一發(fā)夾結(jié)構(gòu)區(qū)和第二發(fā)夾結(jié)構(gòu)區(qū)之間的、與待檢測的miRNA互補(bǔ)的 互補(bǔ)結(jié)合區(qū)； (b) 使用說明書； 較佳地，所述的核酸雜交探針具有選自下組的一個(gè)或多個(gè)特征： ?第一發(fā)夾結(jié)構(gòu)區(qū)具有雙鏈的第一莖部區(qū)和單鏈的第一莖環(huán)區(qū)（loop); ?第二發(fā)夾結(jié)構(gòu)區(qū)具有雙鏈的第二莖部區(qū)和單鏈的第二莖環(huán)區(qū)（loop); ?所述各莖部區(qū)的長度為6-12bp，較佳地7-10bp ; ?所述各莖環(huán)區(qū)的長度為4-12bp，較佳地4-10bp，更佳地4-8bp ; ?所述互補(bǔ)結(jié)合區(qū)的長度與待檢測的miRNA的長度一致，為18-30bp。
10. -種用于與miRNA進(jìn)行雜交的核酸雜交探針或所述探針的組合，其特征在于，所述 的核酸雜交探針為雙發(fā)夾核酸探針，并且所述的雙發(fā)夾核酸探針具有： (i) 位于5'端的第一發(fā)夾結(jié)構(gòu)區(qū)； (ii) 位于3'端的第二發(fā)夾結(jié)構(gòu)區(qū)；以及 (iii) 位于所述第一發(fā)夾結(jié)構(gòu)區(qū)和第二發(fā)夾結(jié)構(gòu)區(qū)之間的、與待檢測的miRNA互補(bǔ)的 互補(bǔ)結(jié)合區(qū)； 其中，所述組合包括二種或多種針對不同miRNA的所述的核酸雜交探針。
【文檔編號】C12Q1/68GK104342486SQ201310326679
【公開日】2015年2月11日 申請日期:2013年7月30日 優(yōu)先權(quán)日:2013年7月30日
【發(fā)明者】張永蓮, 李湘麒, 倪敏捷, 張朝寶, 馬武斌 申請人:中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院