一種用于培養(yǎng)人羊膜上皮細(xì)胞的培養(yǎng)基的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于培養(yǎng)人羊膜上皮細(xì)胞的培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基由DMEM、胎牛血清、丙酮酸鈉、L-谷氨酰胺、EGF、β-巰基乙醇和非必需氨基酸組成。本發(fā)明的培養(yǎng)基適用于人羊膜上皮細(xì)胞的培養(yǎng)，尤其適用于原代人羊膜上皮細(xì)胞的分離和純化過程中的培養(yǎng)，同時(shí)可以降低移植人體過程中引發(fā)免疫反應(yīng)的幾率。
【專利說明】一種用于培養(yǎng)人羊膜上皮細(xì)胞的培養(yǎng)基

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體的說涉及一種用于培養(yǎng)人羊膜上皮細(xì)胞的培養(yǎng)基。

【背景技術(shù)】
[0002]人羊膜上皮細(xì)胞(amn1tic epithelial cells, AECs)在受精后第8天由外胚層細(xì)胞發(fā)育而來，使其可能維持原腸胚形成胚胎干細(xì)胞的可塑性。人羊膜上皮細(xì)胞不表達(dá)HLA-A，B，C或DR抗原，移植后不易引起免疫排斥反應(yīng)。在一定條件下，人羊膜上皮細(xì)胞可分化為成熟的神經(jīng)元細(xì)胞，毛囊和皮膚上皮細(xì)胞，人羊膜上皮細(xì)胞理論上可以分化成為各種組織細(xì)胞。因此，對(duì)人羊膜上皮細(xì)胞培養(yǎng)方法的探索及對(duì)人羊膜上皮細(xì)胞的生長特性的研究具有重要意義，可為將來的組織工程應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
[0003]人羊膜上皮細(xì)胞是從人胎盤羊膜上分離得到，而人羊膜組織由來源于外胚層的羊膜上皮細(xì)胞和中胚層的羊膜間質(zhì)細(xì)胞組成。傳統(tǒng)的方法很難從羊膜中分離得到高純度的羊膜上皮細(xì)胞。
[0004]目前人羊膜上皮細(xì)胞的體外大多采用小鼠3T3細(xì)胞作為滋養(yǎng)細(xì)胞，滋養(yǎng)細(xì)胞對(duì)羊膜上皮細(xì)胞的生長、增殖有促進(jìn)作用。但3T3細(xì)胞是異種細(xì)胞，所含蛋白移植到人體內(nèi)會(huì)引起免疫反應(yīng)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明提供一種用于培養(yǎng)人羊膜上皮細(xì)胞的培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基由DMEM、胎牛血清、丙酮酸鈉、L-谷氨酰胺、EGF (表皮生長因子)、巰基乙醇、非必需氨基酸成分組成；
[0006]其中DMEM(Deulbecco’s Modified Eagle Medium,改良 Eagle 培養(yǎng)基)，可以為低糖的，也可以為高糖，優(yōu)選為低糖DMEM ；DMEM的含量為10g/1000ml ；
[0007]其中胎牛血清的體積含量為5?15%，優(yōu)選含量為10% ；
[0008]其中丙酮酸鈉的含量為0.0550?0.2200g/1000ml ;優(yōu)選的為0.1100g/1000ml ；
[0009]其中L-谷氨酰胺的含量為0.0731?0.2193g/1000ml ;優(yōu)選的為0.1461g/1000ml ；
[0010]其中β -巰基乙醇的含量為1.9287?5.7861g/1000ml ;優(yōu)選的為3.8574g/1000ml ；
[0011]其中EGF的含量為5?15ng/ml ;優(yōu)選的為10ng/ml ；
[0012]其中非必需氨基酸的含量為0.5mM?2mM，優(yōu)選含量為ImM，其中10mM非必需氨基酸的組成為:L-丙氨酸1500mg/L、L-天門冬酰胺890mg/L、L-天冬氨酸1330mg/L、L-谷氨酸 1470mg/L、甘氨酸 750mg/L、L-脯氨酸 1150mg/L 和 L-絲氨酸 1050mg/L ；
[0013]本發(fā)明的用于培養(yǎng)人羊膜上皮細(xì)胞的培養(yǎng)基的PH值保持在7.0?7.4，優(yōu)選PH值為 7.2。
[0014]將以上組分混合，即可得到培養(yǎng)人羊膜上皮細(xì)胞的培養(yǎng)基。
[0015]本發(fā)明的培養(yǎng)基適用于人羊膜上皮細(xì)胞的培養(yǎng)，尤其適用于原代人羊膜上皮細(xì)胞的分離和純化過程中的培養(yǎng)。本發(fā)明培養(yǎng)基能使在無3T3細(xì)胞的情況下成功得使人羊膜上皮細(xì)胞生長、擴(kuò)增。相對(duì)于傳統(tǒng)的培養(yǎng)人羊膜上皮細(xì)胞的培養(yǎng)基，本發(fā)明培養(yǎng)基能優(yōu)先促進(jìn)人羊膜上皮細(xì)胞的生長，同時(shí)抑制其他雜細(xì)胞的生長。由于不含3T3細(xì)胞，使得羊膜上皮細(xì)胞的培養(yǎng)變得簡單、高效，同時(shí)降低了移植人體過程中引發(fā)免疫反應(yīng)的幾率。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0016]圖1為實(shí)施例2獲得的原代羊膜上皮細(xì)胞培養(yǎng)三天后的AECs的細(xì)胞動(dòng)態(tài)圖；
[0017]圖2為實(shí)施例2獲得的原代羊膜上皮細(xì)胞培養(yǎng)五天后的AECs的細(xì)胞動(dòng)態(tài)圖；
[0018]圖3為實(shí)施例2獲得的AECs傳代培養(yǎng)三天后的細(xì)胞動(dòng)態(tài)圖；
[0019]圖4為實(shí)施例2獲得的AECs傳代培養(yǎng)后的SSEA-4的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果圖。

【具體實(shí)施方式】
[0020]下面結(jié)合實(shí)施例，對(duì)如何應(yīng)用本發(fā)明的培養(yǎng)人羊膜上皮細(xì)胞的培養(yǎng)基從羊膜組織中分離得到高純度的羊膜上皮細(xì)胞，做進(jìn)一步詳細(xì)說明。
[0021]實(shí)施例1:1000ml人羊膜上皮細(xì)胞的培養(yǎng)基的制備
[0022]890ml DMEM (gbico)培養(yǎng)基中加入胎牛血清(Hyclone) 10ml、丙酮酸鈉(sigma)0.llOOg、L-谷氨酰胺(sigma) 0.1461g、β _ 巰基乙醇(sigma) 3.8574g、l μ g/ml 的 EGF(PEPROTECH) 100 μ 1、10mM非必需氨基酸10ml、所述的10mM非必需氨基酸配方為L-丙氨酸(sigma) 1500mg/L> L-天門冬酰胺(sigma) 890mg/L、L-天冬氨酸(sigma) 1330mg/L>L-谷氨酸(sigma)1470mg/L、甘氨酸(sigma)750mg/L、L-脯氨酸(sigma)1150mg/L 和 L-絲氨酸(sigma) 1050mg/L,充分混勻后，調(diào)節(jié)PH值至7.2，0.22 μ m濾膜過濾除菌，4°C保存。
[0023]實(shí)施例2:人羊膜上皮細(xì)胞的分離及培養(yǎng)
[0024]首先取經(jīng)家屬同意的且HIV、甲肝、乙肝以及梅毒等血清學(xué)反應(yīng)顯示為陰性的剖宮產(chǎn)分娩產(chǎn)婦的新鮮胎盤一個(gè)，由0.4g的KC1、0.06g的ΚΗ2Ρ04、0.132g的Na2HPO4.12H20、8g的NaCl,0.35g的NaHCO3U.0g的D-葡萄糖、0.20g的鏈霉素、0.12g的青霉素用水定容為IL的方法制作而成基礎(chǔ)平衡鹽反復(fù)沖洗干凈，去除胎盤表面殘留的血液；從胎盤上分離羊膜，并將其放入基礎(chǔ)平衡鹽溶液中反復(fù)漂洗，并重復(fù)兩次；將干凈的羊膜組織剪碎，獲得直徑為Imm的羊膜組織塊；在剪碎的組織塊中加入30ml0.2%IV膠原酶(gibco，批號(hào):1177238),并置于37°C下孵育2小時(shí)；接著將混合了膠原酶的組織塊在200g下離心5分鐘，吸出膠原酶消化液；再加入15ml0.25%胰蛋白酶(sigma，批號(hào):110M7362V)/0.0296EDTA消化液，在37°C振蕩消化20分鐘后，用30ml實(shí)施例1所制備的培養(yǎng)基終止消化；將消化后的組織塊經(jīng)200目濾網(wǎng)過濾；將濾液在200g下離心5分鐘，棄上清，使用3ml實(shí)施例1所制備的培養(yǎng)基終重新懸浮細(xì)胞并細(xì)胞計(jì)數(shù)。按16?107cell/ml的細(xì)胞密度進(jìn)行接種，并置于5%C02、37°C培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)；48小時(shí)后換液，然后在5%C02、37°C培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)，等到細(xì)胞增生到90%融合后收集細(xì)胞并鑒定。
[0025]實(shí)施例3:
[0026]細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察:實(shí)施例2分離的原代羊膜上皮細(xì)胞培養(yǎng)24小時(shí)后大部分細(xì)胞貼壁，剛貼壁的細(xì)胞呈橢圓形，遮光性強(qiáng)，隨后細(xì)胞胞質(zhì)逐漸展開，折光性減弱。細(xì)胞貼壁3天后生長迅速，增殖明顯，細(xì)胞數(shù)量明顯增多，細(xì)胞進(jìn)入指數(shù)生長期，如圖1。5天左右形成單層，細(xì)胞融合成片，呈膜狀生長。細(xì)胞呈扁平不規(guī)程多角形，輪廓清晰，胞漿豐富，細(xì)胞呈圓形卵圓形，如圖2。傳代培養(yǎng)8小時(shí)左右細(xì)胞貼壁，3天即可形成良好的單層，如圖3。
[0027]實(shí)施例4:
[0028]用0.25%胰蛋白酶(sigma，批號(hào):110M7362V) /0.02%EDTA消化液消化貼壁的AECs，用無鈣鎂PBS洗2兩次后，取I X 16個(gè)/ml，加入FCM管中。加入待檢測(cè)的單克隆抗體SSSEA-4 (BD，批號(hào):23713)5 μ 1，4°C避光孵育30分鐘，每隔10分鐘搖晃一次，使細(xì)胞與抗體充分接觸。用PBS洗2次，并重懸在400 μ I的PBS中，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。圖4為流式結(jié)果圖。從圖中可以看出本次實(shí)驗(yàn)得到SSSEA-4陽性細(xì)胞達(dá)到了 84.42%，最終證實(shí)本發(fā)明的方法可以得到高純度的羊膜上皮細(xì)胞。
[0029]說明利用本發(fā)明的培養(yǎng)基培養(yǎng)原代人羊膜上皮細(xì)胞，通過多次傳代后，成功抑制了羊膜間質(zhì)細(xì)胞，獲得高純度的人羊膜上皮細(xì)胞。
[0030]在此說明書中，本發(fā)明已參照其特定的實(shí)施例作了描述，但是，很顯然仍可以做出修改和變換而不背離本發(fā)明的精神和范圍。因此，本發(fā)明的說明書和附圖被認(rèn)為是說明性的而非限制性的。
【權(quán)利要求】
1.一種用于培養(yǎng)人羊膜上皮細(xì)胞的培養(yǎng)基，其特征在于該培養(yǎng)基由DMEM、胎牛血清、丙酮酸鈉、L-谷氨酰胺、EGF、β -巰基乙醇和非必需氨基酸組成； 其中DMEM的含量為10g/1000ml ； 其中胎牛血清的體積含量為5?15% ； 其中丙酮酸鈉的含量為0.0550?0.2200g/1000ml ； 其中L-谷氨酰胺的含量為0.0731?0.2193g/1000ml ； 其中β -巰基乙醇的含量為1.9287?5.7861g/1000ml ； 其中EGF的含量為5?15ng/ml ； 其中非必需氨基酸為L-丙氨酸、L-天門冬酰胺、L-天冬氨酸L、L-谷氨酸、甘氨酸L、L-脯氨酸和L-絲氨酸中組成；非必需氨基酸的含量為0.5?2mM。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于培養(yǎng)人羊膜上皮細(xì)胞的培養(yǎng)基，其特征在于該培養(yǎng)基的PH值為7.0?7.4。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于培養(yǎng)人羊膜上皮細(xì)胞的培養(yǎng)基，其特征在于其中非必需氨基酸的組成為=L-丙氨酸1500mg/L、L-天門冬酰胺890mg/L、L-天冬氨酸1330mg/L、L-谷氨酸 1470mg/L、甘氨酸 750mg/L、L-脯氨酸 1150mg/L 和 L-絲氨酸 1050mg/L。
【文檔編號(hào)】C12N5/073GK104371970SQ201310355824
【公開日】2015年2月25日 申請(qǐng)日期:2013年8月15日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月15日
【發(fā)明者】劉洋, 吳明遠(yuǎn), 胡少青, 趙靜, 王翔, 葉萌, 張麗麗, 范星洲, 施潔琦 申請(qǐng)人:協(xié)和華東干細(xì)胞基因工程有限公司