一種高效重組表達(dá)透明質(zhì)酸酶的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種高效重組表達(dá)透明質(zhì)酸酶的方法，屬于基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明通過在重組透明質(zhì)酸酶基因N端添加一段編碼組氨酸的核苷酸序列，不僅簡化了透明質(zhì)酸酶的純化步驟，同時(shí)實(shí)現(xiàn)了重組透明質(zhì)酸酶的高活性分泌表達(dá)，活性達(dá)到了21333.33U/mL。本發(fā)明所構(gòu)建的重組畢赤酵母工程菌株，具有非常大的應(yīng)用前景。本發(fā)明所提出的提高透明質(zhì)酸酶高效表達(dá)制備的方法，進(jìn)一步降低了透明質(zhì)酸酶的生產(chǎn)成本，為工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。
【專利說明】一種高效重組表達(dá)透明質(zhì)酸酶的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種高效重組表達(dá)透明質(zhì)酸酶的方法，具體地是在透明質(zhì)酸酶基因N端添加一段寡聚核苷酸序列以顯著提高透明質(zhì)酸酶表達(dá)產(chǎn)量，屬于基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]透明質(zhì)酸酶(hyaluronidase, HAase)主要專一'丨生水解透明質(zhì)酸，廣泛存在于真核和原核生物中，在動物機(jī)體內(nèi)參與許多重要的生物學(xué)過程，例如細(xì)胞分裂、細(xì)胞間的連接、生殖細(xì)胞的活動、DNA的轉(zhuǎn)染、胚胎發(fā)育、受傷組織的修復(fù)，以及正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞增生，是一種重要的生理活性物質(zhì)。且于1928年被Duran Reynals首次發(fā)現(xiàn)并稱為“擴(kuò)散因子”，1940年被Chain和Duthie正式命名為透明質(zhì)酸酶。根據(jù)透明質(zhì)酸酶作用的底物特異性和催化機(jī)制，水蛭透明質(zhì)酸酶屬于透明質(zhì)酸3-糖基水解酶家族(EC3.2.1.36)，通過水解HA的β-1、3_糖苷鍵，生產(chǎn)以四糖分子HA且還原端帶有葡萄糖醛酸為主的產(chǎn)物。水蛭來源的透明質(zhì)酸酶對底物的專一性強(qiáng)，與其它來源的透明質(zhì)酸酶相比，它對硫酸軟骨素、4-硫酸軟骨素和6-硫酸軟骨素不具有活性，并且不具有轉(zhuǎn)糖苷活性，活性不受肝素影響。因此，水蛭透明質(zhì)酸酶用于臨床藥用更具醫(yī)療價(jià)值意義。1941年Hirst首次證實(shí)水蛭透明質(zhì)酸酶強(qiáng)有力的抗菌性。相關(guān)研究實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)透明質(zhì)酸酶對治療心肌梗塞效果顯著。透明質(zhì)酸酶在抗腫瘤方面也具有重要的作用，惡性組織經(jīng)透明質(zhì)酸酶處理后粘多糖含量增加，有利于腫瘤細(xì)胞結(jié)合更多的抗癌藥物。此外，透明質(zhì)酸酶在臨床上作為“藥物擴(kuò)散因子”、治療血栓、青光眼和其它藥用方面具有更大的應(yīng)用價(jià)值。
[0003]目前，水蛭來源的透明質(zhì)酸酶基因尚未有相關(guān)報(bào)道。當(dāng)前水蛭來源的透明質(zhì)酸酶是以活體水蛭組織提取為主獲得，且每個(gè)水蛭提取所獲得透明質(zhì)酸酶僅約為230U。本發(fā)明采用畢赤酵母重組生產(chǎn)透明質(zhì)酸酶具有無法比擬的優(yōu)勢，突破了水蛭原料來源的限制和提取分離步驟的繁瑣等因素的限制，能夠推動透明質(zhì)酸酶在醫(yī)療和科研上的廣泛應(yīng)用。
[0004]外源蛋白在宿主中的活性`表達(dá)與產(chǎn)量是構(gòu)建工程菌最重要的兩個(gè)指標(biāo)，本發(fā)明在已獲得水蛭透明質(zhì)酸酶在畢赤酵母中活性分泌表達(dá)的基礎(chǔ)上，通過人為在N端添加一段寡聚核苷酸序列，顯著提高了透明質(zhì)酸酶的表達(dá)產(chǎn)量。在N端添加的一段序列，對于mRNA的轉(zhuǎn)錄、穩(wěn)定性和后翻譯修飾，以及信號肽的后加工成熟分泌都有重要影響。而這些因素也顯著影響著外源蛋白在宿主菌中的正確折疊、后加工修飾和順利分泌。
[0005]鑒于此，本發(fā)明中構(gòu)建的新型重組工程菌顯著提高了重組透明質(zhì)酸酶的產(chǎn)量，該方法將有利于進(jìn)一步降低工業(yè)化生產(chǎn)水蛭透明質(zhì)酸酶的成本，更有利于水蛭透明質(zhì)酸酶的醫(yī)療藥用和科研范圍的擴(kuò)大。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明要解決的第一個(gè)技術(shù)問題是提供一種高效重組表達(dá)透明質(zhì)酸酶的方法，是在透明質(zhì)酸酶基因N端添加一段寡聚核苷酸序列，構(gòu)建透明質(zhì)酸酶產(chǎn)量顯著提高的基因工程菌。[0007]所述在透明質(zhì)酸酶基因N端添加的一段寡聚核苷酸序列，其核苷酸序列如(a)或(b)所示:
[0008](a)如SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列；
[0009](b)與(a)中的序列具有類似功能，添加至透明質(zhì)酸酶基因N端不引起翻譯移碼，能活性表達(dá)透明質(zhì)酸酶并提高重組透明質(zhì)酸酶表達(dá)量和/或酶活。
[0010]所述透明質(zhì)酸酶基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示；在其N端添加SEQ IDN0.1所述序列后所得重組透明質(zhì)酸酶基因的序列如SEQ ID N0.3所示。
[0011]具體地，是在透明質(zhì)酸酶基因HaseA3887 (SEQ ID N0.2)的N端添加一段核苷酸，構(gòu)建重組質(zhì)粒pPIC9K-His-HaseA3887，轉(zhuǎn)化畢赤酵母P.pastoris GSl 15進(jìn)行表達(dá)。包括以下步驟:基于透明質(zhì)酸酶基因HaseA3887，合成引物時(shí)，在上游引物BYA3887HF引入限制性酶切位點(diǎn)EcoRI和18個(gè)核苷酸(6Xhis-tag序列)，下游引物BYA3887R引入NotI酶切位點(diǎn)；構(gòu)建的重組質(zhì)粒pPIC9K-His-HaseA3887經(jīng)SalI線性化后電轉(zhuǎn)入P.pastoris GS115中并確認(rèn)HaseA3887基因重組P.pastoris GS115成功。
[0012]所述上游弓I 物 BYA3887HF: 5，-CCGGAATTCCACCACCACCACCACCACATGAAAGAGATCGCGGTGACAATAGAC-3’ ；下游引物 BYA3887R:5’ -TCCGCGGCCGCTTATTTTTTGCACGCTTCAACGTTAGC-3’。
[0013]本發(fā)明還提供了一種利用上述方法構(gòu)建得到的重組畢赤酵母發(fā)酵生產(chǎn)透明質(zhì)酸酶的方法,具體步驟如下:以含有重組透明質(zhì)酸酶基因的重組畢赤酵母P.pastoris GS115/pPIC9K-His-HaseA3887為生產(chǎn)菌株，將種子培養(yǎng)液按10%的接種量接種到25mL (搖瓶容量250mL) BMGY培養(yǎng)基中，溫度為30°C、pH為6.0培養(yǎng)至0D600為4，離心菌體接種到誘導(dǎo)表達(dá)培養(yǎng)基BMMY，每隔24h補(bǔ)加1% (v/v)甲醇，誘導(dǎo)表達(dá)96h。
[0014]本發(fā)明方案中還包括一種特異性純化重組表達(dá)的透明質(zhì)酸酶的方法，重組透明質(zhì)酸酶基因(SEQ ID N0.3)所編`碼的重組蛋白在N端形成6個(gè)連續(xù)的組氨酸標(biāo)簽，能與葡聚糖鎳特異性結(jié)合。采用葡聚糖鎳與發(fā)酵液混合孵育后，分別用0、10、20、30、40、50mM的咪唑洗脫雜質(zhì)，再以500mM的咪唑緩沖液特異性洗脫目標(biāo)蛋白，再進(jìn)行梯度透析獲得純透明質(zhì)酸酶蛋白。
[0015]本發(fā)明方案在透明質(zhì)酸基因上游添加一段核苷酸序列、構(gòu)建了高效表達(dá)重組透明質(zhì)酸基因的畢赤酵母菌，同時(shí)解決了透明質(zhì)酸酶基因高效表達(dá)及透明質(zhì)酸酶親和純化的問題。所得重組畢赤酵母菌P.pastoris GS115/pPIC9K-His-HaseA3887發(fā)酵上清酶活是對照重組菌P.pastoris GS115/pPIC9K_HaseA3887發(fā)酵上清酶活的5倍以上；所得酶通過特異性親和純化即可得到。本發(fā)明通過在透明質(zhì)酸基因上游添加一段核苷酸序列。本發(fā)明將有利于進(jìn)一步降低工業(yè)化生產(chǎn)水蛭透明質(zhì)酸酶的成本，更有利于水蛭透明質(zhì)酸酶的醫(yī)療藥用和科研范圍的擴(kuò)大，在工業(yè)上具有巨大的應(yīng)用價(jià)值。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0016]圖1所示為平板法檢測發(fā)酵上清液透明質(zhì)酸酶的活性(1，A3887HF重組透明質(zhì)酸酶發(fā)酵上清液水解HA反應(yīng)產(chǎn)生透明圈；2，pPIC9k-GS115對照發(fā)酵上清液作對照)。
[0017]圖2所示為搖瓶發(fā)酵產(chǎn)透明質(zhì)酸酶的粗酶液酶活力山對照重組菌株GS115/pPIC9K-HaseA3887 ;2，本發(fā)明重組菌株 GS115/pPIC9K-His_HaseA3887。
[0018]圖3所示為重組透明質(zhì)酸酶的蛋白SDS-PAGE電泳結(jié)果(M，蛋白marker ;1，GS115/pPIC9k菌株發(fā)酵液上清；2，對照重組菌株GS115/pPIC9K-HaseA388發(fā)酵液上清；3，重組GS115/pPIC9K-His-HaseA3887發(fā)酵液上清；4，NTA-Ni純化的重組透明質(zhì)酸酶蛋白)。
【具體實(shí)施方式】
[0019]材料與方法:
[0020]透明質(zhì)酸酶活力單位定義:在ρΗ5.5和38°C下，每小時(shí)從透明質(zhì)酸中釋放I μ g葡萄糖還原當(dāng)量的還原糖所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。
[0021]平板透明圈法檢測透明質(zhì)酸酶活性:透明質(zhì)酸為大分子聚多糖，在一定濃度的表面活性劑水溶液中沉淀析出，被水解的小分子量低聚HA不會被沉淀析出。利用這一原理可以快速簡便的鑒定透明質(zhì)酸酶活性。
[0022]DNS還原糖測定方法:水蛭透明質(zhì)酸酶水解HA，通過降解β -1,3-糖苷鍵，產(chǎn)生帶有還原端羥基的還原糖產(chǎn)物。通過DNS還原糖法測定水解HA產(chǎn)生的相對于葡萄糖還原當(dāng)量的還原糖產(chǎn)物的產(chǎn)生量，來計(jì)算酶比活力。
[0023]實(shí)施例1:含透明質(zhì)酸酶基因(HaseA3887)表達(dá)載體的構(gòu)建
[0024]全化學(xué)合成透明質(zhì)酸酶HaseA3887全長基因序列(SEQ ID N0.2)，以此為模版，設(shè)計(jì)表達(dá)引物，上游引物 BYA3887HF: CCGGAATTCCACCACCACCACCACCACATGAAAGAGATCGCGGTGACAATAGAC;下游引物 BYA3887R: TCCGCG GCCGCTTATTTTTTGCACGCTTCAACGTTAGC,在上下游引物分別引入限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)(本發(fā)明中所述表達(dá)載體為PPIC9K，根據(jù)此載體選取上游酶切位點(diǎn)為EcoRI，下游為Notl)。使用該對引物擴(kuò)增HaseA3887基因，對擴(kuò)增獲得的透明質(zhì)酸酶片段進(jìn)行EcoRI和NotI雙酶切，連接至具有相對應(yīng)切口的表達(dá)載體上(載體PPIC9K經(jīng)EcoR1、NotI雙酶切)，轉(zhuǎn)化至E.coil DH5 α中，在確保閱讀框正確的前提下鑒定出重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K-His-HaseA3887，經(jīng)DNA測序比對，重組序列正確。重組質(zhì)粒經(jīng)SalI線性化后電轉(zhuǎn)入表達(dá)宿主P.pastoris GSl 15中，重組克隆子經(jīng)PCR驗(yàn)證正確。
[0025]實(shí)施例2:重組畢赤酵母異源表達(dá)透明質(zhì)酸酶
[0026]重組P.pastoris GS115/pPIC9K-His_HaseA3887 克隆子進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)表達(dá)。單克隆接種于5ml的YPD培養(yǎng)基(酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L)，30°C、200rpm培養(yǎng)16h。按10%的接種量轉(zhuǎn)接于IOOml的誘導(dǎo)表達(dá)培養(yǎng)基BMGY (酵母提取物10g/L，蛋白胨 20g/L，3g/L K2HPO4,11.8g/L KH2PO4,10XYNB100ml/L(13.4g/L)，500X 生物素lmL(4X10_4g/L)，甘油IOmL), 30°C 200rpm培養(yǎng)至OD6tltl值為4之間。離心收集菌體，更換至IOOmL誘導(dǎo)表達(dá)培養(yǎng)基BMMY (酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，3g/L K2HPO4,11.8g/LKH2PO4,100XYNB100mL/L(13.4g/L)，500X 生物素 lmL(4X l(T4g/L)，甲醇 5mL)，30°C 200rpm培養(yǎng)，每24h向培養(yǎng)基中添加100%甲醇至終濃度為1.0% (v/v)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，誘導(dǎo)表達(dá)96h。發(fā)酵上清液經(jīng)SDS-PAGE蛋白電泳檢測，結(jié)果見附圖3中泳道3所示，與對照重組菌株(透明質(zhì)酸酶基因N端未添加SEQ ID N0.1所示序列，其余相同)表達(dá)量(泳道2)相比，具有一條比較明顯的目標(biāo)條帶。
[0027]實(shí)施例3:重組生產(chǎn)透明質(zhì)酸酶的活性檢測及搖瓶發(fā)酵上清液酶活測定
[0028]根據(jù)平板透明圈法檢測透明質(zhì)酸酶活性。配置緩沖液(50mM的檸檬酸/檸檬酸鈉ρΗ5.3，150mM 的 NaCl, 0.02%Na3N),量取 50ml 緩沖液，加入 1.5% 的瓊脂糖和 lmg/ml 的 HA,加熱融化后配置平板。將發(fā)酵上清液滴入孔徑內(nèi)部，平板置于37°C培養(yǎng)10h，在平板上覆蓋適量的10% (w/v)的氯化十六燒卩比唳(cetylpyridinium chloride)水溶液,約IOmin出現(xiàn)透明圈，結(jié)果如圖1所示，重組P.pastoris GS115/pPIC9K-His-HaseA3887發(fā)酵上清液(圖例I)形成直徑約2cm的透明圈，而對照(圖例2)未出現(xiàn)透明圈，說明該重組酶實(shí)現(xiàn)了活性表達(dá)。
[0029]采用3，5—二硝基水楊酸比色法測量水解透明質(zhì)酸產(chǎn)生的還原糖當(dāng)量。反應(yīng)體系為ImL,用pH5.5、50mM的朽1檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液配置2mg/mL的HA,反應(yīng)體系加入400μ L的HA溶液、IOOyL的發(fā)酵上清液酶液，緩沖液補(bǔ)足至ImL;對照組采用PPIC9K-GS115發(fā)酵上清液。在38°C反應(yīng)20min，立即沸水終止反應(yīng)，采用DNS法測定產(chǎn)生的還原糖當(dāng)量(相當(dāng)于等量葡萄糖的還原力)，計(jì)算發(fā)酵液產(chǎn)生的酶活單位數(shù)。結(jié)果如附圖2所示，本發(fā)明中的重組菌株(P.pastoris GS115/pPIC9K-His_HaseA3887)的發(fā)酵上清液酶活高達(dá)201333.33U/mL，是透明質(zhì)酸酶基因未經(jīng)修飾的對照重組菌株P(guān).pastoris GSl 15/pPIC9K-HaseA3887發(fā)酵上清液透明質(zhì)酸酶活的5倍多。
[0030]實(shí)施例4:重組透明質(zhì)酸酶的純化制備
[0031]在HaseA3887基因前端添加的一段寡聚核苷酸序列，能顯著提高透明質(zhì)酸酶的表達(dá)量，同時(shí)，經(jīng)轉(zhuǎn)錄翻譯后在透明質(zhì)酸酶N端融合了 6個(gè)連續(xù)組氨酸標(biāo)簽，根據(jù)親和層析原理，該標(biāo)簽?zāi)芴禺愋耘c葡聚糖鎳結(jié)合。葡聚糖鎳先用pH6.0、50mM的磷酸鹽緩沖液平衡30min,再加入經(jīng)過0.45 μ m過濾的發(fā)酵液，在4°C孵育2h，依次用相同緩沖液配置的O、10、20、30、40、50mM的咪唑緩沖液進(jìn)行洗脫雜質(zhì)。最后用500mM的咪唑緩沖液洗脫目標(biāo)蛋白。高濃度咪唑洗脫的目標(biāo)蛋白進(jìn)行過夜透析。獲得單一條帶的透明質(zhì)酸酶純蛋白，SDS-PAGE電泳結(jié)果如附圖3中泳道4所示。所`得透明質(zhì)酸酶純蛋白，經(jīng)測定，具有透明質(zhì)酸酶活力。
【權(quán)利要求】
1.一種高效重組表達(dá)透明質(zhì)酸酶的方法，是在透明質(zhì)酸酶基因N端添加一段核苷酸， 構(gòu)建基因工程菌進(jìn)行表達(dá)；所述添加的核苷酸序列為如下(a)或(b)所示的序列:(a)SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列，(b)與(a)中的序列具有類似功能，添加至透明質(zhì)酸酶基因N端不引起翻譯移碼，能活性表達(dá)透明質(zhì)酸酶并提高重組透明質(zhì)酸酶表達(dá)量和/或酶活。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，是在SEQID N0.2所示的透明質(zhì)酸酶基因的N端添加一段SEQ ID N0.1所示的核苷酸，構(gòu)建重組質(zhì)粒pPIC9K-His-HaseA3887，轉(zhuǎn)化畢赤酵母P.pastoris GS115進(jìn)行表達(dá)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法獲得的重組載體。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組載體，其特征在于，優(yōu)選含有重組透明質(zhì)酸酶基因的 PPIC9K。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法獲得的基因工程菌。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的基因工程菌，其特征在于，優(yōu)選含有重組透明質(zhì)酸酶基因的畢赤酵母 P.pastoris GS115。
7.應(yīng)用權(quán)利要求6所述基因工程菌高效表達(dá)透明質(zhì)酸酶的方法，其特征在于將種子培養(yǎng)液按10%的接種量接種到含25mL BMGY培養(yǎng)基的容量為250mL的搖瓶中，溫度為30°C、 pH為6.0培養(yǎng)至0D_為4，離心收集菌體接種至誘導(dǎo)表達(dá)培養(yǎng)基BMMY，每隔24h補(bǔ)加1%甲醇，誘導(dǎo)表達(dá)96h;將發(fā)酵液經(jīng)親和層析純化得到透明質(zhì)酸酶蛋白。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，透明質(zhì)酸酶的純化條件為:采用葡聚糖鎳進(jìn)行親和層析純化透明質(zhì)酸酶蛋白，分別用0、10、20、30、40、50mM的咪唑洗脫雜質(zhì)，再以 500mM的咪唑緩沖液特異性洗脫目標(biāo)蛋白，再進(jìn)行梯度透析獲得純透明質(zhì)酸酶 蛋白。
【文檔編號】C12N15/81GK103436508SQ201310358573
【公開日】2013年12月11日 申請日期:2013年8月15日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月15日
【發(fā)明者】陳堅(jiān), 堵國成, 康振, 金鵬 申請人:江南大學(xué)