水稻轉錄因子Os09g11480.2基因CDS序列的應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及水稻轉錄因子Os09g11480.2基因CDS序列的應用，其是利用轉錄因子激活基序VP64與水稻轉錄因子Os09g11480.2融合構建得到組成型轉錄因子，并將編碼所述組成型轉錄因子的基因轉化到農作物如水稻中，從而改良水稻籽粒性狀，例如增加水稻籽粒長度和寬度。對于詳細闡明調控種子發(fā)育機理具有重要的理論價值，并且可以通過轉基因手段，改良水稻的粒型，因此在生產實踐中也具有重要意義。
【專利說明】水稻轉錄因子0s09g11480. 2基因CDS序列的應用

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程領域，具體地說，涉及水稻轉錄因子0s09gll480. 2基因⑶S 序列的應用。

【背景技術】
[0002] 水稻（OryzasativaL.)是我國和全世界最重要的三大糧食作物之一，是世界一 半以上人口的主食，也是一個重要的功能基因研究的模式植物。與其相關的遺傳學和分子 生物學研究一直倍受研究者的重視，轉錄水平的調控是基因表達調控的重要方式。當前水 稻增產的研究較依賴于有限的水稻種質資源，傳統(tǒng)的雜交育種優(yōu)勢正在逐漸減弱，而水稻 轉基因技術有可能發(fā)掘水稻進一步增產的潛力。
[0003] 在植物界中，能形成種子的植物約占植物總數(shù)的三分之二以上，作為重要的繁殖 器官，種子同時也為人們提供食物來源，水稻就是其中的重要代表，種子來源于受精后的胚 珠。從分子生物學的角度來說，種子的發(fā)育和萌發(fā)是一個有次序的、選擇性的基因表達過 程。而轉錄因子在基因表達的精確調控中起到了關鍵性的作用。
[0004] 禾谷類作物的產量很大程度上取決于其籽粒的大小，因此水稻籽粒性狀的基因調 控是重要的研究領域。近年來，已經通過基因克隆、QTL等技術手段揭示了至少8個基因在 控制粒型方面具有重要作用。SGl基因編碼一個功能未知的蛋白，主要在水稻根和發(fā)育的穗 中表達，該蛋白的過量表達出現(xiàn)短粒和矮化表型。SGl降低了對油菜素內酯BR的應答，通過 減少細胞增殖從而降低諸如種子、穗軸節(jié)間等器官的伸長。SGLl是一個類SGl蛋白，具有與 SGl類似的功能，通過RNAi下調SGl及其同源基因SGLl的表達，水稻粒長和穗軸的節(jié)間較 野生型變長（Nakagawa等，2012)。GS3位點是控制水稻粒重和粒長的主效QTL，同時也是控 制水稻粒寬和籽粒充實度的微效QTL(Fan,Xing等，2006;Mao,Sun等，2010)。PGLl是一個 非典型的不結合DNA的堿性螺旋-環(huán)-螺旋蛋白（bHLH)，過量表達PGLl增加了籽粒長度和 重量。APG是PGLl的拮抗性互作因子，兩者都定位在核內。PGL1/APG介導的籽粒長度增加 是由于內穎細胞長度增加引起的。APG和PGLl不影響已知籽粒長度調控基因GS3和SRS3 的表達。PGLl-APG代表了一個新的籽粒長度和重量調控途徑，APG是一個負向調節(jié)子，其功 能受到PGLl的抑制（Heang等，2012)。Mi3(t)基因，來源于秈型水稻Y34,該基因能使粒長 縮短35. 7%?47. 4%，千粒重降低45. 9%?62. 4%，它主要控制籽粒長度，產生小粒（劉明偉 等，2005)。此外，控制水稻籽粒性狀的基因還有gGL7和gGL7-2。總之，控制水稻籽粒發(fā)育 是一個復雜過程，涉及到多基因多條途徑的協(xié)調控制，目前發(fā)現(xiàn)調控該性狀的基因不多，調 控籽粒發(fā)育的分子機理尚未闡明，因此，尋找控制籽粒性狀發(fā)育的基因和新的發(fā)掘手段對 作物改良并提高作物產量具有重要意義。
[0005] AP2/EREBP轉錄因子在花發(fā)育和逆境脅迫應答過程中起重要作用。根據(jù)該家族基 因所含的AP2/EREBP結構域的數(shù)目不同可將其分為兩類，AP2和EREBP亞家族。AP2亞家族 含有兩個正向重復的AP2結構域，EREBP亞家族含有單個AP2結構域。AP2亞類基因在花器 官中表達，參花分生特性建立、花器官特性特化、花同源異型基因活性時空調節(jié)等花發(fā)育 過程。EREBP亞類基因成員參與調節(jié)植物對生物和非生物因素的脅迫應答過程。許多外界 條件，如乙烯、鹽、傷害、低溫、干旱等條件能誘導EREBP亞類家族基因的產生，使植物抗性， 耐性提高。目前水稻中該家族基因只有屬于EREBP亞類的OsEBP-89的報道。除了OsEBP-89 之外，水稻中還存在相當數(shù)量的該家族基因。


【發(fā)明內容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供水稻轉錄因子0s09gll480. 2基因⑶S序列的應用。
[0007] 為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明首先提供一種組成型水稻轉錄因子，即融合蛋白 (VP16)4-Linker-0s09gll480. 2。
[0008] 其中，VP16為來自單純皰疹病毒的VP16蛋白，將4個VP16功能域基序融合在一起 可構成一類增強子，增強轉錄因子的功能，從而在轉基因植株中出現(xiàn)更明顯的表型變化。上 述融合蛋白中涉及的（VP16)4，即VP64是由4個VP16蛋白的氨基酸序列以Gly-Ser為間隔 形成的融合蛋白，其氨基酸序列和核苷酸序列分別如SEQIDNo. 10和SEQIDNo. 4所示。
[0009] 上述融合蛋白中涉及的Linker由39個柔性氨基酸串聯(lián)而成，其氨基酸序列如SEQ IDNo. 9所示，編碼該Linker的核苷酸序列如SEQIDNo. 3所示。
[0010] 上述融合蛋白中涉及的0s09gll480. 2為水稻轉錄因子0s09gll480. 2,其氨基酸 序列如SEQIDNo. 2所示，或該序列經替換、缺失或添加一個或幾個氨基酸形成的具有同等 功能的氣基酸序列；水稻轉錄因子0s09gl1480. 2基因的CDS序列為：SEQIDNo. 1所不的 核苷酸序列。
[0011] 本發(fā)明還提供編碼所述組成型水稻轉錄因子的基因，以及在嚴格條件下，可與該 基因的核苷酸序列發(fā)生雜交的核苷酸序列。
[0012] 本發(fā)明還提供含有編碼所述組成型水稻轉錄因子的基因的載體、工程菌及細胞 系。
[0013] 所述載體的構建方法如下：
[0014] (1)在植物轉錄因子數(shù)據(jù)庫（http://rice,plantbiology.msu.edu/analyses_ search_locus.shtml)中找到0s09gl1480. 2基因，根據(jù)其序列設計PCR擴增引物對，其為正 向引物F:5' -CAAAAAAGCAGGCTTCATGTGTGGAGGAGCACTG-3' 和反向引物R:5'-CAAGAAAGCTGGG TCTCATTTGACGAAAAATTGGAG-3' 。
[0015] (2)以野生日本晴'kitaake'水稻總cDNA為模板，利用上述引物F和R進行PCR， 獲得0s09gl1480. 2基因完整的CDS序列。
[0016] (3)將上述PCR產物克隆到pDONER克隆載體上，經測序鑒定得到與目的基因完全 相同的序列。
[0017] (4)以植物雙元表達載體pCambial301_UbiN(圖7)左右邊界包含的序列為骨架 序列，通過體外重組，將ubipromoter-VP64-Gateway表達單兀、35Spromoter-asRED表達 單元和35Spromoter-hyg表達單元與之融合構建，得到載體nVP64-hyg-asRED的全序列如 SEQIDNo. 5 所示。
[0018] (5)通過LR反應將0s09gll480.2基因的⑶S序列構建到其目的基因的5'端連 有VP64編碼基因的植物表達載體nVP64-hyg-asRED上，獲得攜帶有編碼所述組成型水稻轉 錄因子VP64-Linker-0s09gll480. 2 基因的表達載體ubi:VP64-0s09gll480. 2,其全序列如 SEQIDNo. 6 所示。
[0019] 上述表達載體可通過使用Ti質粒、植物病毒載體、直接DNA轉化、微注射、電穿 孔等常規(guī)生物技術方法導入植物細胞中（Weissbach，1998,MethodforPlantMolecular BiologyVIII，AcademyPress，NewYork，第 411-463 頁；Geiserson和Corey，1998,Plant MolecularBiology,2ndEdition)。
[0020] 本發(fā)明還提供一種轉基因水稻植株的構建方法，具體為：采用農桿菌介導的方法， 將上述表達載體轉入水稻愈傷組織中，用含誘導劑和農桿菌的AAM培養(yǎng)液進行轉化，轉化 后的材料經過共培養(yǎng)-篩選-分化-生根-轉基因苗的鍛煉和移栽，篩選轉基因水稻植株。
[0021] 本發(fā)明還提供編碼所述組成型水稻轉錄因子的基因在改良水稻籽粒性狀(例如增 加水稻粒長、粒寬及千粒重）中的應用。
[0022] 本發(fā)明還提供了用于擴增水稻轉錄因子0s09gll480.2基因⑶S序列的引物對，包 括正向引物F: 5' -CAAAAAAGCAGGCTTCATGTGTGGAGGAGCACTG-3' 和反向引物R: 5'-CAAGAAAGC TGGGTCTCATTTGACGAAAAATTGGAG-3' 。
[0023] 本發(fā)明進一步提供水稻轉錄因子0s09gl1480. 2基因⑶S序列在調控水稻籽粒性 狀中的應用。利用轉錄因子激活基序VP64(SEQIDNo. 10)與水稻轉錄因子0s09gll480. 2 融合構建得到組成型轉錄因子，并將編碼所述組成型轉錄因子的基因轉化到農作物如水稻 中，從而改良轉基因水稻籽粒的性狀。
[0024] 前述的應用，是將水稻轉錄因子0s09gl1480. 2基因的⑶S序列構建到轉錄因子激 活基序VP64編碼基因（SEQIDNo. 4)的下游，轉化水稻，從而改良轉基因水稻籽粒的性狀。 優(yōu)選將水稻轉錄因子0s09gll480. 2基因的⑶S序列通過Gateway系統(tǒng)轉錄因子激活基序 VP64編碼基因的下游。
[0025] 本發(fā)明首次利用轉錄因子激活基序VP64 (即4個轉錄因子激活基序VP16)與水稻 轉錄因子0s09gll480. 2融合構建得到組成型轉錄因子，并將編碼所述組成型轉錄因子的 基因轉化到農作物如水稻中，從而改良水稻籽粒性狀，例如水稻籽粒長度、寬度增加。對于 詳細闡明調控種子發(fā)育機理具有重要的理論價值，并且可以通過轉基因手段，改良水稻的 粒型，因此在生產實踐中也具有重要意義。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0026] 圖1為本發(fā)明實施例1中nVP64-hyg_asRED載體圖譜。
[0027] 圖2為本發(fā)明實施例1中ubi:VP64-0s09gll480· 2載體圖譜。
[0028] 圖3為本發(fā)明實施例3中PCR檢測VP64-0s09gll480. 2轉基因陽性株系，其中WT 為野生型水稻 'kitaake'，NV1834H-14、NV1834H-18 為VP64-0s09gll480. 2 轉基因水稻株 系。
[0029] 圖4為本發(fā)明實施例4中轉基因水稻籽粒性狀的表型長度的比較；其中WT為野生 型水稻 'kitaake'，NV1834H-14、NV1834H-18 為VP64-0s09gll480. 2 轉基因水稻株系。
[0030] 圖5為本發(fā)明實施例4中轉基因水稻籽粒性狀的表型寬度的比較；其中WT為野生 型水稻 'kitaake'，NV1834H-14、NV1834H-18 為VP64-0s09gll480. 2 轉基因水稻株系。
[0031] 圖6為本發(fā)明實施例4中轉基因水稻籽粒性狀的數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析結果；其中WT為野 生型水稻 'kitaake'，NV1834H-14、NV1834H-18 為VP64-0s09gll480. 2 轉基因水稻株系。
[0032] 圖7為本發(fā)明實施例1中pCambial301_UbiN載體圖譜。

【具體實施方式】
[0033] 以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實施例 中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規(guī)手段，所用原料均為市售商品。
[0034] 實施例1
[0035] 0s09gl1480. 2基因⑶S序列的獲得及植物表達載體的構建
[0036] I. 0s09gll480. 2基因CDS序列的獲得
[0037] 在植物轉錄因子數(shù)據(jù)庫（http://rice. plantbiology. msu. edu/analyses_ search_locus. shtml)中找到0s09gll480. 2基因，其核苷酸序列如SEQ ID No. 11所不， 根據(jù)其序列設計PCR擴增引物，正向引物F:5' -CAAAAAAGCAGGCTTCATGTGTGGAGGAGCACT G-3'和反向引物R :5' -CAAGAAAGCTGGGTCTCATTTGACGAAAAATTGGAG-3'）。以野生型日本晴 'kitaake'水稻總cDNA為模板，利用引物F和R進行PCR，獲得0s09gll480. 2基因完整的 CDS序列（如SEQ ID No. 1所示)。
[0038] 2.植物表達載體的構建
[0039] 將水稻轉錄因子0s09gll480. 2基因的CDS序列通過Gateway系統(tǒng)構建到4個轉 錄因子激活基序VP16編碼基因（如SEQIDNo. 4所示）的下游。
[0040] 2. 1將上述PCR產物克隆到pDONER克隆載體上
[0041] 按照PrimeSTAR聚合酶擴增體系和反應程序進行PCR。此過程中包含兩輪 PCR，第一輪PCR的引物用加部分adaptor attB接頭的基因引物（F和R)，而第二輪的 模板用第一輪的PCR產物，并且引物用完整的adaptor attB引物（attB 5' adaptor: 5'-GTGGGGACAAGTTTG TACAAAAAAGCAGGCTTC-3'，attB 3' adaptor:5'-GTGGGGACCAC TTTGTACAAGAAAGCTGGGTC-3'）。將PCR產物克隆到pDONER克隆載體(購自Invitrogen)上， 經測序鑒定得到與目的基因完全相同的序列。
[0042] 2. 2植物表達載體的構建
[0043] 以植物雙元表達載體pCambial301_UbiN(圖7)左右邊界包含的序列為骨架序列， 通過體外重組，將ubipromoter-VP64-Gateway表達單兀、35Spromoter-asRED表達單兀和 35Spromoter-hyg表達單元與之融合構建，得到載體nVP64_hyg_asRED的全序列如SEQID No. 5所示，載體圖譜見圖1。
[0044] 表達載體nVP64-hyg_asRED含有Gateway重組系統(tǒng)，pDONR帶有目的基因的質粒 作為入門載體（Enteryvector),通過LR反應可完成目的基因表達載體的構建。
[0045] 通過LR反應將0s09gl1480. 2基因的CDS序列構建到其目的基因的5'端連有VP64 編碼基因的植物表達載體nVP64-hyg-asRED上，獲得攜帶有編碼所述組成型水稻轉錄因子 VP64-Linker-0s09gll480. 2 基因的表達載體ubi:VP64-0s09gll480. 2,其全序列如SEQID No. 6所示，載體圖譜見圖2。
[0046] LR反應體系如下：
[0047] 表達載體 1 μ? ( 30-50ng ) .入門載體（pDONR-gene) Ιμ? (30-50ng)
[0048] LR Cionase EnzymeMixΙμ? CidH2O 2μ1 總體積 5μ1
[0049] 于25°C反應過夜。用反應體系轉化大腸桿菌DH5a，篩選陽性克隆。
[0050] 實施例2轉基因水稻植株的獲得
[0051] 取水稻'kitaake'成熟種子，人工或機械脫殼，挑選飽滿光潔無菌斑的種子經消毒 之后接種到誘導培養(yǎng)基上進行誘導培養(yǎng)。選擇外觀良好，生長力好的水稻愈傷組織為受體 材料，采用農桿菌介導法將ubi:VP64-0s09gll480. 2轉入水稻愈傷組織中，用含有100μM 的乙酰丁香酮和OD值為0. 7的農桿菌的AAM培養(yǎng)液進行轉化，將轉化液浸泡過的愈傷組織 置于共培養(yǎng)基上進行共培養(yǎng)，25°C暗培養(yǎng)3d后置于篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)約30d，每IOd繼代一 次。然后將篩出的抗性愈傷轉移到分化培養(yǎng)基上分化約20d，每IOd繼代一次。將分化出綠 色小苗的抗性愈傷轉移到生根培養(yǎng)基上生根，待約7d長出發(fā)達根系后煉苗，并計算轉化所 獲轉基因苗數(shù)。煉苗7d后轉移至大田生長。獲得45株轉基因苗。
[0052] 本實施例中涉及的培養(yǎng)基配方如下：
[0053] 誘導培養(yǎng)基：N6大量+B5微量+NB有機+鐵鹽+銅鈷母液+2. 5mg/L2, 4D+0. 6g/L 酸水解酪蛋白+2. 878g/L脯氨酸+0. 5g/L谷氨酰胺+30g/L鹿糖，以水配制，調pH至5. 8? 5. 9后加入植物凝膠4g/L。
[0054] 共培養(yǎng)基：N6大量+B5微量+NB有機+鐵鹽+2. 5mg/L2, 4D+0. 5g/L谷氨酰胺 +0. 6g/L酸水解酪蛋白+10g/L葡萄糖+30g/L鹿糖，以水配制，調pH至5. 2后加入植物凝膠 4g/L。滅菌后，50°C左右加入AS(乙酰丁香酮）100?200μg/mL。
[0055] 篩選培養(yǎng)基：N6大量+B5微量+NB有機+鐵鹽+銅鈷母液+2. 5mg/L2, 4D+0. 6g/L 酸水解酪蛋白+2. 878g/L脯氨酸+0. 5g/L谷氨酰胺+30g/L鹿糖，以水配制，調pH至5. 8? 5. 9后加入植物凝膠4g/L。滅菌后加入35mg/L潮霉素(購自上海紐津生物技術有限公司）。
[0056] 分化培養(yǎng)基：MS無機+MS-B5微量+MS有機+鐵鹽+MS-銅鈷母液+0. 05mg/L NAA+2.Omg/LKinetin(激動素）+30g/L山梨醇+2g/L水解酪蛋白+30g/L鹿糖，以水配制， 調pH至5. 8?5. 9后加入植物凝膠4g/L。
[0057] 實施例3轉基因陽性株系的鑒定
[0058] 為檢測實施例2獲得的VP64-0s09gll480. 2轉基因水稻株系中ubi: VP64-0s09gll480. 2基因在T2代轉基因水稻（NV1834H-14、NV1834H-18)中的過表達情況， 本實施例在載體與目的基因接頭處設計引物（正向引物：5'-GTGGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGC AGGCTTC-3' 和反向引物：5'-GTGGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTC-3'）進行PCR檢測，得到 了明顯的特異性條帶。
[0059] 由圖3可見，擴增出的條帶大小在750bp以上，且引物是在載體與目的基因接頭處 設計的，擴增出的片段大小與目的基因（768bp)基本一致。因此可以說明，實施例2獲得的 轉基因水稻株系NV1834H-14、NV1834H-18中含有VP64-0s09gll480. 2融合基因。
[0060] 實施例4轉基因水稻表型分析和考種分析
[0061] 將實施例2獲得的轉基因水稻株系NV1834H-14、NV1834H-18和野生型水稻種子進 行比較，從表型上可以明顯的看出，發(fā)現(xiàn)轉基因材料的籽粒明顯變長、變寬（圖4、圖5)?？?種數(shù)據(jù)分析表明（圖6)，本發(fā)明獲得的VP64-0s09gll480. 2轉基因水稻籽粒的長、寬均顯著 大于野生型水稻籽粒。
[0062] 雖然，上文中已經用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在 本發(fā)明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因 此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。
【權利要求】
1. 一種組成型水稻轉錄因子，其特征在于，其為融合蛋白（VP16)4-Linker-0s09gll480. 2 ； 其中，VP16為來自單純皰疹病毒的VP16蛋白，（VP16)4是由4個VP16蛋白的氨基酸 序列以Gly-Ser為間隔形成的融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No. 10所示；Linker由39 個柔性氨基酸串聯(lián)而成，其氨基酸序列如SEQ ID No. 9所示；0s09gll480. 2為水稻轉錄因 子0s09gll480. 2,其氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示，或該序列經替換、缺失或添加一個或 幾個氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
2. 編碼權利要求1所述組成型水稻轉錄因子的基因。
3. 含有權利要求2所述基因的載體。
4. 含有權利要求2所述基因的工程菌。
5. -種轉基因水稻植株的構建方法，其特征在于，采用農桿菌介導的方法，將權利要求 3所述的載體轉入水稻愈傷組織中，用含誘導劑和農桿菌的AAM培養(yǎng)液進行轉化，轉化后的 材料經過共培養(yǎng)-篩選-分化-生根-轉基因苗的鍛煉和移栽，篩選轉基因水稻植株。
6. 權利要求2所述的基因在改良水稻籽粒性狀中的應用。
7. 用于擴增水稻轉錄因子0s09gl 1480. 2基因⑶S序列的引物對，其特征在于， 包括正向引物 F:5'-CAAAAAAGCAGGCTTCATGTG TGGAGGAGCACTG-3' 和反向引物 R : 5'-CAAGAAAGCTGGGTCT CATTTGACGAAAAATTGGAG-3' ； 其中，水稻轉錄因子0s09gll480. 2基因的⑶S序列為： SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列。
8. 水稻轉錄因子0s09gl 1480. 2基因⑶S序列在調控水稻籽粒性狀中的應用。
9. 根據(jù)權利要求8所述的應用，其特征在于，其是利用轉錄因子激活基序VP64與水稻 轉錄因子0s09gll480. 2融合構建得到組成型轉錄因子，并將編碼所述組成型轉錄因子的 基因轉化水稻，從而改良轉基因水稻籽粒的性狀； 其中，所述轉錄因子激活基序VP64的氨基酸序列如SEQ IDNo. 10所示。
10. 根據(jù)權利要求8所述的應用，其特征在于，其是將水稻轉錄因子0s09gl 1480. 2基因 的⑶S序列通過Gateway系統(tǒng)構建到轉錄因子激活基序VP64編碼基因的下游，轉化水稻， 從而改良轉基因水稻籽粒的性狀； 其中，所述轉錄因子激活基序VP64編碼基因的核苷酸序列如SEQID No. 4所示。
【文檔編號】C12N1/21GK104341521SQ201310334671
【公開日】2015年2月11日 申請日期:2013年8月2日 優(yōu)先權日:2013年8月2日
【發(fā)明者】李宏宇, 張永興, 趙濤, 劉軍, 劉斌, 林辰濤 申請人:中國農業(yè)科學院作物科學研究所