抗三種有機(jī)磷農(nóng)藥的單克隆抗體及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及抗三種有機(jī)磷農(nóng)藥的單克隆抗體及其應(yīng)用。本發(fā)明通過化學(xué)合成針對上述農(nóng)藥公共結(jié)構(gòu)的人工半抗原，進(jìn)而制備完全抗原，免疫Balb/C鼠，通過雜交瘤技術(shù)制備特異性強(qiáng)的單克隆抗體，并用于農(nóng)產(chǎn)品和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)環(huán)境中上述三種農(nóng)藥殘留的高靈敏快速檢測。本發(fā)明抗體的制備技術(shù)可行，抗原的整個制備過程不需要特別的儀器設(shè)備，易于規(guī)?；a(chǎn)。
【專利說明】抗三種有機(jī)磷農(nóng)藥的單克隆抗體及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及抗三種有機(jī)磷農(nóng)藥的單克隆抗體及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]近20年來，隨著農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的急速發(fā)展，有機(jī)磷農(nóng)藥的產(chǎn)量和使用量不斷上升。大量使用，甚至不正當(dāng)使用有機(jī)磷農(nóng)藥，使得有機(jī)磷農(nóng)藥殘留問題日益突出。這不僅使環(huán)境安全，人們身體健康受有機(jī)磷農(nóng)藥威脅的概率增大，而且農(nóng)藥最高殘留限量也成為世界各國針對中國農(nóng)產(chǎn)品進(jìn)出口的重要技術(shù)性貿(mào)易壁壘。因此，發(fā)展有機(jī)磷農(nóng)藥殘留快速、簡便、靈敏的檢測方法對環(huán)境、食品安全，人們身體健康以及促進(jìn)社會主義社會經(jīng)濟(jì)發(fā)展有著舉足輕重的作用。
[0003]目前，有機(jī)磷農(nóng)藥的殘留檢測多采用薄層色譜法、氣相色譜法、高效液相色譜法等方法。這些方法結(jié)果可靠，靈敏度高，已有相關(guān)的技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)可供參考。但由于需要昂貴的儀器、專門的操作人員，以及樣品前處理復(fù)雜、成本高、時間長，因此不能更好地滿足快速簡便的現(xiàn)場檢測要求。
[0004]有機(jī)磷農(nóng)藥的免疫檢測方法具有快速、廉價、簡便、特異的優(yōu)點(diǎn)，可便攜而進(jìn)行現(xiàn)場監(jiān)測?？朔藗鹘y(tǒng)檢測方法的缺點(diǎn)。通過化學(xué)合成有機(jī)磷農(nóng)藥的半抗原，與載體蛋白偶聯(lián)獲得完全抗原，制備針對環(huán)境和農(nóng)產(chǎn)品中有機(jī)磷農(nóng)藥水胺硫磷、甲基異柳磷和乙基異柳磷的單克隆抗體，建立上述三種有機(jī)磷農(nóng)藥免疫學(xué)檢測方法。該方法的完成，將解決針對高毒有機(jī)磷農(nóng)藥水胺硫磷、甲基異柳磷、乙基異柳磷快速免疫檢測方法中半抗原合成、人工抗原合成、單克隆抗體制備等關(guān)鍵技術(shù)，并建立上述三種農(nóng)藥的免疫快速檢測體系。該專利不僅為食品安全檢測，而且為我國農(nóng)產(chǎn)品等的出入境檢測，環(huán)境監(jiān)測部門的水域監(jiān)測提供了一種新的技術(shù)手段和檢測方法。對我國農(nóng)產(chǎn)品的可持續(xù)健康發(fā)展、解決食品安全問題具有重要的現(xiàn)實(shí)意義和重要的社會、經(jīng)濟(jì)價值。·
【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供針現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供一種抗三種有機(jī)磷農(nóng)藥的單克隆抗體。
[0006]本發(fā)明的另一目的是提供該單克隆抗體的應(yīng)用。
[0007]本發(fā)明的目的可通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
[0008]分泌抗三種有機(jī)磷農(nóng)藥的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞FQ-6E，于2013年8月13日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO:C2013105，所述的三種有機(jī)磷農(nóng)藥為水胺硫磷、甲基異柳磷和乙基異柳磷。
[0009]一種抗水胺硫磷、甲基異柳磷和乙基異柳磷的單克隆抗體，由保藏編號為CCTCCNO:C2013105的雜交瘤細(xì)胞FQ-6E分泌。
[0010]本發(fā)明所述的水胺硫磷等三種有機(jī)磷農(nóng)藥單克隆抗體的制備方法，包括如下步驟:[0011](I)針對水胺硫磷、甲基異柳磷和乙基異柳磷的公共結(jié)構(gòu)化學(xué)合成人工半抗原，合
成路線如下:
[0012]
【權(quán)利要求】
1.分泌抗三種有機(jī)磷農(nóng)藥的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞FQ-6E，于2013年8月13日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO:C2013105，所述的三種有機(jī)磷農(nóng)藥為水胺硫磷、甲基異柳磷和乙基異柳磷。
2.一種抗水胺硫磷、甲基異柳磷和乙基異柳磷的單克隆抗體，其特征在于由權(quán)利要求1所述的雜交瘤細(xì)胞分泌。
3.權(quán)利要求2所述的單克隆抗體的制備方法，其特征在于主要包含以下步驟: (1)針對水胺硫磷、甲基異柳磷和乙基異柳磷的公共結(jié)構(gòu)化學(xué)合成人工半抗原，合成路線如下:
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的單克隆抗體的制備方法，其特征在于所述的人工半抗原通過以下方法制備: ①O-甲基-0-(2-異丙氧基羰基苯基)硫代磷酰氯的合成 O-甲基硫代磷酰二氯、K2CO3和乙腈攪拌均勻，冷卻至10°c以下，滴加含水楊酸異丙酯的乙腈溶液，20°C~28°C下繼續(xù)攪拌30~45min，減壓蒸去溶劑，柱層析分離，得無色液體產(chǎn)物O-甲基-0-(2-異丙氧基羰基苯基)硫代磷酰氯；其中O-甲基硫代磷酰二氯=K2CO3:乙腈=(18~20)mol:(35~40)mol:1L ;含水楊酸異丙酯的乙腈溶液中水楊酸異丙酯的濃度為22~28mol/L，水楊酸異丙酯與K2CO3的摩爾比為1:2~4 ; ②人工半抗原:0-甲基-O-(2-異丙氧基擬基苯基)-N-(3-羧基丙基)硫代憐酸胺的合成 O-甲基-0-(2-異丙氧基羰基苯基)硫代磷酰氯和甲醇按照lmol:(1.4~1.5)L混合，冰水浴冷卻，滴加由K0H、4_氨基丁酸和甲醇按照(3.2~3.5)mol: (1.5~1.6)mol:1L構(gòu)成的混合溶液，20°C~28°C下繼續(xù)攪拌10~15min，反應(yīng)混合物用IN HCl-氯仿萃取，萃取液經(jīng)無水硫酸鈉干燥后，減壓蒸去溶劑，柱層析分離，得無色液體產(chǎn)物O-甲基-0-(2-異丙氧基羰基苯基)硫代磷酰氯；其中O-甲基-O-(2-異丙氧基羰基苯基)硫代磷酰氯與KOH的摩爾比為1:2.5~3.0。
5.權(quán)利要求1所述的雜交瘤細(xì)胞在檢測水胺硫磷、甲基異柳磷和/或乙基異柳磷中的應(yīng)用。
6.權(quán) 利要求2所述的單克隆抗體在檢測水胺硫磷、甲基異柳磷和/或乙基異柳磷中的應(yīng)用。
7.一種水胺硫磷、甲基異柳磷和乙基異柳磷半抗原，其特征在于結(jié)構(gòu)如下所示:
8.權(quán)利要求5所述的半抗原在制備抗水胺硫磷、甲基異柳磷和乙基異柳磷的單克隆抗體中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N5/20GK103589688SQ201310365944
【公開日】2014年2月19日 申請日期:2013年8月21日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月21日
【發(fā)明者】劉鳳權(quán), 王利民, 秦娜, 方慶奎, 華修德 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)