硫肽前體蛋白質、編碼該蛋白質的基因及其用途
【專利摘要】本發(fā)明涉及用于硫肽生物合成的前體蛋白質、相應的結構基因及其用途。本發(fā)明還涉及用于遺傳處理該前體蛋白質的方法,或表達編碼該硫肽前體蛋白質的基因以產生硫肽化合物或其衍生物的宿主細胞。本發(fā)明進一步涉及參與硫肽生物合成的基因的克隆和表征及其在硫肽化合物產生中的用途。
【專利說明】硫肽前體蛋白質、編碼該蛋白質的基因及其用途
[0001]本申請為2008年8月6日提交的、發(fā)明名稱為“硫肽前體蛋白質、編碼該蛋白質的基因及其用途”的PCT申請PCT/EP2008/060339的分案申請,所述PCT申請進入中國國家階段的日期為2010年2月9日,申請?zhí)枮?00880102696.1。
[0002]本發(fā)明涉及用于硫肽(thiopeptide)生物合成的前體蛋白質、相應的結構基因及其用途。本發(fā)明還涉及用于遺傳處理硫肽前體蛋白質的方法,或表達編碼該硫肽前體蛋白質的基因以產生硫肽化合物或其衍生物的宿主細胞。本發(fā)明進一步涉及參與硫肽生物合成的基因的克隆和表征及其在硫肽化合物制備中的用途。
[0003]硫肽是天然的、富含硫的、高度修飾的大環(huán)肽,許多所述硫肽具有有效的抗生素活性。這些復雜的天然產物根據(jù)抗生素的Berdy化學分類分為噻唑肽(Berdy J.‘Recentdevelopments of antibiotic research and classification of antibiotics accordingtochemical structure.’ Adv Appl Microbiol.1974 ; 18 (0):309-406.)并包括硫鏈絲菌肽、諾雪七肽、微球菌素、nocathiacin、amythiamicin、GE2270A等。硫肽共有許多共同結構特征:聚集在中心多吡咯結構域中的三元或四元取代的氮雜環(huán),其為由修飾的雜環(huán)殘基(包括噻唑類、唑類和吲哚類)和脫氫氨基酸組成的大環(huán)框架(framework)的一部分。硫肽的該大環(huán)標志使得它們與其他噻唑化合物,如博來霉素、桿菌肽、或小菌素B17區(qū)分開來。Hensens首先建議根據(jù)中心雜環(huán)結構域的結構和氧化狀態(tài)對硫肽抗生素進行分類(0.D.Hensens 和 G.Albers-Schoenberg.‘Total structure of the peptide antibioticcomponentsof thiopeptin by1!! and13C NMR spectroscopy.’ Tetrahedron Lett.1978,3649)。來自Cardiff University的Mark Bagley和同事的近期綜述已經擴展了 Hensens的分類系統(tǒng),以描述5個不同的中心雜環(huán)結構域:四元取代脫氫哌啶或飽和哌啶、二氫咪唑哌唳、三元取代批卩定和四元取代羥基吡卩定(Bagley等‘Thiopeptide antibiotics.’ ChemRev.2005 年 2 月;105(2):685-714)。
[0004]盡管具有大量結構同源性,硫肽抗生素的作用(對蛋白質合成的抑制)位點和方式可分為兩個功能類:結合稱為Lll結合結構域的23S核糖體RNA區(qū)域的那些和結合參與延伸循環(huán)的Ef-Tu蛋白質復合體 的那些。經常認為在1954年首次分離為遠青鏈霉菌(Streptomyces azureus)次生代謝物的硫鏈絲菌肽是硫肽家族的原型化合物(Donovick等‘Thiostrepton,a new antibiotic.’Antibiot Annu.1955-1956 ;3:554-9 和 Bagley 等‘硫肽 antibiotics.,Chem Rev.2005 年 2 月;105(2):685-714)。
[0005]假定硫肽通過利用稱為非核糖體肽合成酶(NRPS)的大的多酶復合體的非核糖體方法合成(Mocek等 ^Biosynthesis of the modified peptide antibiotic thiostreptonin Streptomyces azureus and Streptomyces laurentii>.J.Am.Chem.Soc.1993,115,7992一8001)。NRPS裝配大環(huán)的實例是由真菌多抱木霉菌(Tolypocladiuminflatum)產生的免疫抑制肽環(huán)胞菌素。NRPS裝配肽不限于通常見于蛋白質的常見的20種L氨基酸。相反,這些酶具有摻入數(shù)百種不常見氨基酸及衍生殘基的更廣泛的所有成分的生物合成能力。
[0006]Washington大學的Heinz Floss等人指導的預實驗揭示了硫肽的確由非核糖體途徑產生。該研究組用抑制核糖體蛋白質合成水平的氯霉素處理培養(yǎng)物。然而,硫肽的從頭產生仍然繼續(xù)。當用于探測來自各生產生物的基因組DNA的Southern印跡時,來自代表硫鏈絲菌肽或相關諾雪七肽的氨基酸序列的寡核苷酸不能與任何同源序列雜交(T.M.Smith, Y.-F.Jiang, H.G.Floss.’ Thiopeptide Antibiotics’ ’ in”Biotechnologyof Antibiotics’’ W.R.Strohl,編著,第 2 版,Marcel-Dekker, New York, 1997,第 393-413頁)。
[0007]此外,在生成菌株中已經鑒定了假定編碼微球菌素合成酶復合體組件的NRPS基因片段(Carnio 等 iPyridinyl polythiazole class peptide antibiotic micrococcinPl, secreted by foodborne Staphylococcus equorum WS2733, is biosynthesizednonribosomally.’ Eur J Biochem.2001 年 12 月;268 (24):6390-401.)。
[0008]然而,至今仍未有硫肽生物合成途徑的出版說明書。
[0009]因此,需要鑒定參與硫肽生物合成的基因,其將為有效的硫肽制備提供工具并為產生可選的硫肽結構提供可能性。本發(fā)明滿足了該需要并第一次公開了用于硫肽生物合成的染色體編碼骨架(backbone)以及參與硫肽生物合成的核心生物合成酶。
[0010]1.作為硫肽生物合成起始材料的染色體編碼骨架
[0011]本發(fā)明人確實已經發(fā)現(xiàn)了這樣的確鑿證據(jù),例如在放線菌物種中染色體編碼骨架是用于硫肽生物合成的起始材料。
[0012]第一方面,本發(fā)明涉及包含選自以下的氨基酸序列的硫肽前體蛋白質
[0013](i)SEQ ID NO:1 ;
[0014](ii) SEQ ID NO:5 ; [0015](iii) SEQ ID NO:11 ;和
[0016](iv)任何所述氨基酸序列的變體。
[0017]如本文所用,術語“硫肽”指根據(jù)抗生素的Berdy’ s化學分類的噻唑肽,與其他噻唑化合物,如博來霉素、桿菌肽、或小菌素B17相反,其特征在于聚集在中心多吡咯結構域中的三元或四元取代氮雜環(huán),其為由修飾的雜環(huán)殘基(包括噻唑類、唑類和吲哚類)和脫氫氨基酸組成的大環(huán)框架的一部分。
[0018]術語“硫肽前體蛋白質”指可用作體外或體內硫肽合成起始材料的基因編碼多肽骨架。優(yōu)選地,所述硫肽前體是細菌延伸因子Ef-tu的抑制劑的前體。Ef-tu抑制劑描述于例如 Hogg T, Mesters JR 和 Hilgenfeld R.( ‘Inhibitory mechanisms ofantibiotics targeting elongation factor Tu.’ Curr Protein Pept Sc1.2002 年2月;3(1):121-31)的綜述中。眾所周知的Ef-tu抑制劑的實例是GE2270A(如Selva等 ‘Antibiotic GE2270A:a novel inhibitorof bacterial protein synthesis.1.1solation and characterization.’ J Antibiot(Tokyo).1991 年 7 月;44(7):693-701中定義)、GE37648A(如 Stella 等‘Antibiotic GE37468A:a new inhibitorof bacterialprotein synthesis.1.1solation and characterization.’ J Antibiot(Tokyo).1995 年8 月;48 (8):780-6, Erratum:J Antibiot (Tokyo) 1995 年 12 月;48 (12):C_3 中定義)和Amythiamicin (如(‘Novel antibiotics, amythiamicins.’ J Antibiot (Tokyo).1994 年6月;47(6):668-74,1145-52和1153-9中定義)。新的Ef-tu抑制劑也描述于2007年12月19日提交的國際專利申請?zhí)朠CT / US07 / 025955中。此類新Ef-tu抑制劑更特異地包括如下表示的通式I到XI的化合物(包括其可藥用鹽,以及其對映異構體、立體異構體、
旋轉異構體、互變異構體、非對映體或外消旋物):
[0019]
【權利要求】
1.包含選自以下的氨基酸序列的硫肽前體蛋白質:
(i)SEQ ID NO:1;
(ii)SEQ ID NO:5;
(iii)SEQ ID N0:11;(iv)或當與SEQ ID NO: 1、SEQ ID N0:5 或 SEQ ID NO: 11 相比時,具有不超過 1、2、3、4、5、6或10個缺失、插入和/或取代氨基酸的所述氨基酸序列的變體。
2.權利要求1的硫肽前體蛋白質,其中所述前體是Ef-tu硫肽抑制劑的生物合成前體。
3.權利要求2的硫肽前體蛋白質,其中所述Ef-tu抑制劑選自GE2270A、GE37648A、Amythiamicin或如以下任意通式1-XI中的任意通式所示的化合物:
4.核酸,其包含編碼權利要求1-3中任一項的硫肽前體蛋白質的核苷酸序列。
5.權利要求4的核酸,其包含SEQID NO: 5的核苷酸序列。
6.權利要求5的核酸,其包含SEQID NO:6的核苷酸序列或包含至少SEQ ID N0:5的其任何片段。
7.權利要求4-6中任一項的核酸,其中所述核酸序列有效連接異源轉錄和翻譯控制序列。
8.權利要求7的核酸,其中所述核酸是表達載體。
9.用于硫肽生物合成的多肽,其包含選自以下的氨基酸序列: (i)SEQID NO:23-34 中的任一個, (ii)(i)中列出的氨基酸序列的變體,當與(i)中列出的相應野生型氨基酸序列相比時,其具有不超過1、2、3、4、5、6、或10個缺失、插入或取代氨基酸,并保留基本上相同的酶功能。
10.核酸,其包含編碼權利要求9的多肽的核苷酸序列。
11.權利要求10的核酸,其中所述核酸序列有效連接異源轉錄和翻譯序列。
12.包含權利要求4-6中任一項的核酸的宿主細胞,其中在所述宿主細胞的基因組中未天然發(fā)現(xiàn)所述核酸。
13.權利要求12的宿主細胞,其還包含硫肽生物合成所需的其他基因。
14.權利要求13的宿主細胞,其中硫肽生物合成所需的所述其他基因包含權利要求10或11定義的核酸。
15.權利要求13或14的宿主細胞,其選自野野村氏菌屬物種、游動雙孢菌屬物種、擬無枝酸菌屬物種、大腸桿菌(Escherichia coli)、棒桿菌屬物種(Corynebacteriumsp.)、芽孢桿菌屬物種(Bacillus sp.)和鏈霉菌屬物種,如變鉛青鏈霉菌、天藍色鏈霉菌、白色鏈霉菌(Streptomyces albus)、Streptomyces ramocissimus、丘鏈霉菌(Streptomyces collinus)、弗氏鏈霉菌(Streptomyces fradiae)、遠青鏈霉菌或灰色鏈霉菌(Streptomyces griseus),并且其中所述宿主細胞針對所述硫肽提供抗性。
16.突變體微生物,其中與相應野生型微生物相比時,所述突變體微生物不再表達編碼如權利要求1-8中任一項定義的硫肽前體蛋白質的基因。
17.權利要求16的突變體微生物,其中所述突變在相應野生型微生物中是編碼如權利要求1-8中任一項定義的硫肽前體蛋白質的基因的破壞。
18.權利要求17的突變體微生物,其中所述微生物是野野村氏菌屬物種并且所述突變是包含SEQ ID NO: 15或SEQ ID NO: 16的基因的破壞。
19.權利要求16-18中任一項的突變體微生物,其中用權利要求1-8中任一項的核酸進一步轉化所述突變體。
20.突變體微生物,其中所述突變體微生物不再表達編碼如權利要求9定義的一個或多個多肽的一個或多個基因。
21.用于硫肽生物合成的多肽,其包含選自以下的氨基酸序列: (i)SEQID N0:47-60 的中任一個, (ii)(i)中列出的氨基酸序列的變體,與(i)中列出的相應野生型氨基酸序列相比時,其具有不超過1、2、3、4、5、6或10個缺失、插入或取代氨基酸,并保留基本上相同的酶促功能或調節(jié)功能, (iii)(i)中列出的氨基酸序列的變體,其與Q)中列出的一個多肽具有至少80%或至少90%的同一性,并保留基本上相同的酶促功能或調節(jié)功能。
22.包含編碼權利要求21的多肽的核苷酸序列的核酸。
23.權利要求22的核酸,其中所述核酸序列有效連接異源轉錄和翻譯序列。
24.包含權利要求22或23的核酸的宿主細胞,其中在所述宿主細胞的基因組中未天然發(fā)現(xiàn)所述核酸。
25.權利要求24的宿主細胞,其還包含硫肽生物合成需要的其他基因。
26.權利要求25的宿主細胞,其中硫肽生物合成需要的所述其他基因選自編碼權利要求4-8中任一項的硫肽前體蛋白質的核酸和權利要求10-11的核酸。
27.突變體微生物,其能夠產生一個或多個特定基因的表達有缺陷的硫肽,所述特定基因編碼如權利要求21中所定義的一個或多個多肽。
28.用于產生硫肽前體蛋白質的方法,所述方法包括在適合于產生所述硫肽前體蛋白質的條件下培養(yǎng)權利要求12、13、15或24-26的宿主細胞的步驟。
29.產生硫肽化合物的方法,所述方法包括在適合于產生所述硫肽前體化合物的條件下培養(yǎng)權利要求12、13、15或24-26的宿主細胞的步驟。
30.權利要求28或29的方法,其還包括分離基本純形式的所述硫肽前體或硫肽化合物。
31.權利要求29或30的方法,其中所述硫肽化合物選自:GE2270A、GE37648A、如權利要求5中任意通式1-X中任意通式所示的化合物、amythiamicin、微球菌素、硫鏈絲菌肽、諾雪七妝、高硫青霉素、thiocins、nocathiacins、伯爾尼霉素、A10255B和radamycin。
32.產生硫肽衍生物的方法,其包括: (i)通過在所述宿主細胞中基因表達編碼所述改變的硫肽前體的序列,在宿主細胞中合成改變的硫肽前體, (ii)從所述改變的硫肽前體合成所述硫肽衍生物。
33.權利要求32的方法,其中所述改變的硫肽衍生物前體是如權利要求1-11中任一項定義的 SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO:5 或 SEQ ID NO: 11 的變體。
34.權利要求32或33的方法,其中步驟ii)在體外進行。
35.權利要求32或33的方法,其中步驟ii)在與步驟i)相同的宿主細胞中體內進行。
36.產生硫肽或硫肽衍生物的方法,其包括: (i)提供包含如1-3中任一項中定義的硫肽前體蛋白質的培養(yǎng)基, (ii)在所述培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物,其中所述微生物還包含硫肽生物合成所需的其他基因。
37.權利要求36的方法,其中硫肽生物合成所需的所述其他基因選自編碼下述多肽的那些基因,所述多肽選自SEQ ID N0:23-34和SEQ IDNO:47-60?
38.權利要求36或37的方法,其中所述微生物選自自野野村氏菌屬物種、游動雙孢菌屬物種、擬無枝酸菌屬物種和鏈霉素物種,如變鉛青鏈霉菌、天藍色鏈霉菌、白色鏈霉菌、Streptomyces ramocissimus、丘鏈霉菌、弗氏鏈霉菌、遠青鏈霉菌或灰色鏈霉菌,其中所述微生物是選擇為對所述硫肽或硫肽衍生物有抗性的菌株。
【文檔編號】C12N1/20GK103483424SQ201310347021
【公開日】2014年1月1日 申請日期:2008年8月6日 優(yōu)先權日:2007年8月9日
【發(fā)明者】R·莫里斯 申請人:諾瓦提斯公司