一種檢測雞胡須性狀的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種檢測雞胡須性狀的方法，涉及分子生物學領(lǐng)域，在胡須雞27號染色體發(fā)現(xiàn)存在三個DNA片段的拷貝數(shù)變異，物理位置分別為1702269-1721521bp、4470331-4503417bp、3578409-3592890bp，確定了3個分子標記，針對該分子標記設(shè)計了3對引物，用PCR方法對待測雞基因組的上述3個分子標記進行檢測，若三個PCR擴增反應(yīng)的目的片段分別為3200bp、501bp、411bp，則檢測結(jié)果為陽性，否則為陰性。本發(fā)明提供的方法操作簡單，靈敏度高，準確性強，檢測成本低，可快速檢測含有胡須性狀的個體，在雞的保種、育種過程中具有重要應(yīng)用價值。
【專利說明】一種檢測雞胡須性狀的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及分子生物學【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及用于雞胡須性狀的分子標記、以及檢 測胡須性狀的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 長期的進化和馴化選擇，豐富了農(nóng)業(yè)動物遺傳資源的多樣性。近年來的研究發(fā)現(xiàn)， 基因組結(jié)構(gòu)變異是畜禽馴化過程中多個重要性狀的遺傳基礎(chǔ)，如雞20號染色體上發(fā)生的 復雜結(jié)構(gòu)重排，會使EDN3基因的表達產(chǎn)生變化，最終導致黑色素在真皮內(nèi)的沉積；位于雞1 號染色體的S0X5基因內(nèi)含子1內(nèi)3. 2kb區(qū)域的復制，使得在發(fā)育的6-12天內(nèi)S0X5基因表 達發(fā)生改變，導致豆冠表型的產(chǎn)生?；蚪M結(jié)構(gòu)變異可以通過多種機制影響基因表達，對結(jié) 構(gòu)變異進行研究，有助于我們解析相關(guān)性狀形成的機制。
[0003] 基因組結(jié)構(gòu)變異包括缺失、重復、倒位、易位四種類型。目前針對基因組結(jié)構(gòu)變異 的檢測技術(shù)主要有基于高密度SNP的基因分型芯片、比較基因組雜交芯片，以及高通量測 序技術(shù)等。隨著高通量測序技術(shù)的不斷發(fā)展，成本的不斷降低，測序已經(jīng)成為目前生物學研 究的重要手段。通過對結(jié)構(gòu)變異靶區(qū)域的重測序分析，分離出結(jié)構(gòu)變異造成的斷點和重排 情況，進而利用PCR等常規(guī)分子生物學技術(shù)對結(jié)構(gòu)變異進行檢測。檢測只需在結(jié)構(gòu)變異產(chǎn) 生的斷點兩側(cè)設(shè)計擴增引物，利用簡單的PCR反應(yīng)，通過瓊脂糖凝膠檢測就可以檢測結(jié)構(gòu) 變異的存在。
[0004] 雞的胡須性狀是家畜中最早進行研究的表型性狀之一，經(jīng)歷了上百年的歷史，至 今仍未見報道影響胡須性狀的確定染色體位置和檢測方法。如果利用傳統(tǒng)方法對雞的胡須 形狀進行選育，將耗費大量的人力、物力、財力。利用分子生物學的手段建立一種快速檢測 胡須性狀的方法，進行標記輔助選擇，將有助于提高育種效率。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種鑒別雞胡須性狀性狀的方法。
[0006] 本發(fā)明以中國農(nóng)業(yè)大學與廣東省農(nóng)業(yè)科學院畜牧研究所合作建立的以惠陽胡 須雞與嶺南黃雞A03系為親本的F2雜交資源群體為研究對象，記錄了F0、F1和F2代 個體的胡須性狀，利用全基因組SNP進行連鎖分析，將影響雞胡須性狀的基因座定位于 雞27號染色體；對R)樣本的進行重測序分析，分離得到了影響雞胡須性狀的結(jié)構(gòu)變 異。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，胡須雞27號染色體存在三個DNA片段的重復(拷貝數(shù)變異，CNV)，在雞 ICGSCGallus_gallus-4.0 版本基因組中的物理位置分別為 1702269-1721521bp(CNV1)、 4470331-4503417bp(CNV2)、3578409-3592890bp(CNV3)，三個片段順利連接并插入到CNV1 原座位，其位置關(guān)系如圖1所示。本發(fā)明鑒別雞胡須性狀的方法，是針對不同CNV片段間的 連接設(shè)計引物進行PCR檢測，根據(jù)檢測結(jié)果判定雞是否存在胡須基因。
[0007] 本發(fā)明首先提供一種用于檢測雞胡須性狀的分子標記組合，其為CNV1、 CNV2和CNV3,這三個分子標記物理位置位于雞27號染色體1702269-1721521bp、 4470331-4503417bp、3578409-3592890bp處，CNV1 和CNV2 連接的基因序列如SEQIDNo. 7 所示，CNV2和CNV3連接的基因序列如SEQIDNo. 8所示，CNV3和CNV1連接的基因序列如 SEQIDNo. 9 所示。
[0008] 本發(fā)明提供了用于檢測上述分子標記組合的引物組合，是針對上述不同CNV片段 間的連接設(shè)計引物，其核苷酸序列為：

【權(quán)利要求】
1. 一種用于檢測雞胡須性狀的分子標記組合，其特征在于，其為CNV1、CNV2和CNV3， 這三個分子標記物理位置位于雞27號染色體1702269-1721521bp、4470331-4503417bp、 3578409-3592890bp 處，CNV1 和 CNV2 連接的基因序列如 SEQ ID No. 7 所示，CNV2 和 CNV3 連 接的基因序列如SEQ ID No. 8所示，CNV3和CNV1連接的基因序列如SEQ ID No. 9所示。
2. 權(quán)利要求1所述的分子標記組合在雞育種中的應(yīng)用。
3. 用于檢測權(quán)利要求1所述分子標記組合的引物組合，其特征在于，其核苷酸序列為： CNV1-2F TTTGTTGTCTCCTTGCATCATT CNV1-2R CCATGTCAGCACAGTAACGATT CNV2-3F ATGTTGGTTGTGTGCCAAGTAG CNV2-3R TTTCCCCTCGTCTGCTTTATTA CNV3-1F ACAAGTCAGAGAGGCAATCGAC CNV3-1R CCATACAGCCTCAGGTAAGGAC〇
4. 權(quán)利要求3所述的引物組合在制備檢測雞胡須性狀試劑盒中的應(yīng)用。
5. 權(quán)利要求3所述的引物組合在雞育種中的應(yīng)用。
6. -種檢測雞胡須性狀的試劑盒，其特征在于，含有權(quán)利要求3所述的引物組合。
7. -種檢測雞胡須性狀的方法，其特征在于，包括以下步驟： (1)以待測雞的基因組DNA為模板，用三對引物分別進行PCR反應(yīng)；所述三對引物分別 是： CNV1-2F TTTGTTGTCTCCTTGCATCATT CNV1-2R CCATGTCAGCACAGTAACGATT CNV2-3F ATGTTGGTTGTGTGCCAAGTAG CNV2-3R TTTCCCCTCGTCTGCTTTATTA CNV3-1F ACAAGTCAGAGAGGCAATCGAC CNV3-1R CCATACAGCCTCAGGTAAGGAC ； (2 )將三次PCR反應(yīng)的擴增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠檢測，若CNV1、CNV2、CNV3引物的PCR擴 增反應(yīng)的目的片段分別為320(^?、50化？、4^?，則結(jié)果為陽性，否則為陰性。
8. 如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，步驟（1)中引物CNV3-1F、CNV3-1R和 CNV2-3F、CNV2-3R的PCR擴增反應(yīng)體系為： 總體系為25 ill時，基因組DNA :50ng，1 XPCR Buffer，dNTP4mM，上、下游引物各 lOpmol，康為Taq DNA聚合酶1. 25U，加水補至25iil反應(yīng)體系； 引物 CNV1-2F、CNV1-2R 的 PCR 擴增反應(yīng)體系為：基因組 DNA:50ng，lXPCR Buffer， dNTP4mM，上、下游引物各10pmol，Long AmpTaq DNA聚合酶NEB1. 25U，加水補至25iil反應(yīng) 體系。
9. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，步驟（1)中引物CNV3-1F、CNV3-1R及 CNV2-3F、CNV2-3R 的 PCR 反應(yīng)條件為：94°C預變性 5min ;94°C變性 30sec，60°C退火 30sec， 72°C延伸20sec，共35個循環(huán)；72°C終延伸7min;12°C保存； 引物CNV1-2F、CNV1-2R的PCR反應(yīng)條件為：94°C預變性3min ;94°C變性lOsec，57°C退 火30sec，65°C延伸4sec，共35個循環(huán)；65°C終延伸7min ;12°C保存。
10. 權(quán)利要求7-9任一所述的方法在雞育種中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N15/11GK104342490SQ201310367724
【公開日】2015年2月11日 申請日期:2013年8月21日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月2日
【發(fā)明者】胡曉湘, 顧曉榮, 郭影, 盛哲雅, 王彥強, 舒鼎銘, 瞿浩, 李寧 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學