含有遺傳毒性生物傳感器的酵母單基因缺失文庫的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種含有遺傳毒性生物傳感器的酵母單基因缺失文庫，涉及經(jīng)過遺傳基因改造的微生物對遺傳毒性致癌物的檢測。結(jié)合流式細胞儀分選技術(shù)、深度測序技術(shù)建立一種高通量篩選遺傳毒性相關(guān)易感基因的方法。本發(fā)明的優(yōu)點在于，可以檢測遺傳毒性化合物，且高通量，針對性強，操作簡便。這種以遺傳毒性檢測靈敏度檢測為基礎(chǔ)的篩選與遺傳毒性效應相關(guān)的易感基因群的文庫，其應用前景：一方面可作為分子工具研究這類影響檢測系統(tǒng)靈敏的基因的遺傳表達與外源遺傳毒性化合物的暴露間的相互作用關(guān)系，另一方面可通過生物信息學分析，可將酵母的遺傳毒性相關(guān)易感基因與人類的癌癥易感基因建立關(guān)聯(lián)，為提高環(huán)境健康風險評價水平提供新方法。
【專利說明】含有遺傳毒性生物傳感器的酵母單基因缺失文庫
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物技術(shù)，尤其涉及經(jīng)過遺傳基因改造的微生物對遺傳毒性化合物的檢測。
【背景技術(shù)】[0002]釀酒酵母是一種簡單真核生物，單細胞，遺傳改造操作簡單，培養(yǎng)簡便快速且環(huán)境友好，適合作為一種模式生物應用于生命科學研究。1996年釀酒酵母全基因組序列分析作為第一個真核生物全基因組序列信息被公布，約有5800個基因序列信息被獲得而其中大約有23%基因與人類同源，因此釀酒酵母作為一種簡單的模式生物因其已知的全基因組序列信息可為深入研究真核生物乃至高等生物生命機制提供基礎(chǔ)。
[0003]基于已知的釀酒酵母全基因組序列，斯坦福大學研究人員為主的多個實驗室構(gòu)建得到釀酒酵母單基因缺失株文庫(Saccharomyces Genome Deletion Project) (Giaeveret al., Functional profiling of the Saccharomyces cerevisiaegenome，2002，Nature418(6896):387-391.)，該文庫以野生型釀酒酵母菌株作為背景菌株，利用以PCR為基礎(chǔ)的基因敲除策略(PCR-based gene deletion strategy),根據(jù)基因同源重組原理逐個對釀酒酵母基因組中的每一個基因進行敲除，最后共得到5396個分別單基因敲除的突變株。由PCR介導的基因敲除策略，即將酵母基因組中每個基因的開放閱讀框(ORF)被卡那霉素抗性基因(KanMX)同源重組置換，并利用G418抗性對基因敲除菌進行篩選。PCR擴增KanMX基因所用到的引物由四部分組成，其中包括(I)酵母目的基因ORF片段前ISbp同源序列；
(2)18bp通用引物U1、D1 ;(3)—段20bp長度的僅標示、鑒定目的缺失基因的特異條形碼序列(barcoding sequence),即每一個酵母基因都對應一條特異性條形碼序列；(4) 18bp與KanMX基因同源的序列。
[0004]目前該文庫的應用主要是建立一種合成致死篩選微陣列(Syntheticgenetic array, SGA)方法即通過檢測細胞生長速率和致死性來研究酵母中基因功倉泛及分子機制(Baryshnikova et al, Synthetic Genetic Array (SGA) Analysis inSaccharomyces Cerevisiae and Schizosaccharomyces Pombe, 2010, Meth ods inEnzymology, Vol470: Guide to Yeast Genetics: 470:145-179.)并應用于一些化合物毒性的分析。而Boone等人利用SGA手段已繪制了釀酒酵母全基因組范圍內(nèi)的雙基因缺失遺傳相互作用圖譜(Boone et al., The genetic landscape of a cell, 2010, FebsJournal277:7-8.)，其中可定量分析基因間相互作用的基因占全基因組的75%，為釀酒酵母遺傳相互作用的研究提供了一個高通量、覆蓋面全、意義重大的有力工具。但是這種以致死性為檢測指標的分析，限制了對一些化合物的非致死性生物毒性的檢測和分析，比如一些遺傳毒性化合物，它們可能不會致死，但具有DNA損傷效應。如果將DNA損傷響應的生物傳感器轉(zhuǎn)入到酵母單基因缺失文庫中，將會擴展文庫的應用范圍，開展高通量、特異性遺傳毒性化合物易感基因群的篩選。
[0005]基于酵母DNA損傷響應的生物傳感器是一種用于檢測環(huán)境遺傳毒性化合物的檢測系統(tǒng)，該類型生物傳感器的構(gòu)建需具備以下兩個基本元件:感應元件和連接于此后的效應元件。前者利用其自身功能可對DNA損傷進行響應，并開啟后者的表達，從而產(chǎn)生可檢測出的信號?；诮湍窪NA損傷響應的生物傳感器RNR3-yEGFP (專利申請?zhí)?01210269407.5)、酵母靈敏型遺傳毒性致癌物檢測系統(tǒng)HUGl-yEGFP (專利申請?zhí)?01210263302.9)即分別利用RNR3、HUG1兩種基于DNA損傷轉(zhuǎn)錄應答的基因啟動子作為生物傳感器的感應元件，yEGFP酵母增強型綠色熒光蛋白作為效應元件構(gòu)建而成，這兩種生物傳感器可檢測多種遺傳毒性致癌物，可應用于高通量的遺傳毒性致癌物環(huán)境實時現(xiàn)場監(jiān)測。
[0006]將酵母DNA損傷響應的生物傳感器轉(zhuǎn)入酵母單基因缺失文庫已具備成熟的方法。由于釀酒酵母單倍體結(jié)合型可分為MATa和MATa兩種，這兩種結(jié)合型的酵母單倍體可進行雜交，雜交后的雙倍體釀酒酵母細胞通過有絲分裂產(chǎn)生四個子囊孢子，再通過一系列抗性、營養(yǎng)型標簽篩選可將外源質(zhì)粒、細胞轉(zhuǎn)入酵母單基因缺失文庫中形成新的分子功能(具體轉(zhuǎn)化構(gòu)建方法見 Kainth et al., Comprehensive genetic analysis oftranscription factor pathways using a dual reporter gene system in buddingyeast.Methods, 2009, 48:258 - 264)，因此可利用該技術(shù)手段對現(xiàn)有的酵母單基因缺失文庫進行遺傳改造。
[0007]含有綠色熒光報告基因的生物傳感器酵母可以用流式細胞儀進行檢測和分選。流式細胞儀(Flow Cytometer)是一種在功能水平上對單細胞或其他生物粒子進行定量分析和分選的檢測技術(shù)手段，可以高速分析大量細胞，并能同時從一個細胞中測得多個參數(shù)，其應用范圍非常廣泛。其中細胞分選功能是流式細胞儀的重要應用之一，即含有熒光標記或染色的樣品細胞懸液上機后，在高壓作用下被儀器流動室中的鞘液所包裹，并有序排列，在超聲振蕩器的作用下含有樣品細胞的液流被振蕩成為一個個包裹細胞的小液滴，根據(jù)熒光強度信號的選擇，儀器賦予所需分選的細胞一定正或負電荷，待測細胞就分散在這些液滴之中。將這些液滴充以正、負不同的電荷，而不被選定的細胞液滴則不帶電。帶有正電或負電的液滴通過高壓偏轉(zhuǎn)板時發(fā)生不同角度偏轉(zhuǎn)后，達到了分離細胞的目的；它能夠根據(jù)每個細胞的光散射和熒光特性`，將特定的細胞從細胞群體中分選出來，因此流式細胞技術(shù)是分析細胞特性的一個應用手段。
[0008]具有不同熒光強度的酵母細胞意味著所具有的缺失基因?qū)Ρ┞兜倪z傳毒性化合物的響應靈敏度不同，通過對其所具有的缺失基因的特異條形碼序列的測定，就可以鑒定缺失基因的種類。DNA測序開始于上世紀70年代，第一代DNA測序技術(shù)以末端終止法為核心，又稱之為化學測序法(Sanger法)，成型于上世紀80年代。近年來，出現(xiàn)了一種新的DNA測序方法一循環(huán)芯片測序法(cyclic-array sequencing),也可將其稱為“新一代測序技術(shù)或者第二代測序技術(shù)”或“深度測序技術(shù)”。深度測序技術(shù)的核心思想就是邊合成(或者連接)邊測序；生成新DNA互補鏈時，要么加入的dNTP通過酶促級聯(lián)反應催化底物激發(fā)出熒光，要么直接加入被熒光標記的dNTP或者半簡并引物，在合成或連接生成互補鏈時，釋放出熒光信號。通過捕獲光信號并轉(zhuǎn)化為一個測序峰值，獲得互補鏈序列信息。這一技術(shù)不斷得到創(chuàng)新和改良，在保證基因組測序足夠精確的前提下，操作程序的優(yōu)化，測序通量急速增加，是傳統(tǒng)Sanger法的幾百到幾千倍，測試的成本也呈現(xiàn)直線下降的趨勢，只為原有技術(shù)的幾十分之一。目前，深度測序技術(shù)已經(jīng)在基因組學、轉(zhuǎn)錄組學、表觀遺傳學和環(huán)境基因組學中得到了極大的應用。
[0009]那些具有高熒光強度的酵母單基因缺失株的缺失基因可能與易感基因相關(guān)。易感基因主要是指和某種特定疾病的發(fā)生和發(fā)展具有關(guān)聯(lián)的基因或多個基因，即在分子水平上發(fā)現(xiàn)某種疾病的發(fā)生與一些基因的表達差異水平存在這相互關(guān)聯(lián)性(Tainsky et al., Genomic and proteomic biomarkers for cancer:Amultitude of opportunities,2009,Biochimica Et Biophysica Acta-Reviews onCancerl796 (2):176-193.)，易感基因這個概念同時也應用在遺傳毒理等領(lǐng)域中，意指某基因突變會導致細胞對遺傳毒性化合物響應靈敏度的改變。。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]本發(fā)明的目的是，提供一種含有遺傳毒性生物傳感器的酵母單基因缺失文庫，該文庫分別將基于酵母DNA損傷響應的生物傳感器RNR3-yEGFP、酵母靈敏型遺傳毒性致癌物檢測系統(tǒng)HUGl-yEGFP通過高通量酵母單倍體結(jié)合型雜交篩選方法轉(zhuǎn)入進酵母單基因缺失文庫中。該文庫可應用于環(huán)境中遺傳毒性化合物的檢測，同時結(jié)合流式細胞儀分選技術(shù)以及深度測序技術(shù)可用于篩選、分析影響于遺傳毒性效應相關(guān)的酵母易感基因群。本發(fā)明高通量、低成本、操作簡單，并可作為分子工具進一步研究基因突變與環(huán)境危險因子評估預測的相互作用關(guān)系。
[0011]為了達到上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:
[0012](一 )含有遺傳毒性生物傳感器的酵母單基因缺失文庫的構(gòu)建；
[0013]用高通量酵母單倍體結(jié)合型雜交篩選方法(Kainth et al., Comprehensivegenetic analysis of transcription factor pathways using a dual reporter genesystem in budding yeast.Methods，2009，48:258 - 264)分別將基于酵母 DNA 損傷響應的生物傳感器RNR3-yEGFP (專利申請?zhí)?01210269407.5)、酵母靈敏型遺傳毒性致癌物檢測系統(tǒng)HUGl-yEGFP (專利申請?zhí)?01210263302.9)轉(zhuǎn)入釀酒酵母單某因缺失t庫(httD://www-seauence.stanford.edu/group/yeast deletion pro iect/deleti ons3.html)中，獲得兩個分別含有RNR3-yEGFP和HUGl-yEGFP遺傳毒性生物傳感器的酵母單基因缺失文庫。
[0014]( 二)含有遺傳毒性生物傳感器的酵母單基因缺失文庫的應用；
[0015]1、酵母單基因缺失遺傳毒性檢測系統(tǒng)文庫暴露于遺傳毒性化合物methylmethanesulphonate (MMS)中；
[0016]從上述(一)中獲取文庫后，我們將文庫進行刮板，混合克隆?；旌虾蟮奈膸旖湍妇暝谶x擇性培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，3(TC，200rpm;次日對菌液進行稀釋至0D600=0.1，加入濃度劑量為0.01%的MMS，誘導8小時，隨后收集細胞用PBS調(diào)整細胞濃度至0D600=0.2，加入PI進行染色，避光，4 °C保存直至流式細胞儀分選。
[0017]2、利用流式細胞儀分選技術(shù)對文庫酵母菌株進行分選；
[0018]將上述2.1中MMS暴露下的文庫酵母菌株利用流式細胞儀進行檢測,根據(jù)流式細胞儀上FITC參數(shù)中所反饋的熒光信號按低中高三類熒光強度對文庫酵母菌株進行分選，收集。每次分選收集到1O6-1O7個細胞。
[0019]3、分選后酵母菌株細胞基因組的提取及標記單基因缺失的條形碼序列的擴增；
[0020]利用Omega酵母基因組提取試劑盒進行分離后酵母菌株細胞基因組的提取，獲得不同熒光強度下分離后酵母菌株細胞的基因組復合物。由于釀酒酵母單基因缺失突變體文庫基因信息已經(jīng)獲得，我們從 http://www-sequence.Stanford, edu/group/yeast_deletion_project/deletions 3.html中獲得標記各單基因缺失突變株的條形碼序列(barcode sequence)信息,從Ul和kanMX4間分別設(shè)計擴增條形碼序列TAGl的上下游引物，擴增含TAGl在內(nèi)約IOObp長度的片度。PCR反應條件為預變性94°C 3min;94°C 15sec,57°C 15sec，72°C 60sec 共 25 個循環(huán)，最后 72°C 3min 終延伸。[0021]4、利用深度測序手段對標記各單基因缺失突變株的條形碼序列的測序、鑒定；
[0022]采用高通量的Illumina測序技術(shù)對不同熒光強度樣品含有的條形碼序列(TAGl)的DNA進行雙末端(paired-end)測序。根據(jù)建庫的信息，我們得到了上述六個樣品含有TAGl的序列。我們用已知的TAGl序列與所得到的序列做比對，只有測序所得TAGl序列與已知TAGl的序列完全匹配時，認為測序所得結(jié)果為陽性。
[0023]使用相對豐度(relativefitness, RF)和突光細胞百分比(percentage of cellwith fluorescence, PCF)兩個參數(shù)對所得到的某特異條形碼序列進行定量分析。定義如下:
[0024]整體相對豐度RF= (NH+NM+NL) /NA*100 ；
[0025]高熒光相對豐度RFH=NH/NA*100 ；
[0026]中熒光相對豐度RFM=NM/NA*100 ;
[0027]低熒光相對豐度RFL=NL/NA*100 ；
[0028]整體熒光細胞百分比PCF= (NH+NM)/(NH+NM+NL)；
[0029]高熒光細胞百分比PCFH=NH/(NH+NM+NL)；
[0030]中熒光細胞百分比PCFM=NM/(NH+NM+NL)；
[0031 ] 其中NA為測序所得含有TAGI序列的總數(shù)目；而NH，匪，NL分別是在高(H)、中(M)、低(L)不同熒光強度樣品所得到的某特異條形碼的數(shù)目。
[0032]相關(guān)基因名稱，基因序列，基因功能注釋等犾取于Saccharomyces GENOMEDATABASE http://www.yeastgenome.0rg。
[0033]通過上述參數(shù)對所得到的某特異條形碼序列進行定量分析后，在全酵母基因組中篩選得到一類影響影響與遺傳毒性效應相關(guān)的酵母易感基因群。
[0034]本發(fā)明的優(yōu)點與效果:
[0035]通過構(gòu)建含有RNR3_yEGFP或HUGl-yEGFP遺傳毒性生物傳感器的酵母單基因缺失文庫，結(jié)合流式細胞儀分選技術(shù)、深度測序技術(shù)分析影響遺傳毒性效應的易感基因群。本發(fā)明的優(yōu)點在于，可以篩選與遺傳毒性相關(guān)的易感基因群，且高通量，針對性強，操作簡便。這種以遺傳毒性響應靈敏度檢測為基礎(chǔ)的篩選遺傳毒性效應相關(guān)易感基因群的文庫，其應用前景:一方面可作為分子工具研究這類影響檢測系統(tǒng)靈敏的基因的遺傳表達與外源遺傳毒性化合物的暴露間的相互作用關(guān)系，建立特征性遺傳毒性化合物的易感基因圖譜，應用于環(huán)境風險因素的評價，另一方面可通過生物信息學的分析和數(shù)據(jù)挖掘，將酵母的遺傳毒性相關(guān)易感基因與人類的癌癥易感基因建立關(guān)聯(lián)，為提高環(huán)境污染早期預警和健康風險評價水平提供新方法體系和科學依據(jù)。
【專利附圖】

【附圖說明】[0036]圖1、含有生物傳感器的酵母單基因缺失文庫。
[0037]一個含有生物傳感器的酵母單基因缺失文庫包括4個1536位點的平板，圖1A為含有HUGl-yEGFP遺傳毒性生物傳感器的酵母單基因缺失文庫4-1板；圖1B為含有RNR3-yEGFP遺傳毒性生物傳感器的酵母單基因缺失文庫4_2板。
[0038]圖2、利用流式細胞儀分選技術(shù)，按照熒光信號強度的不同將MMS暴露下酵母單基因缺失遺傳檢測文庫中的細胞進行分選。
[0039]含有HUGl-yEGFP生物傳感器的酵母單基因缺失文庫在MMS暴露下yEGFP的誘導表達情況；(A-C)為陰性對照試驗，即無麗S的暴露，其中(A)為細胞散點圖；(B)為PI染色鑒定文庫細胞的存活率，P2為活細胞群；(C) FITC通道下對yEGFP熒光信號的檢測，P3為yEGFP誘導表達陰性細胞群；(D-F)為0.01%MMS暴露8小時，其中(D)為細胞散點圖；(E)為PI染色鑒定文庫細胞的存活率，P2為活細胞群；(F) FITC通道下對yEGFP熒光信號的檢測，P3為yEGFP誘導表達陰性細胞群、P4為yEGFP誘導表達中等熒光強度細胞群、P5為yEGFP誘導表達高等熒光強度細胞群；
[0040]圖3、分別含有基于酵母DNA損傷響應的生物傳感器RNR3_yEGFP、酵母靈敏型遺傳毒性致癌物檢測系統(tǒng)HUGl-yEGFP的酵母單基因缺失文庫按不同熒光強度分選所得樣品中不同基因缺失細胞菌株相對豐度的聚類分析。
【具體實施方式】:
[0041]含有遺傳毒性生物傳感器的酵母單基因缺失文庫的構(gòu)建方法，該方法包含下列步驟:
[0042]a、將分別含有RNR3_yEGFP或HUGl-yEGFP遺傳毒性生物傳感器的BY4347野生型酵母細胞過夜培養(yǎng)的 菌液在SD-Lue長形固體培養(yǎng)平板中涂布，菌液盡量要濃，涂布一定要均均勻，放入30°C培養(yǎng)箱生長2天；
[0043]其中:SD_Lue平板的制備方法:稱取1.7g酵母氮源無氨基酸無硫酸銨(YNB,YeastNitrogenBaseff/O Aminoacids and ff/0 Ammonium sulfate)，5g 硫酸銨(Ammoniumsulfate), 0.69g缺亮氨酸的氨基酸混合物(amino acid drop out mix)溶于雙蒸水中，定容至0.95L，再加入20g瓊脂粉。高壓蒸汽滅菌后，加入已減壓滅菌好的40%葡萄糖(glucose)至其終濃度為2% ；
[0044]b、利用克隆復制儀(RoToR colony replicator)以及1536位點針板分別將含有 YCplaclll-HUGl-yEGFP 和 YCplaclll_RNR3_yEGFP 重組質(zhì)粒的 BY4347 菌復制在新鮮的SD-Lue固體平板上，30°C培養(yǎng)I天，形成1536個重組菌克??；
[0045]C、由于5000多個單基因缺失酵母突變株保存在4個1536位點的固體平板上，每個位點上即是一個特異的單基因缺失突變株。利用克隆復制儀將單基因酵母突變菌株、含有遺傳毒性檢測系統(tǒng)的BY4347菌株克隆分別按先后復制在一個新的YAPD固體平板上進行雜交(mating), 30°C培養(yǎng)I天；
[0046]其中:YAPD平板的制備方法:稱取20g蛋白胨(Peptone), IOg酵母浸粉(Yeastextract), 120mg腺嘌呤(adenine)溶于雙蒸水中，定容至0.95L,再加入20g瓊脂粉。高壓蒸氣滅菌后，加入已減壓滅菌好的40%葡萄糖(glucose)至其終濃度為2% ；
[0047]d、將雜交后酵母細胞復制到含有G418抗性的SD-Lue營養(yǎng)缺陷固體平板上，進行雙倍體篩選，30°C培養(yǎng)2天；
[0048]其中:SD_Lue+G418平板的制備方法:稱取1.7g酵母氮源無氨基酸無硫酸銨(YNB, Yeast Nitrogen Base ff/0 Aminoacids and ff/0 Ammonium sulfate)，5g 硫酸銨(Ammonium sulfate),0.69g缺亮氨酸的氨基酸混合物(amino acid drop out mix)溶于雙蒸水中，定容至0.95L，再加入20g瓊脂粉。高壓蒸汽滅菌后，加入已減壓滅菌好的40%葡萄糖(glucose)至其終濃度為2%，待培養(yǎng)基溫度降至50-60°C加入過濾滅菌的G418溶液至終濃度為200暈克/毫升；
[0049]e、重復步驟Id的抗性、營養(yǎng)型篩選，即再次將菌株復制在新鮮的含有G418抗性的SD-Lue 營養(yǎng)缺陷固體平板上，富集含有 YCplaclll-HUGl-yEGFP 和 YCplaclIl_RNR3_yEGFP的雜合單基因缺失突變菌株，30°C培養(yǎng)I天；
[0050]f、將步驟Ie篩選培養(yǎng)的雙倍體突變菌株復制在出孢培養(yǎng)基中，潮濕環(huán)境中22°C培養(yǎng)5天；
[0051]其中出孢培養(yǎng)基的配制方法:稱取20g瓊脂糖溶于雙蒸水中，定容至0.95L，高壓蒸汽滅菌后加入50mL已過濾滅菌的溶解了 3g醋酸鉀的溶液以及ImL已過濾滅菌的20%棉子糖(raffinose)儲液；
[0052]g、在含有 canavanine, S-AEC, G418 篩選抗性的 SD-Leu-Arg-His-Lys 營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基中篩選還有ΜΑΤ α結(jié)合型的單倍體突變菌株，30°C培養(yǎng)3天；
[0053]其中SD-Leu-Arg-His-Lys+canavanine+S_AEC+G418 平板的制備方法:稱取
1.酵母氣源無氛基酸無硫酸按(YNB, Yeast Nitrogen Base ff/0 Aminoacids and ff/0 Ammonium sulfate)，Ig谷氨酸單鈉(MSG)，1.6g缺亮氨酸、賴氨酸、精氨酸和組氨酸的氨基酸混合物溶于雙蒸水中，`定容至0.95L，再加入20g瓊脂粉。高壓蒸汽滅菌后，加入已減壓滅菌好的40%葡萄糖(glucose)至其終濃度為2%，待培養(yǎng)基溫度降至50_60°C加入canavanine溶液至終濃度為50毫克/毫升，S-AEC溶液至終濃度為50毫克/毫升及G418溶液至終濃度為200暈克/毫升；
[0054]h、在含有 canavanine, S-AEC, G418, hygromycin B 篩選抗性的SD-Leu-Arg-His-Lys營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基中再次篩選ΜΑΤ α結(jié)合型的單倍體突變菌株，30°C培養(yǎng)2天；
[0055]其中SD-Leu-Arg-His-Lys+canavanine+S_AEC+G418+hygromycin B 平板的制備方法:稱取L 7g酵母氮源無氨基酸無硫酸銨(YNB, Yeast Nitrogen Base ff/0 Aminoacidsand ff/0 Ammonium sulfate)，lgMSG, 1.6g缺亮氨酸、賴氨酸、精氨酸和組氨酸的氨基酸混合物溶于雙蒸水中，定容至0.95L，再加入20g瓊脂粉。高壓蒸汽滅菌后，加入已減壓滅菌好的40%葡萄糖(glucose)至其終濃度為2%，待培養(yǎng)基溫度降至50_60°C加入canavanine溶液至終濃度為50毫克/毫升，S-AEC溶液至終濃度為50毫克/毫升，G418溶液至終濃度為200毫克/毫升及hygromycin B溶液至終濃度為300毫克/毫升；
[0056]1、重復步驟lh，繼續(xù)30°C培養(yǎng)2天。這一步的目的是為了繼續(xù)富集最終得到的含有遺傳毒性檢測系統(tǒng)的單倍體單基因缺失突變株文庫。
[0057]含有遺傳毒性生物傳感器的酵母單基因缺失文庫的應用包含下列步驟:
[0058]a、利用涂布棒，加入 SD-Leu-Arg-His-Lys+canavanine+S_AEC+G418 培養(yǎng)基將上述含有遺傳毒性生物傳感器的酵母單基因缺失文庫中的所有克隆進行刮板，混合；[0059]b、取刮板后的酵母單基因缺失遺傳毒性檢測文庫中的所有克隆混合液，接種于SD-Leu-Arg-His-Lys+canavanine+S-AEC+G418 培養(yǎng)基中稀釋至細胞密度 0D600 為 0.5，在30200轉(zhuǎn)/分鐘的條件下，振蕩培養(yǎng)12小時，得到酵母單基因缺失遺傳毒性檢測文庫克隆混合液；
[0060]C、將12小時培養(yǎng)后的酵母菌液用新鮮的YPD選擇性培養(yǎng)液稀釋到細胞密度0D_為0.1，加入遺傳毒性化合物MMS，培養(yǎng)8小時；
[0061]d、取出經(jīng)麗S受試培養(yǎng)8小時后的酵母單基因缺失遺傳毒性檢測文庫克隆混合液，4000轉(zhuǎn)/分鐘離心2分鐘，棄上清；加入新鮮PBS溶液，懸浮沉淀物；再次4000轉(zhuǎn)/分鐘離心2分鐘，棄上清；重新加入新鮮PBS，至細胞密度OD6tltl為0.2 ;
[0062]e、加入終濃度為I毫克每毫升的溴化丙啶(PI)溶液3微升，混勻，置于冰上，黑暗保存直至使用流式細胞儀進行分選。
[0063]f、利用流式細胞儀對樣品進行檢測。同時設(shè)定FITC及PE兩激光通道，微調(diào)電壓，如FITC熒光信號直方圖所示，將低、中、高三種熒光強度信號門中細胞進行分選，分別分選到約IO7個細胞；
[0064]g、從分選后酵母菌株細胞中中提取基因組DNA (具體提取方法參照Omega酵母基因組提取試劑盒說明)；
[0065]h、擴增標記單基因缺失的條形碼序列；
[0066]利用PCR技術(shù)，以4a中提取的分選后酵母菌株細胞中中提取基因組DNA作為擴增模板，通過上游引物 Ul: GAT GTC CAC GAG GTC TCT 和下游引物 Dl: GCG CGC CTT AAT TAACCC GG，將一段約93bp的DNA片段擴增出來，其中包含標記單基因缺失的條形碼序列；
[0067]其中:PCR的條件`為-MV 3分鐘-MV 15秒，55°C 15秒，72°C I分鐘，30個循環(huán)；72 0C 3分鐘；
[0068]1、采用高通量的Illumina測序技術(shù)對不同熒光強度樣品中的標記單基因缺失的條形碼序列(TAGl)的DNA進行雙末端(paired-end)測序；
[0069]j、得到不同熒光強度樣品中標記單基因缺失的條形碼序列信息后，利用已知的TAGl序列與所得到的序列做比對，當測序所得TAGl序列與已知TAGl的序列完全匹配時，即認為測序所得結(jié)果為標記單基因缺失的條形碼序列；
[0070]k、采用相對豐度(relative fitness, RF)和突光細胞百分比(percentage ofcell with fluorescence,PCF)兩個參數(shù)對所得到的某特異條形碼序列進行定量分析。定義如下:
[0071 ]整體相對豐度 RF= (NH+NM+NL) /NA*100 ；
[0072]高熒光相對豐度RFH=NH/NA*100 ；
[0073]中熒光相對豐度RFM=NM/NA*100 ;
[0074]低熒光相對豐度RFL=NL/NA*100 ；
[0075]整體熒光細胞百分比PCF= (NH+NM)/(NH+NM+NL)；
[0076]高熒光細胞百分比PCFH=NH/(NH+NM+NL)；
[0077]中熒光細胞百分比PCFM=NM/(NH+NM+NL)；
[0078]其中NA為測序所得含有TAGl序列的總數(shù)目；而NH，NM，NL分別是在不同熒光強度樣品所得到的某特異條形碼的數(shù)目。
【權(quán)利要求】
1.含有遺傳毒性生物傳感器的酵母單基因缺失文庫，其特征在于，該文庫用高通量酵母單倍體結(jié)合型雜交篩選方法分別將基于酵母DNA損傷響應的生物傳感器和酵母靈敏型遺傳毒性致癌物檢測系統(tǒng)轉(zhuǎn)入釀酒酵母單基因缺失文庫中，獲得兩個分別含有RNR3-yEGFP和HU GhyEGFP遺傳毒性生物傳感器的酵母單基因缺失文庫。
【文檔編號】C12Q1/02GK103510161SQ201310360655
【公開日】2014年1月15日 申請日期:2013年8月16日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月16日
【發(fā)明者】戴和平, 蕭偉, 魏婷, 湯花梅, 張超, 許鑫, 袁麗, 張曉華 申請人:中國科學院水生生物研究所