一種用于檢測t(8;21)AML中目的基因拷貝數(shù)改變的探針試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種用于檢測t(8;21)AML中目的基因拷貝數(shù)改變的探針試劑盒，該探針試劑盒包括即用型雜交液，該即用型雜交液的組分及濃度為：AML1基因探針、ETO基因探針、WT1基因探針、P27基因探針和C-kit基因探針的濃度均為4ng/μl。本發(fā)明試劑盒的組合探針信號強度高，穩(wěn)定性強，可以在單細胞水平同時檢測定性定量檢測5個目的基因的改變情況。
【專利說明】—種用于檢測t (8; 21) AML中目的基因拷貝數(shù)改變的探針試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種檢測試劑盒，特別涉及一種應(yīng)用高分辨定量多色熒光原位雜交，檢測t(8;21)AML中目的基因拷貝數(shù)改變的探針試劑盒，尤其是用于檢測亞克隆間的進化關(guān)系及在化療藥物的作用下優(yōu)勢克隆的演變及亞克隆的消長。本發(fā)明提供的組合探針信號強度高，穩(wěn)定性強，在 Chroma 公司的 DAPI (SP-100), Spectrum Green?(MF101), Cy3?vl (SP-102), Texas Red(SP_107)和 Zeiss 公司的 Cy5 (50)，PF_415 (45)六種濾光片通道下無信號交叉，可以在單細胞水平同時定性定量檢測5個目的基因的改變情況?？梢杂糜跈z測目的基因拷貝數(shù)的改變、腫瘤異質(zhì)性及亞克隆演變，檢測腫瘤細胞基因組的不穩(wěn)定性和復(fù)雜程度。為臨床制定特異性的靶向治療方案具有重要的指導(dǎo)意義。
【背景技術(shù)】
[0002]急性髓系白血病是一種克隆性異質(zhì)性疾病，它的發(fā)生是一個多步驟的發(fā)病過程，累積多個基因，涉及多種遺傳學(xué)異常。正常造血干祖細胞在致癌物質(zhì)的作用下獲得選擇性的增殖優(yōu)勢，轉(zhuǎn)化為前癌細胞。前癌細胞基因組不穩(wěn)定，在增殖過程中不斷獲得遺傳學(xué)損傷形成不同的變異體。在生存空間有限、營養(yǎng)物質(zhì)缺乏、缺氧及最重要的在免疫殺傷的作用下，并非所有的亞克隆均能存活，直至出現(xiàn)的變異體能夠突破上述進化屏障，這一變異體即為白血病起始細胞。白血病起始細胞克隆性增殖最終導(dǎo)致臨床發(fā)病。雖然白血病細胞群全都來自白血病起始細胞，但是從生物學(xué)發(fā)病到臨床發(fā)病的過程中，白血病起始細胞克隆性增殖的同時不斷累積新的遺傳學(xué)損傷形成一個異質(zhì)性群體，亞克隆間的生長速度、侵襲能力及對藥物的敏感性不同。其 中比例最高的亞群稱為優(yōu)勢亞克隆，優(yōu)勢亞克隆的生物學(xué)特性和白血病的臨床表現(xiàn)相關(guān)。同一腫瘤患者體內(nèi)可以存在有很多不同亞克隆細胞群，同一類腫瘤可以有不同的亞型，同一亞型的患者預(yù)后不同。單就急性白血病而言，其異質(zhì)性存在的證據(jù)表現(xiàn)為:細胞形態(tài)學(xué)和免疫表型的多樣性，細胞遺傳學(xué)和分子生物學(xué)的異常。正是由于異質(zhì)性的存在，使得腫瘤在治療過程中逐漸表現(xiàn)出耐藥、復(fù)發(fā)和侵襲力改變等行為。因此，在臨床上研究腫瘤的異質(zhì)性及亞克隆分群對腫瘤的靶向治療具有重要意義。
[0003]目前，常用的檢測異質(zhì)性的方法具有兩大類:一類是臨床上治療相關(guān)的檢測指標(biāo):染色體核型分析、免疫表型、分子生物學(xué)檢測等；另一類是近幾年新近崛起的測序技術(shù)。但是目前應(yīng)用的臨床指標(biāo)，在檢測腫瘤細胞異質(zhì)性上分辨率太低。以染色體核型分析為例:雖然可檢測單細胞水平上多種基因組異常并列存在的情況，但分辨率太低(大約10Mb)，只能檢測大片段的缺失、擴增、異位等，而且染色體核型分析只能檢測處于有絲分裂中期的細胞，計數(shù)的細胞少，只能反映增殖活躍細胞的遺傳學(xué)改變；而測序技術(shù)雖然分辨率非常高，能獲得海量的基因組異常信息也能觀察到優(yōu)勢突變的演變，但是也只能從整體水平上反應(yīng)異質(zhì)性的存在及演變，不能分析多種基因異常在同一細胞水平同時存在的情況。
[0004]本發(fā)明檢測t(8;21)AML中目的基因拷貝數(shù)改變的探針試劑盒，應(yīng)用高分辨定量多色熒光原位雜交，克服了以上兩種方法的不足，兼顧了以上兩者的優(yōu)勢，不僅分辨率較高，可以檢測到隱匿性的基因異位、缺失和基因擴增，而且可在單細胞水平同時檢測多個基因的異變。從而直觀的分析腫瘤的異質(zhì)性，亞克隆間的進化關(guān)系及優(yōu)勢克隆的演變。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明檢測t(8;21)AML中目的基因拷貝數(shù)改變的探針試劑盒，可用于高分辨定量多色熒光原位雜交，檢測單細胞水平上多種基因異常并列出現(xiàn)的情況，從而將個體細胞進行不同的亞克隆分群，本方法適用于大規(guī)模的臨床研究并對靶向治療具有重要的指導(dǎo)意義。
[0006]本發(fā)明的一個目的是提供一種AML1基因探針，ΕΤ0基因探針，WT1基因探針，P27基因探針、C-kit基因探針的制備方法。
[0007]本發(fā)明的另一目的是提供一種包括AML1基因探針，ΕΤ0基因探針，WT1基因探針，P27基因探針和C-kit基因探針的即用型雜交液。
[0008]本發(fā)明的另一目的是提供一種包括上述即用型雜交液的試劑盒。
[0009]本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:
[0010]一種單個基因探針的制備方法，包括如下步驟:
[0011]1)、探針制作:在常用的數(shù)據(jù)庫如 NCBI Clone Registry、Ensembl GenomeBrowser 和 UCSC Genome Bioi nformatics 上定位檢索含檢測目的基因的 BAC (Bacterialartificial chromosomes)克隆，獲得目的基因的克隆后,大量提取質(zhì)粒DNA,再采用缺口平移的方法將熒光素染料標(biāo)記的dUTP或dCTP連接到酶切好的DNA上，沉淀DNA，用含有50%去離子甲酰胺的雜交緩沖液溶解探針；
[0012]2)、探針驗證:采用正常人二倍體成纖維細胞的細胞爬片進行探針驗證。
[0013]一種包括AML1基因探針，ΕΤ0基因探針，WT1基因探針，P27基因探針和C_kit基因探針的即用型雜交液的制備方法，包括如下步驟:
[0014]2)、探針制作:在常用的數(shù)據(jù)庫如 NCBI Clone Registry、Ensembl GenomeBrowser 和 UCSC Genome Bioinformatics 上定位檢索分別含檢測 AML1、ETO、WT1、P27、C-kit基因的BAC (Bacterial artificial chromosomes)克隆，獲得目的基因的克隆后，大量提取質(zhì)粒DNA，再采用缺口平移的方法將熒光素染料標(biāo)記的dUTP或dCTP連接到酶切好的DNA上，對標(biāo)記好的目的DNA進行組合沉淀，用含有50%去離子甲酰胺的雜交緩沖液溶解沉淀，制得即用型雜交液；
[0015]2)、探針驗證:采用正常人二倍體成纖維細胞的細胞爬片進行探針驗證。
[0016]作為一個優(yōu)選方案:含AML1基因最優(yōu)的克隆，編號為:RP11-77G18，RP11-697C13或RP11-177L11中的一種或兩種或三種；
[0017]作為一個優(yōu)選方案:含ΕΤ0基因最優(yōu)的克隆，編號為:RP11-11808或RP11-122C21中的一種或兩種；
[0018]作為一個優(yōu)選方案:含WT1基因最優(yōu)的克隆，編號為:RP11_258G7或RP11-955L20中的一種或兩種；
[0019]作為一個優(yōu)選方案:含p27基因最優(yōu)的克隆，編號為:RP11-380E18，RP11-70N14或RP11-377D9中的一種、兩種或三種；
[0020]作為一個優(yōu)選方案:含c-kit基因最優(yōu)的克隆，編號為:RP11_103A16或RP11-178P22中的一種或兩種；
[0021]上述最優(yōu)克隆均來源于UCSC Genome Bioinformatics數(shù)據(jù)庫。
[0022]具體地，所述的步驟1)為在常用的數(shù)據(jù)庫如NCBI Clone Registry、EnsemblGenome Browser 和 UCSC Genome Bioinformatics 上定位檢索分別含檢測 AML1、ETO、WT1、P27、C-kit 基因的 BAC (Bacterial artificial chromosomes)克隆，獲得目的基因的克隆后，大量提取質(zhì)粒DNA，再采用缺口平移的方法將熒光素染料標(biāo)記的dUTP或dCTP連接到酶切好的DNA上，用100%的乙醇將連接好的DNA在_20°C進行組合沉淀過夜，次日離心14000rpm，4°C，20分鐘，用槍尖小心吸棄上清，加入70%乙醇(4°C )，混勻，離心14000rpm,4°C，15分鐘，用槍尖小心吸棄上清，室溫避光干燥沉淀10分鐘，用含有50%去離子甲酰胺的雜交緩沖液溶解沉淀，制得即用型雜交液。
[0023]本發(fā)明還提供了一種檢測t(8;21)AML中目的基因拷貝數(shù)改變的探針試劑盒，包括上述即用型雜交液。
[0024]優(yōu)選地，所述即用型雜交液的組分及濃度為:AML1基因探針、ΕΤ0基因探針、WT1基因探針、P27基因探針和C-kit基因探針的濃度均為4ng/l.! 1。
[0025]進一步，該檢測試劑盒還包括:12*12mm蓋玻片，18*18mm蓋玻片，載玻片，DAPI復(fù)染劑和液體橡膠。
[0026]具體地，該試劑盒的應(yīng)用方法，包括如下步驟:
[0027]1)雜交:將要檢測的標(biāo)本處理好后，加入試劑盒中的即用型雜交液，加上蓋玻片，用液體橡膠封片，放入雜交儀，78-81°C變性5分鐘37°C雜交過夜；
[0028]2)洗片，熒光顯微鏡檢:標(biāo)本雜交過夜后，去除蓋玻片，放入核酸雜交的緩沖液(Saline Sodium Phosphate EDTA，SSPE)中洗滌兩次，梯度乙醇中脫水后晾干，用DAPI復(fù)染，在熒光顯微鏡下觀察檢測結(jié)果；
[0029]3)圖像采集與分析:采用Zeiss公司多色突光顯微鏡Axio Imager Z2型,六種濾光片采用 Chroma 公司分別為:DAPI (SP-100)，Spectrum Green?(MF101), Cy3?vl (SP-102),Texas Red(SP-107)和 Zeiss 公司 Cy5 (50)，PF-415 (45)組合，首先在 DAPI 濾光片下選擇視野，定位，然后用高分辨率CCD (Charge-Coupled Device,電荷耦合原件)相機在63倍油鏡下分別在六種濾光片通路中采集熒光信息，用圖象處理軟件Z-Stack采集模塊在每個拍攝的細胞核上進行立體掃描5-10層，采用焦深延長模塊將多層掃描的熒光雜交信號壓縮在一張圖像上，從而獲得清晰的多色圖像；
[0030]4) cut-off值建立:將試劑盒中的即用型雜交液與相應(yīng)的正常細胞雜交，應(yīng)用步驟3)采集圖像信息，計數(shù)5種基因在正常細胞中表現(xiàn)出的異常信號的種類及其比例，以其比例的“M+2SD”為cut-off值，這種異常是由于信號重疊，彎曲折疊等造成的系統(tǒng)誤差；
[0031]5)腫瘤細胞群中亞克隆的檢測:將試劑盒中的即用型雜交液與病人的腫瘤細胞標(biāo)本雜交，應(yīng)用步驟3)采集圖像信息，在AML1-ET0融合信號陽性的細胞中進行信息采集，內(nèi)容包括:①計數(shù)每個細胞內(nèi)的·融合信號、非融合信號的個數(shù)；②計算每種信號在腫瘤細胞群(至少200個AML1-ET0融合信號陽性的細胞)中出現(xiàn)的比例，并將此比例減掉相對應(yīng)的cut-off值:若結(jié)果>0則表示信號數(shù)目改變?yōu)殛栃越Y(jié)果，若結(jié)果< 0則表示信號數(shù)目改變?yōu)榧訇栃詫⑺行盘柖紴殛栃郧谊栃孕盘柋硇拖嗤募毎麣w為一個陽性亞克隆，計算其比例建立克隆衍變進化圖，根據(jù)陽性亞克隆間遺傳學(xué)上的相關(guān)性，推演亞克隆間的進化關(guān)系,列入克隆衍變進化圖中的亞克隆的比例均> 1%。
[0032]本發(fā)明所具有的有益效果:
[0033]本發(fā)明試劑盒的組合探針信號強度高，穩(wěn)定性強，在Chroma公司的DAPI (SP-100), Spectrum Green?(MF101), Cy3?vl (SP-102), Texas Red(SP_107)和 Zeiss公司的Cy5(50)，PF-415(45)六種濾光片通道下無信號交叉。用于高分辨定量多色熒光原位雜交，可以在單細胞水平同時檢測定性定量檢測5個目的基因的改變情況，可大規(guī)模檢測臨床標(biāo)本的基因異位和等位基因拷貝數(shù)改變。從而檢測同一標(biāo)本中不同亞克隆的種類及比例，同一病人初診和復(fù)發(fā)病例前后對照可以檢測亞克隆的演變狀況?？傊?，本發(fā)明提供了一種用于高分辨定量多色熒光原位雜交對t (8; 21) AML中5種目的基因進行定性定量檢測的試劑盒，不僅可以分析基因拷貝數(shù)的改變，而且能夠以基因拷貝數(shù)作為亞克隆的標(biāo)志檢測腫瘤細胞群的異質(zhì)性。而且適用于檢測同一白血病患者初診和復(fù)發(fā)的克隆衍變，通過比較初診和復(fù)發(fā)時的克隆衍變圖，判斷是否發(fā)生優(yōu)勢克隆的演變、某些治療敏感克隆的消失及某些耐藥克隆的新生。對于指導(dǎo)臨床的靶向治療具有重大意義。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0034]圖1 為，分別用 Green dUTP, PF555_dUTP，PF590_dUTP 標(biāo)記含 AMLl 基因的 3 個BAC克隆(表2)，將這3色探針雜交于正常人二倍體成纖維細胞，經(jīng)熒光顯微鏡檢測得到的圖像，結(jié)果顯示三個探針融合為I個點，說明這3個BAC克隆可以用來共定位檢測AMLl基因，來增強熒光信號強度。
[0035]圖 2 為 ，分別用 PF555-dUTP，Green dUTP, PF590_dUTP，HyPer5-dCTP, PF415_dUTP標(biāo)記含有AMLl，ETO, WTI, P27，C_kit基因的BAC克隆(如表3所示)，將這五色探針混色后雜交于正常人二倍體成纖維細胞，經(jīng)熒光顯微鏡檢測得到的圖像，結(jié)果顯示每種探針都有兩個清晰的熒光信號，信號強度高、穩(wěn)定性強，可用于后續(xù)患者標(biāo)本的檢測。
[0036]圖3為，應(yīng)用本發(fā)明檢測t(8;21)AML中目的基因拷貝數(shù)改變的探針試劑盒，在t (8; 21) AML患者中檢測的腫瘤異質(zhì)性的表現(xiàn)以及4個亞克隆間的樹狀進化關(guān)系，從各個亞克隆的比例來看，該病人這個時期的優(yōu)勢克隆的信號表型為:1個AMLl-ETO融合信號，2個AMLl信號，I個ETO信號，2個WTl信號，2個p27信號，3個c-kit信號。
[0037]圖4為，應(yīng)用檢測t (8; 21) AML中目的基因拷貝數(shù)改變的探針試劑盒，在t (8; 21)AML患者中檢測的腫瘤異質(zhì)性的表現(xiàn)，各個亞克隆間的樹狀進化關(guān)系，以及初診(圖4-1)和復(fù)發(fā)(圖4-2)時優(yōu)勢克隆的演變關(guān)系的對比可以明顯的看出亞克隆的演變:復(fù)發(fā)時有一個亞克隆消失，同時又有2個新生的亞克隆出現(xiàn)，而亞克隆“1F1G102R3I3B”(I個融合信號，I個ΕΤ0, I個AMLl，2個WT1，3個p27，3個c-kit)的比例由初診時的2.00%演變?yōu)閺?fù)發(fā)時的27.59%，表現(xiàn)出明顯的上升趨勢。
【具體實施方式】
[0038]下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步詳細說明，但不限定本發(fā)明的保護范圍。
[0039]實施例1:AML1基因探針的制備
[0040]一、探針DNA的獲取
[0041]I)劃線接種:將3個分別攜帶有AMLl基因的BAC菌種(RP11-77G18，RP11-697C13,RP11-177L11;購買于 Children’s Hospital Oakland Research Institute)分別按照如下步驟操作，首先將BAC菌種劃線接種于含有抗生素(氯霉素)的瓊脂平板上，37°C培養(yǎng)過夜(約14小時)。
[0042]2)初始培養(yǎng):次日挑取生長狀態(tài)良好的單克隆菌種，接種于2ml含有抗生素(氯霉素)的LB液體培養(yǎng)基中，放入37°C搖床，設(shè)置搖床速度約200rpm，培養(yǎng)6_8小時。
[0043]3)過夜培養(yǎng):每Iml步驟2)所得菌液轉(zhuǎn)移至200ml含有抗生素(氯霉素)的LB液體培養(yǎng)基中，放置于37°C搖床，轉(zhuǎn)速200rpm，培養(yǎng)過夜(約14-16小時)。
[0044]4)次日按照QIAGEN公司質(zhì)粒大量提取試劑盒操作說明進行DNA大量提取和純化。
[0045]二、探針標(biāo)記
[0046]1.酶切 DNA:
[0047]I )按照以下反應(yīng)體系對目的DNA進行酶切
【權(quán)利要求】
1.一種即用型雜交液，其特征在于:該即用型雜交液的組分及濃度為:AML1基因探針、ETO基因探針、WT1基因探針、P27基因探針和C-kit基因探針的濃度均為4ng/ μ 1。
2.權(quán)利要求1所述即用型雜交液的制備方法，其特征在于:包括如下步驟:1)、探針制作:在常用的數(shù)據(jù)庫如NCBI Clone Registry、Ensembl Genome Browser 和UCSC Genome Bioinformatics 上定位檢索分別含檢測 AML1、ETO、WT1、P27、C-kit 基因的BAC(Bacterial artificial chromosomes)克隆，獲得目的基因的克隆后，大量提取質(zhì)粒DNA，再采用缺口平移的方法將熒光素染料標(biāo)記的dUTP或dCTP連接到酶切好的DNA上，對標(biāo)記好的目的DNA進行組合沉淀，用含有50%去離子甲酰胺的雜交緩沖液溶解沉淀，制得即用型雜交液；2)、探針驗證:采用正常人二倍體成纖維細胞的細胞爬片進行探針驗證。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于:所述含AML1基因最優(yōu)的克隆，編號為:RP11-77G18，RP11-697C13和RP11-177L11的組合;所述含ET0基因最優(yōu)的克隆，編號為:RP11-11808和RP11-122C21的組合；所述含WT1基因最優(yōu)的克隆，編號為:RP11_258G7和RP11-955L20的組合；所述含p27基因最優(yōu)的克隆，編號為:RP11_380E18，RP11-70N14和RP11-377D9的組合；所述含c_kit基因最優(yōu)的克隆，編號為:RP11_103A16和RP11-178P22的組合。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的方法，其特征在于:所述的步驟1)為在常用的數(shù)據(jù)庫如 NCBI Clone Registry、Ensembl Genome Browser 和 UCSC Genome Bioinformatics上定位檢索分別含檢測 AML1、ETO、WT1、P27、C_kit 基因的 BAC (Bacterial artificialchromosomes)克隆，獲得目的基因的克隆后，大量提取質(zhì)粒DNA，再采用缺口平移的方法將熒光素染料標(biāo)記的dUTP或dCTP連接到酶切好的DNA上，用100%的乙醇將連接好的DNA在_20°C進行組合沉淀過夜，次日離心14000rpm，4°C，20分鐘，用槍尖小心吸棄上清，加入70%乙醇(4°C)，混勻，離心14000rpm，4°C，15分鐘，用槍尖小心吸棄上清，室溫避光干燥沉淀10分鐘，用含有50%去離子甲酰胺的雜交緩沖液溶解沉淀，制得即用型雜交液。
5.一種檢測t(8;21)AML 中目的基因拷貝數(shù)改變的探針試劑盒，其特征在于:包括權(quán)利要求1所述即用型雜交液。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的探針試劑盒，其特征在于:該檢測試劑盒還包括:12*12mm蓋玻片，18*18mm蓋玻片，載玻片，DAPI復(fù)染劑和液體橡膠。
【文檔編號】C12Q1/68GK103627787SQ201310338445
【公開日】2014年3月12日 申請日期:2013年8月6日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月6日
【發(fā)明者】王建祥, 王英嬋, 胡林萍, 程濤 申請人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液病醫(yī)院（血液學(xué)研究所）