一種電化學(xué)基因傳感器生物芯片的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種用特殊技術(shù)和工藝制備的電化學(xué)基因傳感器生物芯片，該電化學(xué)基因傳感器生物芯片是采用普通的印刷電路板(PCB)做成，該印刷電路板上有許多金屬電極，前期完成銀膠處理工藝及等離子處理工藝后，在每個金屬電極表面通過特制的點樣針以接觸式點樣方式固定上合成的DNA捕獲探針，點制好捕獲探針的芯片通過清洗及組裝工藝組裝成電化學(xué)基因傳感器生物芯片。該電化學(xué)基因傳感器生物芯片本底低、表面均一、結(jié)合力強、雜交分辨率高、點樣點大小和形狀規(guī)整，可廣泛用于高質(zhì)量的寡核苷酸芯片、cDNA芯片、抗原芯片、抗體芯片的制備，亦可應(yīng)用于系列病臨床原體高通量檢測和系列個體化用藥靶標(biāo)的臨床檢測領(lǐng)域。
【專利說明】一種電化學(xué)基因傳感器生物芯片的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種電化學(xué)基因傳感器生物芯片，特別涉及到利用二茂鐵衍生物作為電化學(xué)指示劑的方法，通過特制的點樣針以接觸式點樣方式固定合成的DNA捕獲探針而制備的一種電化學(xué)生物芯片。該電化學(xué)生物芯片表面覆蓋一層金屬金，便于與特殊化學(xué)方法標(biāo)記的的核酸探針和蛋白質(zhì)性質(zhì)的抗原抗體以及其它物質(zhì)的共價化學(xué)結(jié)合。電化學(xué)基因傳感器生物芯片是用普通的印刷電路板(PCB)按照一定的工藝制備而成，該芯片上有許多金屬電極，每個金屬電極表面固定有合成的DNA捕獲探針。捕獲探針的序列長度從20個堿基到30個堿基不等。本發(fā)明適合于核酸類、蛋白質(zhì)類和其它種類的探針、模板片段點制微陣列芯片，具有牢固的特異的化學(xué)鍵結(jié)合特點，為生物芯片的制備提供可靠的載體。
【背景技術(shù)】
[0002]1998年底美國科學(xué)促進會將電化學(xué)基因傳感器技術(shù)列為1998年度自然科學(xué)領(lǐng)域十大進展之一，足見其在科學(xué)史上的意義。它以其可同時、快速、準(zhǔn)確地分析數(shù)以千計基因組信息的本領(lǐng)而顯示出了巨大的威力。這些應(yīng)用主要包括基因表達檢測、突變檢測、基因組多態(tài)性分析和基因文庫作圖以及雜交測序等方面。
[0003]生物芯片以其高通量、多靶位的檢測模式正在被越來越多地應(yīng)用于生物科學(xué)領(lǐng)域。以印刷電路板為載體的微陣列芯片，更以其高效、高通量、低價位等特點，已經(jīng)廣泛用于基礎(chǔ)研究和臨床篩查、輔助診斷。
[0004]微陣列芯片包括寡核苷酸芯片、cDNA芯片、抗原芯片、抗體芯片等，電化學(xué)基因傳感器芯片以特殊化學(xué)方法處理后的印刷電路板為載體，將各種探針或靶標(biāo)片段以化學(xué)鍵結(jié)合的方式固定在印刷電路板表面，并利用二茂`鐵衍生物作為電化學(xué)指示劑，形成可用于雜交反應(yīng)或抗原抗體反應(yīng)的微陣列芯片。
[0005]目前國內(nèi)外基于電化學(xué)傳感器技術(shù)大多數(shù)都不是用二茂鐵作為電化學(xué)指示劑，只有極少數(shù)用二茂鐵衍生物作為電化學(xué)指示劑。本專利的電化學(xué)基因傳感器生物芯片將完全不同于國外專利的二茂鐵衍生物，完全形成具有自主知識產(chǎn)權(quán)的核心專利。此外，本專利擬構(gòu)建的新型基因芯片不同于傳統(tǒng)的基因芯片，無需采用載玻片、尼龍膜、磁珠等為基質(zhì)，而是采用普通的印刷電路板，通過特制的點樣針以接觸式點樣方式固定合成的DNA捕獲探針，再將印刷電路板表面覆蓋一層膠膜，并組裝上微流樣品管，實現(xiàn)了密閉微流雜交通道，大大提高了雜交效率和速度，實現(xiàn)了傳統(tǒng)基因芯片上的技術(shù)革新。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供一種用特殊技術(shù)和工藝制備的電化學(xué)基因傳感器生物芯片，該電化學(xué)基因傳感器生物芯片是采用普通的印刷電路板(PCB)做成，該印刷電路板(PCB)上有許多金屬電極，前期完成銀膠處理工藝及等離子處理工藝后，在每個金屬電極表面通過特制的點樣針以接觸式點樣方式固定上合成的DNA捕獲探針，點制好捕獲探針的芯片通過清洗及組裝工藝組裝成電化學(xué)基因傳感器生物芯片。該電化學(xué)基因傳感器生物芯片本底低、表面均一、結(jié)合力強、雜交分辨率高、點樣點大小和形狀規(guī)整。可以廣泛用于高質(zhì)量的寡核苷酸芯片、cDNA芯片、抗原芯片、抗體芯片的制備，可應(yīng)用于系列病臨床原體高通量檢測和系列個體化用藥靶標(biāo)的臨床檢測領(lǐng)域。
[0007]本發(fā)明提供的電化學(xué)基因傳感器生物芯片，制備程序如下:
[0008]1、空白電化學(xué)基因傳感器生物芯片處理工藝:在印刷電路板的電極上均勻覆蓋預(yù)混好的銀膠，，點好銀膠的印刷電路板放在恒溫干燥箱中95°C 60分鐘烘干；等離子處理I分鐘。[0009]2、在電極上偶聯(lián)捕獲探針工藝:在等離子處理之后的印刷電路板的金電極表面點上相應(yīng)的捕獲探針，在85%濕度、溫度26.7°C的條件下孵育10~15分鐘。
[0010]3、清洗工藝:使用去離子純化水將印刷電路板表面沒有結(jié)合的探針溶液沖洗2分鐘，取出置于真空干燥箱中30°C 15分鐘干燥。
[0011]4、成品組裝工藝:將塑料板、密封蓋及大膠膜、小膠膜按孔上相應(yīng)位置組裝好，跟烘干好的印刷電路板對準(zhǔn)位置在氣液增壓機上壓制成電化學(xué)基因傳感器生物芯片，并蓋好塑料外殼。
[0012]通過以上特殊制備工藝，制成本發(fā)明電化學(xué)基因傳感器生物芯片，放置一周后，可以用于系列病臨床原體高通量檢測和系列個體化用藥靶標(biāo)的臨床檢測領(lǐng)域。
[0013]大多數(shù)傳統(tǒng)的芯片需要自動化設(shè)備或人工手動來做多級流體處理過程。這些自動化設(shè)備一般體積龐大，復(fù)雜，昂貴，而且往往限制DNA芯片的高成本科研應(yīng)用，不適合用于體外診斷。人工手動則耗費人力，容易出錯。而我們的電化學(xué)基因傳感器生物芯片完全不需要清洗。檢測人員只需將PCR產(chǎn)物與信號探針雜交液混合，然后移入到電化學(xué)基因傳感器生物芯片里，并將芯片插入電化學(xué)基因傳感器生物芯片檢測系統(tǒng)里，30分鐘之后，便有結(jié)果，中間無需任何操作。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]圖1印刷電路板芯片的正面
[0015]圖2印刷電路板芯片的反面
[0016]圖3電化學(xué)基因傳感器生物芯片成品
[0017]圖4華法林敏感性基因點樣制備電化學(xué)基因傳感器生物芯片的探針矩陣
[0018]圖5華法林敏感性基因檢測試劑電化學(xué)檢測信號
【具體實施方式】
[0019]本發(fā)明用下列實施例進行解釋，目的只是為了解釋而不是以任何方式限制本發(fā)明。
[0020]實施例1:華法林敏感性基因點樣制備電化學(xué)基因傳感器生物芯片
[0021]取本發(fā)明電化學(xué)基因傳感器生物芯片中所描述的印刷電路板(PCB) —塊，前期完成銀膠處理工藝及等離子處理工藝，配以華法林敏感性基因寡核苷酸探針出條)，以及點樣液成分，通過點樣儀將探針點制在印刷電路板(PCB)相應(yīng)的電極上。探針矩陣為“S”型，每個探針重復(fù)2點，中間間隔一個點，如圖4所示。本發(fā)明電化學(xué)基因傳感器生物芯片點制的探針點大小均勻。[0022]華法林敏感性基因檢測試劑盒針對人類基因組DNA中對華法林藥物代謝敏感的五個SNP位點，設(shè)計特異性引物和探針(包括捕獲探針和信號探針)，其中特異性引物進行多重復(fù)合擴增獲得五個SNP位點的擴增產(chǎn)物；捕獲探針分別固定在特制的印刷電路板金電極表面，制備成華法林電化學(xué)傳感器(芯片)，用于捕獲PCR多重擴增產(chǎn)物；信號探針與PCR產(chǎn)物特異結(jié)合。由于信號探針標(biāo)記有二茂鐵分子，會通過夾心雜交產(chǎn)生電流的變化。應(yīng)用電化學(xué)基因傳感器分析系統(tǒng)檢測出相應(yīng)電流值(信號值)，并對各個SNP位點的堿基型別進行判定。
[0023]實施例2:通過雜交反應(yīng)檢驗電化學(xué)基因傳感器生物芯片的信號特性
[0024]將上述點制好的芯片通過清洗及組裝工藝組裝成電化學(xué)基因傳感器生物芯片。取華法林敏感性基因檢測試劑的其它成分，擴增1份己知基因型別的DNA樣本得到雜交模板。取一 0.2ml的離心管，依次加入70 μ I雜交液I，10 μ I雜交液II，20 μ I雜交液III以及25 μ I PCR產(chǎn) 物，充分混勻(注意盡量不要有氣泡)，將混勻的液體移入制備好的電化學(xué)基因傳感器生物芯片的管中，壓緊管蓋。插入與該電化學(xué)基因傳感器生物芯片配套檢測使用的電化學(xué)基因傳感器檢測系統(tǒng)(DA9000)中，選擇設(shè)定好的雜交程序，雜交時間30分鐘。雜交結(jié)束后該儀器給出該樣本的檢測結(jié)果和報告。同時可以將該次上機檢測的結(jié)果導(dǎo)入相應(yīng)的服務(wù)器中，采用相應(yīng)的軟件查看相應(yīng)的電化學(xué)信號(如圖5所示)，野生型樣本在相應(yīng)的電勢位置上出現(xiàn)野生型信號，突變型樣本在相應(yīng)的電勢位置上出現(xiàn)突變型信號，并將圖像轉(zhuǎn)換成數(shù)據(jù)，采用分析軟件，將以上數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成基因型別。結(jié)果分析得到的陽性雜交點和陰性雜交點與樣本基因序列和基因型別符合，從圖中可見，陽性探針點信號強，陰性點本底低，結(jié)合力和分辨力都很好，能夠滿足電化學(xué)基因傳感器生物芯片的制備和雜交反應(yīng)要求。
【權(quán)利要求】
1.一種電化學(xué)基因傳感器生物芯片的制備方法，其特征在于電化學(xué)基因傳感器生物芯片是采用普通的印刷電路板(PCB)做成，該印刷電路板(PCB)上有許多金屬電極，每個金屬電極表面通過特制的點樣針以接觸式點樣方式固定上合成的DNA捕獲探針，捕獲探針的序列長度從20個堿基到30個堿基不等，點制好捕獲探針的芯片通過清洗及組裝工藝組裝成電化學(xué)基因傳感器生物芯片。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的電化學(xué)基因傳感器生物芯片，其特征還在于該印刷電路板(PCB)表面覆蓋一層金屬金，便于與特殊化學(xué)方法標(biāo)記的的DNA捕獲探針、蛋白質(zhì)性質(zhì)的抗原抗體以及其它物質(zhì)的共價化學(xué)結(jié)合。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的電化學(xué)基因傳感器生物芯片，其特征還在于該生物芯片的印刷電路板(PCB)上金屬電極微陣列可以有不同的排列組合方式。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微陣列排列組合，其特征還在于該生物芯片的印刷電路板(PCB)上金屬電極微陣列的排列組合采用“S”型的微陣列方式，每條捕獲探針2個重復(fù)點，中間間隔一個點。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的電化學(xué)基因傳感器生物芯片，其特征還在于該生物芯片的銀膠處理工藝為:在印刷電路板的右上方輔助電極上均勻覆蓋預(yù)混好的銀膠，點好銀膠的印刷電路板放在恒溫干燥箱中95°C 60分鐘烘干。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的電化學(xué)基因傳感器生物芯片，其特征還在于該生物芯片的等離子處理工藝為:取處理好銀膠的印刷電路板放置于全自動的等離子處理儀器中，設(shè)置好程序，在等離子處理儀上處理I分鐘。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的電化學(xué)基因傳感器生物芯片，其特征還在于該生物芯片的偶聯(lián)捕獲探針工藝為:在等離子處理之后的印刷電路板的金電極表面通過特制的點樣針接觸式點樣方式固定合成的DNA捕獲探針，在85%濕度、溫度26.7°C的條件下孵育10~15分鐘。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的電化學(xué)基因傳感器生物芯片，其特征還在于該生物芯片的清洗工藝為:使用去離子純化水將印刷電路板表面沒有結(jié)合的探針溶液沖洗2分鐘，取出置于真空干燥箱中30°C 15分鐘干燥。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的電化學(xué)基因傳感器生物芯片，其特征還在于該生物芯片的成品組裝工藝為:將塑料板、密封蓋及大膠膜、小膠膜按孔上相應(yīng)位置組裝好，跟烘干好的印刷電路板對準(zhǔn)位置在氣液增壓機上壓制成電化學(xué)基因傳感器生物芯片，并蓋好塑料外殼。
【文檔編號】C12Q1/68GK103627788SQ201310366816
【公開日】2014年3月12日 申請日期:2013年8月21日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月21日
【發(fā)明者】陳華云, 李明, 肖湘文, 趙麗, 黃桃生 申請人:中山大學(xué)達安基因股份有限公司