用于部分標(biāo)記和后續(xù)定量分析細(xì)胞懸液中細(xì)胞的方法和裝置制造方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種用于標(biāo)記細(xì)胞懸液中細(xì)胞的方法，包括下述步驟：提供一個(gè)具有正好濃集在腔室內(nèi)表面上的超順磁性標(biāo)記顆粒的微流體腔室；以及將細(xì)胞懸液填充進(jìn)所述腔室中。
【專利說明】用于部分標(biāo)記和后續(xù)定量分析細(xì)胞懸液中細(xì)胞的方法和裝
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種用于以超順磁顆粒對(duì)細(xì)胞懸液的細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記的方法和裝置，該超順磁標(biāo)記顆粒為此特別設(shè)置有特異性抗體。
【背景技術(shù)】
[0002]借助不同的標(biāo)記法在細(xì)胞樣本中標(biāo)記細(xì)胞物質(zhì)，能夠在復(fù)雜的細(xì)胞樣本中對(duì)細(xì)胞物質(zhì)進(jìn)行選擇并定量分析。已知的方法是，基于單個(gè)細(xì)胞的計(jì)數(shù)來實(shí)現(xiàn)細(xì)胞物質(zhì)的定量分析。多種流式細(xì)胞術(shù)容許借助熒光標(biāo)記或者電磁選擇標(biāo)記來定量細(xì)胞。然而，不利的是，這些方法以要測(cè)量的樣本的密集處理為前提。樣本的處理可以例如離心分離、過濾、沉淀等工作步驟為前提。這些工作方式經(jīng)常會(huì)帶來分析物的部分損耗。
[0003]其中，在已知的細(xì)胞計(jì)數(shù)方法中的基本問題是，要對(duì)細(xì)胞樣本內(nèi)存在的極少數(shù)量的細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記并且最后進(jìn)行計(jì)數(shù)。因此，已知的方法旨在由極少量經(jīng)標(biāo)記的細(xì)胞生成充足的信號(hào)。
[0004]已知流式細(xì)胞術(shù)的方法的不足之處在于，其很難處理包含大量要標(biāo)記細(xì)胞、例如細(xì)胞密度為IO4個(gè)/ μ I的細(xì)胞樣本，這主要是因?yàn)橛捎谑荏w濃度較高，即大量的細(xì)胞，而需要大量的標(biāo)記顆粒以便足夠好地進(jìn)行磁性標(biāo)記。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于，提供一種用于定量分析細(xì)胞樣本的細(xì)胞的方法和裝置，其避免了開頭所述的問題，尤其是能夠處理待測(cè)細(xì)胞的濃度相對(duì)較高的細(xì)胞樣本。
[0006]上述目的通過具有權(quán)利要求1所述特征的方法得以實(shí)現(xiàn)。另一解決方案為權(quán)利要求9所述的裝置。從屬權(quán)利要求則涉及本發(fā)明的有利實(shí)施方式。
[0007]在本發(fā)明的用于標(biāo)記細(xì)胞懸液的細(xì)胞的方法中，作為第一步提供微流體腔室，該微流體腔室具有主要濃集在其內(nèi)表面上的超順磁標(biāo)記顆粒，其中該標(biāo)記顆粒特別具有用于結(jié)合細(xì)胞的特異性抗體。作為第二步，將細(xì)胞懸液填充進(jìn)所述腔室中。
[0008]由此有利地實(shí)現(xiàn)了標(biāo)記懸浮液中細(xì)胞的精確比例。只有那些在濃集有標(biāo)記顆粒的內(nèi)表面的區(qū)域中流動(dòng)的細(xì)胞懸液中的細(xì)胞才被標(biāo)記。并未在該內(nèi)表面的區(qū)域中流動(dòng)的細(xì)胞就不會(huì)與標(biāo)記顆粒獲得任何接觸，由此不會(huì)被標(biāo)記。
[0009]因此，換句話說，通過這種設(shè)置實(shí)現(xiàn)了對(duì)一定比例的細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記、并且也基本上對(duì)該一定比例的細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記。
[0010]其中重要的是，在微流體的腔室內(nèi)，由于其尺寸，主要存在的是基本為層狀的流體。流動(dòng)的細(xì)胞懸液的不同的層幾乎不互相混合，因此，基本上只有這些緊鄰設(shè)著標(biāo)記顆粒的內(nèi)表面的細(xì)胞得到標(biāo)記。在這里，實(shí)質(zhì)上涉及到的是與擴(kuò)散有關(guān)的步驟:只有與標(biāo)記顆粒緊靠的血小板可與其結(jié)合。自該時(shí)間點(diǎn)起，其開始滾動(dòng)并且再吸納更多的標(biāo)記顆粒。
[0011]因此，就能夠由腔室的垂直于其內(nèi)表面的厚度以及細(xì)胞懸液經(jīng)過標(biāo)記的層厚容易地確定經(jīng)標(biāo)記細(xì)胞的比例。
[0012]因此，本文所述的發(fā)明能夠?qū)崿F(xiàn)在微流體系統(tǒng)內(nèi)以超順磁性納米顆?；蛭⒚最w粒受控地、部分地并且無損耗地標(biāo)記小容量復(fù)雜樣本內(nèi)的細(xì)胞物質(zhì)。在此，有利的是不需要任何稀釋步驟。已經(jīng)大量存在的細(xì)胞物質(zhì)無需預(yù)先富集或者與其他細(xì)胞類型分離。所介紹的系統(tǒng)有利地簡(jiǎn)化了凈化、標(biāo)記復(fù)雜樣本如體液或者身體分泌物中的細(xì)胞的工作步驟。
[0013]在此有利的是使用其空腔基本為長(zhǎng)方體(quaderf5rmig)的腔室。因此，通過這種簡(jiǎn)單的幾何結(jié)構(gòu)，特別能夠很好地確定經(jīng)標(biāo)記細(xì)胞的比例。
[0014]另外，腔室具有在10 μ m至1000 μ m之間的厚度是有利的，其中該厚度說明了垂直于有標(biāo)記顆粒濃集的內(nèi)表面的延伸。在該厚度的范圍內(nèi)，可最好地實(shí)現(xiàn)層流并且同時(shí)標(biāo)記一定比例的細(xì)胞，這一比例以百分比或者千分比計(jì)。通過腔室的厚度來確定該比例還可避免必須稀釋細(xì)胞懸液。
[0015]為了提供微流體腔室，優(yōu)選實(shí)施以下步驟:
[0016]-向微流體腔室填充含有標(biāo)記顆粒的懸浮液；
[0017]-借助磁體使標(biāo)記顆粒濃集在腔室的內(nèi)表面上。
[0018]為此優(yōu)選使用永磁體?？蛇x地，還采用電磁體。
[0019]有利地在一個(gè)泵送步驟中將細(xì)胞懸液填充進(jìn)腔室中，該步驟同時(shí)從腔室中去除了含有標(biāo)記顆粒的懸浮液的殘留。然后，可中斷填充腔室，使得細(xì)胞懸液在一個(gè)靜置時(shí)間(Standzeit)內(nèi)在腔室中保持靜態(tài)。例如可將一秒鐘或者更短的時(shí)間選定為靜置時(shí)間。靜置時(shí)間例如就通過起引力作用提高了在內(nèi)表面區(qū)域內(nèi)經(jīng)標(biāo)記的細(xì)胞的比例，然而也容許細(xì)胞在腔室中擴(kuò)散，由此能夠標(biāo)記原本并不是位于靠近內(nèi)表面的標(biāo)記區(qū)域內(nèi)的細(xì)胞。可選地，沒有中斷地將細(xì)胞懸液引導(dǎo)通過腔室。
[0020]在兩種情況下，細(xì)胞懸液`均可例如被導(dǎo)向測(cè)量設(shè)備，以便對(duì)經(jīng)標(biāo)記的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。
[0021]在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，在腔室之外、但在腔室內(nèi)表面的區(qū)域中布置具有鐵芯的線圈。該鐵芯用于形成磁場(chǎng)，把標(biāo)記顆粒吸引至內(nèi)表面。由此可有利地實(shí)現(xiàn)標(biāo)記顆粒均勻地位于內(nèi)表面上，因?yàn)橥ㄟ^鐵芯減小了磁場(chǎng)的不均勻性。由此就減少了標(biāo)記顆粒向著腔室一端的積聚。有利的是，鐵芯的朝向腔室內(nèi)表面的外表面至少具有其內(nèi)表面的尺寸。理想情況下，鐵芯略大于微流體腔室。線圈產(chǎn)生的磁場(chǎng)有利地大于、尤其是明顯大于磁體的磁場(chǎng)。
[0022]在本發(fā)明的一個(gè)擴(kuò)展中，鐵芯在朝向腔室內(nèi)表面的外表面上具有凹口。這些凹口優(yōu)選以規(guī)則的圖案排列。在此，該凹口例如可以是平行的線條或者例如遵循正方形的線條圖樣。由此能夠確定標(biāo)記顆粒積聚的形狀。
[0023]使用鐵芯的備選方案是，其內(nèi)表面本身還可設(shè)有凹口。由此同樣減少了標(biāo)記顆粒向腔室一端的積聚，因?yàn)闃?biāo)記顆粒被收集在凹口內(nèi)并且在磁場(chǎng)的作用下完全無法在凹口之間移動(dòng)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0024]本發(fā)明的其它有利的實(shí)施方式和優(yōu)勢(shì)為本發(fā)明下文的實(shí)施例參照附圖所說明的對(duì)象，其中，相同的附圖標(biāo)記表示具有同樣作用的組件。其中:[0025]圖1:用于細(xì)胞測(cè)量的具有微流體系統(tǒng)裝置圖；[0026]圖2:準(zhǔn)備進(jìn)行細(xì)胞測(cè)量的微流體腔室圖；
[0027]圖3:具有部分經(jīng)標(biāo)記細(xì)胞的微流體腔室的剖面圖；
[0028]圖4:具有附加鐵芯的裝置的實(shí)施方式；
[0029]圖5:具有鐵芯的裝置的實(shí)施方式，該鐵芯具有凹口 ；
[0030]圖6:在微流體腔室的壁上具有凹口的裝置的實(shí)施方式。
【具體實(shí)施方式】
[0031]下面的實(shí)施例涉及到如圖1所示的用于細(xì)胞測(cè)量的裝置1，其中細(xì)胞密度非常高的細(xì)胞懸液中的細(xì)胞15、16經(jīng)標(biāo)記，然后被送入計(jì)數(shù)裝置14，以進(jìn)行定量分析。所述裝置I具有被布置在共同載體上的永磁體12，在其表面上構(gòu)成微流體系統(tǒng)。其中，所述微流體系統(tǒng)包括用于將流體導(dǎo)入微流體管線13中的樣本導(dǎo)入裝置18。
[0032]樣本導(dǎo)入裝置18將流體導(dǎo)入微流體腔室10中，在其中進(jìn)行細(xì)胞的標(biāo)記。其中，所述腔室10設(shè)置在永磁體上。所述微流體系統(tǒng)在輸出端進(jìn)一步通向計(jì)數(shù)裝置14，在其中可對(duì)所標(biāo)記的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。
[0033]在本實(shí)施例中，計(jì)數(shù)裝置14基于磁場(chǎng)的探測(cè)，例如GMR、AMR或者TMR。向計(jì)數(shù)裝置14輸送的液體中標(biāo)記細(xì)胞濃度過高會(huì)導(dǎo)致傳感器飽和，進(jìn)而導(dǎo)致測(cè)量誤差。為此，對(duì)于所使用的細(xì)胞懸液，例如細(xì)胞密度為IO5個(gè)/μ I的細(xì)胞懸液，會(huì)使用一種特別的標(biāo)記方法，其準(zhǔn)備措施在下面借助圖2進(jìn)一步闡明。
[0034]在圖2中示出了為細(xì)胞標(biāo)記而準(zhǔn)備微流體腔室10，在第一個(gè)步驟100中提供該準(zhǔn)備。所述微流體腔室10可有利地借助壓鑄技術(shù)制成。在本實(shí)施例中，微流體腔室10的厚度D = 100 μ m。然而也可采用其他規(guī)格，例如D = 10 μ m、D = 50 μ m或者D = 980 μ m。所述微流體腔室10在其端面21上具有圖2中未示出的入口和出口。該腔室的總?cè)萘吭诒緦?shí)施例中為I μ I，其中，在厚度如上所述為100 μ m的情況下,腔室長(zhǎng)為IOmm,高為1mm。
[0035]在第二個(gè)步驟110中，將含有超順磁標(biāo)記顆粒11的懸液導(dǎo)入微流體腔室10中。其中，標(biāo)記顆粒11通常在懸液中沒有任何特定的分布，而是先均勻地分布。另外，標(biāo)記顆粒11在本實(shí)施例中具有特異性抗體。在備選的實(shí)施方式中，也可使用無抗體的標(biāo)記顆粒11。
[0036]然后，在第三個(gè)步驟120中，標(biāo)記顆粒11通過磁力作用，在本實(shí)施例中即通過永磁體12，朝向所述微流體腔室10的底部移動(dòng)。
[0037]接著，在第四個(gè)步驟130中，將懸液-除由永磁體所保留的標(biāo)記顆粒11之外-從所述微流體腔室10中除去。其中，在添加實(shí)際的分析物溶液之前，用空氣來代替前面所述的標(biāo)記顆粒11的溶劑。由此烘干標(biāo)記顆粒11。這一步驟的持續(xù)時(shí)間可受到整個(gè)系統(tǒng)(由入口直到腔室)的容量的影響。在共同(gemeinsam)的步驟中，將含有最初未經(jīng)標(biāo)記的細(xì)胞15的細(xì)胞懸液填充進(jìn)所述微流體腔室10中。在本實(shí)施例中，這是通過在微流體管線13的一端17進(jìn)行抽吸來實(shí)現(xiàn)的，該微流體管線13由微流體腔室10經(jīng)由細(xì)胞測(cè)量裝置14。
[0038]當(dāng)細(xì)胞懸液位于所述微流體腔室10內(nèi)時(shí)，會(huì)在該處停留很短的時(shí)間、例如半秒。在這個(gè)時(shí)間內(nèi)，細(xì)胞懸液中未經(jīng)標(biāo)記的細(xì)胞15就被基本靜止地保留在微流體腔室10中，實(shí)際上并不會(huì)發(fā)生分層或者沉降。然而，這些靠近順磁標(biāo)記顆粒11的未標(biāo)記細(xì)胞15會(huì)與這些順磁顆粒結(jié)合并且由此成為經(jīng)標(biāo)記的細(xì)胞16。因此，經(jīng)標(biāo)記的細(xì)胞16僅存在于靠近微流體腔室10底部的明確的區(qū)域中。
[0039]圖3示意性地示出了在用細(xì)胞懸液填充微流體腔室10時(shí)發(fā)生了什么。靠近具有標(biāo)記顆粒11的內(nèi)表面的部分細(xì)胞滾落在腔室內(nèi)表面上，并且通常會(huì)吸收大量的標(biāo)記顆粒11。因此，在幾何上遠(yuǎn)離該內(nèi)表面的部分細(xì)胞15基本保持未經(jīng)標(biāo)記的同時(shí)，向經(jīng)標(biāo)記的細(xì)胞16提供了大量的標(biāo)記顆粒11。
[0040]在本實(shí)施例中，所有那些位于距腔室10底部5 μ m的區(qū)域內(nèi)的未標(biāo)記細(xì)胞15都可能經(jīng)標(biāo)記。因?yàn)榭梢哉J(rèn)為幾乎所有停留在該范圍內(nèi)的細(xì)胞15在流過所述腔室10時(shí)實(shí)際上也會(huì)經(jīng)標(biāo)記，因此，在簡(jiǎn)單計(jì)算下，5%的細(xì)胞15會(huì)變成經(jīng)標(biāo)記的細(xì)胞16。其中，為了提高精確度，也可將細(xì)胞的直徑計(jì)算在內(nèi)。
[0041]因?yàn)橹挥邢鄬?duì)較少、但比例很好確定的細(xì)胞16經(jīng)標(biāo)記，所以計(jì)數(shù)裝置14就能夠沒有任何問題地進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)并且能夠推算出實(shí)際的細(xì)胞密度。
[0042]其中，所述微流體系統(tǒng)可有利地這樣設(shè)計(jì)，使得能夠容易地更換具有標(biāo)記顆粒11的腔室10。因此，可通過選擇標(biāo)記顆粒11或腔室的幾何結(jié)構(gòu)使標(biāo)記適合于細(xì)胞懸液的種類。
[0043]微流體腔室10在永磁體12上的布置可能帶來問題:因?yàn)闃?biāo)記顆粒11根據(jù)磁場(chǎng)定向，朝向腔室10的靠近永磁體12中心44的末端積聚。為了處理這種情況，有多種可能的
方案:
[0044]實(shí)施例2:`[0045]如圖4中所示，在微流體腔室10的一側(cè)上遠(yuǎn)離永磁體12布置具有鐵芯的線圈41。該線圈一方面生成了磁場(chǎng)，該磁場(chǎng)通過磁場(chǎng)線43表示。只要該磁場(chǎng)在微流體腔室10的長(zhǎng)度上是均勻的并且明顯強(qiáng)于永磁體12的磁場(chǎng)，那么標(biāo)記顆粒11就均勻地向著微流體腔室10的相應(yīng)壁移動(dòng)，即便在本實(shí)施例中微流體腔室10明顯遠(yuǎn)離永磁體12的中心44布置時(shí)也如此。線圈所需要的能量取決于其與磁體的間距，因?yàn)榇帕﹄S著距離遞減。通過調(diào)整與磁體的距離，能夠節(jié)省能量并且例如也能夠向線圈提供更低能量的電池。
[0046]實(shí)施例3:
[0047]圖5示出了鐵芯的實(shí)施方式:在第一種實(shí)施方式51中，鐵芯具有凹口 52，其中留在所述凹口 52之間的、橫向于微流體腔室10中的流動(dòng)方向的搭接(Steg)構(gòu)成了直線。標(biāo)記顆粒11就向著留下的搭接移動(dòng)，由此在微流體腔室10的表面上形成了直線。
[0048]在鐵芯的第二種實(shí)施方式53中，鐵芯具有更小的凹口 54，其中留下的搭接在本實(shí)施方式53中構(gòu)成了正方形的線條圖樣。標(biāo)記顆粒11由此以正方形的圖樣沉積在微流體腔室10的表面上。
[0049]實(shí)施例4:
[0050]圖6示出了微流體腔室10的一個(gè)可選的實(shí)施方式。在這種情況下，使用了小的線圈41。在此，取而代之的是，使微流體腔室10的表面結(jié)構(gòu)化。顆粒向著永磁體12的中心44移動(dòng)，但是可能由于這種表面結(jié)構(gòu)而不沿著腔室表面移動(dòng)。顆粒由此被固定在一定的位置上。為此，微流體腔室10的內(nèi)表面具有凹槽61，在上面沉積有標(biāo)記顆粒11。凹槽61沿著微流體腔室10的長(zhǎng)度均勻地分布。
【權(quán)利要求】
1.一種用于標(biāo)記細(xì)胞懸液中細(xì)胞(15)的方法，包括以下步驟: -提供(100、110、120)微流體腔室(10)，其具有主要濃集在所述腔室(10)內(nèi)表面上的超順磁性標(biāo)記顆粒(11)； -將所述細(xì)胞懸液填充(130)至所述腔室(10)中。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其中，使用空腔為長(zhǎng)方體并且具有10μ m至1000 μ m厚度的腔室(10)，其中該厚度說明了垂直于濃集有標(biāo)記顆粒(11)的內(nèi)表面的延伸。
3.權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，所述提供微流體腔室(10)包括以下步驟: -向所述微流體室腔(10)填充含有標(biāo)記顆粒(11)的懸液； -借助磁體(12)使得標(biāo)記顆粒(11)濃集在所述腔室(10)的內(nèi)表面上。
4.上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中，通過共同的泵送步驟，將含有標(biāo)記顆粒(11)的懸液從所述腔室(10)中除去并且向腔室(10)填充細(xì)胞懸液。
5.上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中，通過所述腔室(10)引導(dǎo)細(xì)胞懸液，使得在所述腔室(10)內(nèi)基本上形成層流。
6.權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述細(xì)胞懸液在填充進(jìn)所述腔室(10)之后經(jīng)過靜置時(shí)間后被導(dǎo)向測(cè)量裝置(14)。
7.權(quán)利要求6所述的方法，其中，使用少于I秒的時(shí)間作為靜置時(shí)間。
8.上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中，在所述測(cè)量裝置(14)中對(duì)經(jīng)標(biāo)記的細(xì)胞(16)進(jìn)行計(jì)數(shù)。
9.一種用于標(biāo)記細(xì)胞懸液的細(xì)胞(15)的裝置(I)，其被配置為用于執(zhí)行上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，該裝置(I)包括: -微流體腔室(10)，和 -用于向所述腔室(10)填充流體的手段。
10.權(quán)利要求9所述的裝置(I)，其具有布置在所述腔室(10)的區(qū)域中的永磁體(12)。
11.權(quán)利要求10所述的裝置(I)，具有布置在腔室(10)外部的線圈，該線圈在所述腔室(10)的內(nèi)表面的區(qū)域中具有鐵芯。
12.權(quán)利要求10所述的裝置(I)，其中，所述鐵芯在朝向所述腔室(10)內(nèi)表面的外表面上具有凹口(52，54)。
13.權(quán)利要求9所述的裝置(I)，其中，所述內(nèi)表面具有凹槽(61)。
14.權(quán)利要求9至13中任一項(xiàng)所述的裝置，其具有用于對(duì)經(jīng)標(biāo)記的細(xì)胞(16)進(jìn)行計(jì)數(shù)的測(cè)量裝置(14)，所述測(cè)量裝置以及所述永磁體(12)和所述腔室(10)布置在共同的載體上。
【文檔編號(hào)】C12M1/34GK103509848SQ201310355780
【公開日】2014年1月15日 申請(qǐng)日期:2013年6月21日 優(yōu)先權(quán)日:2012年6月21日
【發(fā)明者】O·海登, M·J·赫洛, L·里克特 申請(qǐng)人:西門子公司