山羊結核病pcr檢測試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種山羊結核病PCR檢測試劑盒，本發(fā)明的實施例：山羊結核病PCR檢測試劑盒，它包括250μL的PCRpremix緩沖液，150μL超純水，50μL的MarkerDL2000，40μL濃度為10μmol/L的上引物及40μL濃度為10μmol/L的下引物，20μL陰性對照以及20μL陽性對照。本發(fā)明根據(jù)牛結核分枝桿菌特異性基因片段設計引物，利用該引物建立了快速、敏感、特異的診斷山羊結核病的PCR檢測方法。將其應用在PCR快速檢測試劑盒中，可快速檢測出山羊結核病，并且具有良好的特異性及敏感性。本發(fā)明檢測結果準確，并且快捷、靈敏，操作簡單，使用效果好。
【專利說明】山羊結核病PCR檢測試劑盒
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種試劑盒，尤其是一種山羊結核病PCR檢測試劑盒。
【背景技術】
[0002]結核病(Tuberculosis)是由結核分支桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)引起人、畜、禽共患的一種慢性傳染病。山羊結核病是由牛分枝桿菌(M.bovis)引起的一種人畜共患慢性傳染病，該病被國際獸疫局(OIE)列為B類動物疾病，其傳播和流行影響著畜牧業(yè)的持續(xù)發(fā)展和人類的健康。傳統(tǒng)的牛結核分枝桿菌檢測方法主要是細菌學檢查，但由于繁瑣費時、檢出率低、靈敏度差，已不能滿足當前疫病檢疫的需要。分離培養(yǎng)需要周期長，一般需要廣2個月。而傳統(tǒng)的結核菌素皮內(nèi)變態(tài)反應(PPD)檢測方法，不斷有報道存在非特異性反應。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的是:提供一種山羊結核病PCR檢測試劑盒，它可以快速檢測山羊結核病，并且簡便、靈敏、準確、特異性強。
[0004]本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的:山羊結核病PCR檢測試劑盒，它包括250 μ L的PCR premix緩沖液，150 μ L超純水，50 μ L的Marker DL2000，40 μ L濃度為10Mmol/L的上引物及40 μ L濃度為lOMmol/L的下引物，20 μ L陰性對照以及20 μ L陽性對照；上游引物的序列為:5’_ATCAGCGACTACCTGGCCGAAG-3’ ；下游引物的序列為:5’ - GTGGCGTGCCGTTCTCGTCG-3’。
[0005]陰性對照為超純水。
[0006]陽性對照標準山羊`結核桿菌的PCR產(chǎn)物。
[0007]PCR premix 緩沖液由 3 mmol/ul 的 MgCl2, 500pmol/ul 的 dNTP 2.0 μ L, 25mmol/μ L 的 Tris-HCl 及 0.2 μ L Taq 酶組成，其 PH 值為 ρΗ8.3。
[0008]為了驗證本發(fā)明的技術效果，進行了以下實驗:
山羊結核病PCR診斷方法的建立
1、材料與方法
1、I 材料
1、1、I 病料病料來自貴州省貴陽市、遵義市、安順市、六盤水市、銅仁地區(qū)、黔南、黔東南、甕安縣等幾個規(guī)?；B(yǎng)羊場和養(yǎng)羊專業(yè)戶的送檢材料及采集的山羊血清(或全血)。
[0009]1、1、2菌株牛分枝桿菌參考菌株[編號為93006(4)]購自中國藥品生物制品檢定所(北京)。羊大腸桿菌，羊鏈球菌，羊魏氏梭菌，金黃色葡萄球菌，羊多殺性巴氏桿菌為貴州省畜牧獸醫(yī)研究所畜禽重大疫病監(jiān)測防制重點實驗室保存。
[0010]1、1、3 主要試劑 Goldview、Tris、EDTA、DL2000、Taq DNA Polymerase (5U/μ L)及相應10 X TaqBuffer、dNTP等購自寶生物(大連)工程有限公司；TIANamp細菌基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技有限公司；引物由寶生物(大連)工程有限公司合成。改良羅氏培養(yǎng)基，本實驗室吳位?行同志惠贈。[0011]1、2 方法
1、2、1引物設計與合成
參照GenBank中牛分枝桿菌的pnca基因序列，應用DNAStar軟件，遵循引物設計的基本原貝IJ，設計I對引物。5 ’ -ATCAGCGACTACCTGGCCGAAG-3 ’；下游引物的序列為:5’ -GTGGCGTGCCGTTCTCGTCG-3’。
[0012]預計擴增目的片段大小為241 bp，引物由寶生物(大連)工程有限公司合成。
[0013]1、2、2山羊結核病細菌培養(yǎng)
[0014]取新鮮全血接種于改良羅氏培養(yǎng)基上，37°C培養(yǎng)約15~30d，收集菌體進行抗酸染色鏡檢及PCR擴增。
[0015]1、2、3 核酸的提取取待檢病料樣品共約500mg，加入500 μ LPBS緩沖液，待檢樣品研磨后12000r/min離心取上清用于細菌基因組的提取。細菌基因組的提取參照TIANamp細菌基因組DNA提取試劑盒說明書進行，將提取的DNA — 20°C保存。
[0016]1、2、4 PCR 擴增 PCR 反應在 25 μ L 體系中進行，Primerl/2 各 2 μ L、10 X TaqBuffer5 μ L>dNTP mixture4 μ L、Taq DNA polymerase0.5 μ L、ddH20加至 25 μ L,反應程序:94°C 5min ；94°C 30s,55°C lmin，72°C lmin，30 個循環(huán)；最后 72°C延伸 lOmin。取 5 μ LPCR擴增產(chǎn)物于10g/L瓊脂糖凝膠中進行電泳鑒定。
[0017]1、2、5 PCR反應條件的優(yōu)化
[0018]對PCR反應條件，包括退火溫度(53°C、55°C、58°C、60°C )，引物濃度(5 μ mol/L、10 μ mol/L、20 μ mol/L), Taq DNA polymerase濃度(0.5U、1U、2U、3U3.5U),以確定最佳反應條件，同時以雙蒸水作為空白對照。多重PCR反應在50 μ L反應體系中進行，包括上下游引物各 2 μ L, IOXTaq BufferlO μ L, dNTP mixture8 μ L ；Taq DNA polymerasel μ L 用雙蒸水補足至 50 μ L0 反應條件為:94°C 5min ；94°C lmin, 54 ~60°C lmin, 72°C lmin, 30 個循環(huán)；最后72°C延伸lOmin。取5 μ LPCR擴增產(chǎn)物于10g/L瓊脂糖凝膠中進行電泳鑒定。
[0019]1、2、6敏感性試驗
[0020]將提取的牛分枝桿菌基因組用TU — 1800蛋白質核酸儀測定濃度后，經(jīng)10倍系列稀釋的核酸用于PCR反應，以確定建立的PCR的敏感性。
[0021]1、2、7特異性試驗
[0022]以牛分枝桿菌、羊大腸桿菌，羊鏈球菌，羊魏氏梭菌，金黃色葡萄球菌，羊多殺性巴氏桿菌，空白水對照為模板進行PCR反應，以確定建立的PCR的特異性。
[0023]1、2、8重復性試驗
[0024]應用建立的PCR方法，重復檢測DNA樣品3次以檢驗結果的可靠性。
[0025]1、2、9PCR對臨床樣品的檢測
[0026]對2009~2012年貴州省貴陽市、遵義市、安順市、六盤水市、銅仁地區(qū)、黔南、黔東南、甕安縣等幾個規(guī)?；B(yǎng)羊場和養(yǎng)羊專業(yè)戶采集的154份病料及864份山羊血清(或全血)進行檢測，同時進行細菌培養(yǎng)。
[0027]2、結果與分析
2、1山羊結核病細菌培養(yǎng)實驗
取新鮮全血接種于改良羅氏培養(yǎng)基上，37°C培養(yǎng)約15~30d，可觀察到米黃色、粗糙、隆起、不透明、邊緣不整齊、呈顆粒結節(jié)的菌落，菌體進行PCR擴增。2、2山羊結核病PCR檢測方法的建立以
牛結核分支桿菌的DNA為模板，進行PCR擴增，產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，擴增片段約為241bp，與預期擴增的目的片段大小相吻合；陰性對照樣本未擴增出條帶(見圖1)。結果與預期一致，此方法可用于山羊結核病的擴增。
2、3敏感性檢測
將提取的牛分枝桿菌基因組用TU — 1800蛋白質核酸儀測定濃度后，經(jīng)10倍系列稀釋的用于PCR反應，當稀釋度為10_6時仍可見清晰目的擴增條帶，該方法可以檢出的羊結核病目的基因最低DNA模板量為0.62ng/L (見圖2)，說明該方法有較好的敏感性，病毒含量極少的情況下也可被檢出。
2、4特異性檢測
以牛分支桿菌、羊大腸桿菌，羊鏈球菌，羊魏氏梭菌，金黃色葡萄球菌，羊多殺性巴氏桿菌的DNA為模板進行PCR擴增，除牛分支桿菌擴增出I條約241bp的條帶外，其它細菌及陰性對照均未見特異性片段(見圖3)，說明建立的方法具有較好的特異性，如病料中含其它病菌也不受影響。
2、5重復性檢測
應用建立的PCR方法，重復檢測牛分枝桿菌細菌基因組3次結果均一致，說明建立的PCR方法具有良好的重復性。
2、6PCR的應用
對從貴州養(yǎng)羊場(專業(yè)戶)采`集的154份臨床病料利用建立的山羊結核病PCR方法進行檢測，共檢測出57份陽性樣品，陽性率為53.2% (82/154)，細菌學檢驗陽性48份，血清(或全血)864份，檢測出361份陽性樣品，陽性率為41.8%( 361/864)，平均陽性率為43.5%(443/1018)，高于細菌學檢驗結果，說明臨床檢出率高，適合于臨床診斷。
3、討論
3.1
隨著分子生物學的發(fā)展，PCR方法已經(jīng)成為眾多病原檢測和分析的主要手段。本發(fā)明建立的山羊結核病PCR檢測方法能夠對臨床樣品進行快速、準確的檢測及鑒定，結果表明，該診斷方法敏感性好、特異性高，具有廣闊的應用前景。
3.2試驗結果表明，采用PCR反應系統(tǒng)，敏感性結果顯示最低核酸檢測量為為0.62ng/L，特異性試驗表明，除牛結核分枝桿菌的特異擴增帶(241bp)外，同時檢測羊大腸桿菌，羊鏈球菌，羊魏氏梭菌，金黃色葡萄球菌，羊多殺性巴氏桿菌，結果均為陰性。結果表明，該PCR方法具有很好的特異性和敏感性，可用于臨床山羊結核病的早期快速診斷。
[0028]由于采用了上述技術方案，本發(fā)明根據(jù)牛結核分枝桿菌特異性基因片段設計引物，利用該引物建立了快速、敏感、特異的診斷山羊結核病的PCR檢測方法。將其應用在PCR快速檢測試劑盒中，可快速檢測出山羊結核病，并且具有良好的特異性及敏感性。本發(fā)明檢測結果準確，并且快捷、靈敏，操作簡單，使用效果好。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0029]附圖1為牛分支桿菌PCR擴增；
M: DL2000 ；1:牛分支桿菌PCR結果，2:陰性對照；附圖2為PCR敏感性試驗；
M: D2000 ;1~7:10-1~I(T7倍比稀釋的DNA PCR結果；
附圖3為PCR特異性試驗；
M: DL2000 ；1:牛分枝桿菌PCR產(chǎn)物；2:大腸桿菌PCR產(chǎn)物；3:羊鏈球菌PCR產(chǎn)物；4:羊魏氏梭菌PCR產(chǎn)物；5:金黃色葡萄球菌PCR產(chǎn)物；6:羊多殺性巴氏桿菌PCR產(chǎn)物；7:空白水對照。
【具體實施方式】
[0030]本發(fā)明的實施例:山羊結核病PCR檢測試劑盒，它包括250 μ L的PCR premix緩沖液，150yL超純水，50yL的Marker DL2000，40 μ L濃度為10Mmol/L的上引物及40yL濃度為lOMmol/L的下引物，20 μ L陰性對照以及20 μ L陽性對照；；上游引物的序列為:5’ -ATCAGCGACTACCTGGCCGAAG-3’；下游引物的序列為:5’ - GTGGCGTGCCGTTCTCGTCG-3’；陰性對照為超純水；陽性對照標準山羊結核桿菌的PCR產(chǎn)物；PCR premix緩沖液由3 mmol/ul的MgCl2，500pmol/ul 的 dNTP 2.0 μ L，25mmol/μ L 的 Tris-HCl 及 0.2 μ L Taq 酶組成，其 PH值為ρΗ8.3。`
【權利要求】
1.一種山羊結核病PCR檢測試劑盒，其特征在于:它包括250 μ L的PCR premix緩沖液，150yL超純水，50yL的Marker DL2000，40 μ L濃度為10Mmol/L的上引物及40yL濃度為lOMmol/L的下引物，20 μ L陰性對照以及20 μ L陽性對照；；上游引物的序列為:5’ -ATCAGCGACTACCTGGCCGAAG-3’ ；下游引物的序列為:5’ - GTGGCGTGCCGTTCTCGTCG-3’。
2.根據(jù)權利要求1所述的山羊結核病PCR診斷試劑盒，其特征在于:陰性對照為超純水。
3.根據(jù)權利要求1所述的山羊結核病PCR診斷試劑盒，其特征在于:陽性對照為標準山羊結核桿菌的PCR產(chǎn)物。
4.根據(jù)權利要求1所述的山羊結核病PCR檢測試劑盒,其特征在于:PCRpremix緩沖液由 3 mmol/ul 的 MgCl2, 500pmol/ul 的 dNTP 2.0 μ L, 25mmol/μ L 的 Tris-HCl 及 0.2 μ LTaq酶組成，其PH值為ρΗ8. 3。
【文檔編號】C12Q1/04GK103509859SQ201310346637
【公開日】2014年1月15日 申請日期:2013年8月9日 優(yōu)先權日:2013年8月9日
【發(fā)明者】冉懋韜, 余波, 譚詩文, 王凡, 艾玉萍 申請人:貴州省畜牧獸醫(yī)研究所