一種鴨腸炎病毒細菌人工染色體的構建及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于動物基因工程【技術領域】，具體涉及一種鴨腸炎病毒人工染色體的構建及應用。本發(fā)明克隆得到一種鴨腸炎病毒人工染色體pBAC-C-KCE質粒，該質粒保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC），其保藏號為CCTCC?NO：M2013377。本發(fā)明還公開了鴨腸炎病毒人工染色體pBAC-C-KCE在重組鴨腸炎病毒包裝上的應用。
【專利說明】—種鴨腸炎病毒細菌人工染色體的構建及其應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于動物基因工程【技術領域】，具體涉及一種鴨腸炎病毒細菌人工染色體的構建及其應用。
【背景技術】
[0002]鴨病毒性腸炎(DuckVirus Enteritis, DEV)又名鴨瘟(Duck Plague, DP)，是由鴨腸炎病毒(Duck Enteritis Virus, DEV)引起的鴨、鵝等雁形目禽類的一種急性、接觸性傳染病，各年齡的禽類均可發(fā)病。鴨病毒性腸炎在很多國家都有該病的報道，在我國也廣泛流行。由于其傳播迅速，并且發(fā)病和死亡率高，能達50-100%，成鴨甚至在90%以上，已經成為危害養(yǎng)鴨業(yè)的主要疫病之一。近幾年，陸續(xù)有關于鴨腸炎病毒基因組的研究報道；2009年，鴨腸炎病毒基因組序列已經公布并登陸在Genbank (Li Y et al.，2009)，為研究DEV的基因和蛋白功能提供了有力的參考數據。其基因組大小約為150kb，編碼78個蛋白質，其中有67個蛋白與α -皰疫病毒有同源性，I個蛋白與Y -皰疫病毒同源,5個與禽皰疫病毒同源。將皰疹病毒的整個基因組克隆到BAC質粒中，然后在細菌中重組其他病毒的具有免疫源性的外源基因，從而構建二價疫苗。
[0003]對于皰疹病毒這樣的大基因組病毒(大于lOOkb)，體外操作的難度很大，常規(guī)的體外酶切和連接的方法不適合。構建重組病毒的經典方法是將帶有目的基因的轉移載體與病毒基因組共轉染哺乳動物細胞，經細胞內同源重組獲得重組病毒。由于存在野生型病毒的干擾，一般需要經過多輪空斑純化才能篩選得到純的重組病毒(Domi A etal., 2005; Horsburgh B C et al.，1999)，這是一項極為繁瑣的工作，有時還會遇到重組病毒傳代不穩(wěn)定的問題。為了克服這種方法的局限，研究人員嘗試在大腸桿菌中直接對病毒基因組進行修飾。首先嘗試的 是大腸桿菌Cosmid載體。由于病毒基因很大，而此載體容量有限(約40kb)，必須將病毒基因組分成幾段，構成一套重疊的載體，經細胞內的多次同源重組組裝成完整的病毒基因組，產生重組毒。Cosmid載體在大腸桿菌中不穩(wěn)定，共轉染的效率低，此外，這些載體在細胞內要經過多次同源重組，其精確性很難保證，發(fā)生缺失突變的較高，因而對分離到的重組病毒尚需進一步分析鑒定，不是一種很好的方法。
[0004]在基因組學研究工作的需要下，研究人員開發(fā)了一系列適用于大片段克隆的載體和宿主系統，如酵母人工染色體載體(YAC)、大腸桿菌的F因子衍生的細菌人工染色體載體(BAC)和以噬菌體復制子為基礎的載體(PAC)。BAC載體可以克隆大至300kb的片段，而且可以在大腸桿菌中穩(wěn)定的復制(McGeoch D J et al.，1994)。近年來,一系列大的雙鏈病毒基因組陸續(xù)被 BAC 化(Adler H et al., 2000; Borst E M et al., 1999; Azab W etal., 2002; Smith B N et al.，2000)。這些BAC化的病毒基因組轉染細胞后，在細胞中能產生感染性病毒粒子，這使得利用細菌的遺傳工具操作病毒成為可能。但是，由于某些未知原因，位于基因組中BAC載體部分不太穩(wěn)定，BAC化的病毒基因組轉染細胞后，載體及其兩側病毒基因組序列會發(fā)生不同程度的缺失。為了解決這個問題，BAC載體兩側各引入了一個1xP位點,該載體轉入表達Cre重組酶的動物細胞中，Cre酶會催化在兩個位點之間的重組反應，從而使原核來源的載體骨架部分從病毒基因組上去除，僅留下34bp的1xP的序列，保證了基因組的保真性和完整性，盡可能的避免了原核來源對插入位鉻鄰近的病毒基因表達的影響，這樣利用BAC克隆的細菌遺傳工具操作大基因組病毒更趨完善，該方法成功的用于偽狂犬病毒的BAC克隆(Smith G A et al.，2000)。同源重組和位點特異性重組是廣泛被用于修飾BAC克隆的方法。RecA同源重組系統是最早為人們熟知的大腸桿菌同源重組系統。然而，由RecA介導的同源重組所需同源區(qū)長達1000bp左右，操作的難度大，相對耗時費力，從而使其應用受到很大程度的限制。RecE/RecT同源重組系統可以催化同源反應在20_25bp的同源區(qū)間發(fā)生，同源重組效率較高(Muyrers J P et al., 2000;MuyrersJ P et al.，2000a)。Red-gam 系統與 RecE/RecT 類似，且重組效率更高(Muyrers J P etal., 2000b; Jamsai D et al.，2003)。至此,人們把這兩種重組技術結合起來(Red/ET)實現了直接以PCR產物作為供體分子對目的序列的打靶修飾，可以有效地對BAC克隆上的任意基因進行點突變、插入和缺失等修飾。位點特異性重組是由位點特異性重組酶介導特定位點間的發(fā)生位點特異性重組。通用的系統有Pl噬菌體的Cre-1oxP系統(Smith G A etal.，2000)，入噬菌體的 Int-att 系統(Suzuki Y et al.，2005)，和酵母的 Flp-FRT 系統(Cherepanov P P et al.，1995)。位點特異性重組技術祀向性強、重組效率高,也是修飾BAC克隆的有效工具。這整個過程都是在細菌體內進行的，在很大程度上能避免了離體操作對大分子的損傷。2005年，Li M Z et al.開發(fā)了一個有效的方法，用于同源重組方法在體內構建重組DNA分子——交配輔助遺傳整合克隆(MAGIC) (Li M Z et al.，2005)。

【發(fā)明內容】

[0005]本發(fā)明的目的在于克服現有技術的缺陷，構建一種鴨腸炎病毒細菌人工染色體質粒，該鴨病毒性腸炎(DEV)疫苗株(C-KCE)的細菌人工染色體質粒，可以利用大腸桿(例如DH10B)以及雞胚成纖維細胞(CEF細胞)重新快速拯救出DEV。將外源基因克隆入載體PRThGA后，利用交配輔助遺傳整合克隆(即MAGIC方法)重組，即可獲得含有外源基因的重組鴨腸炎病毒。
[0006]實現本發(fā)明的主要技術方案和步驟如下所述:
[0007](I)將BAC骨架質粒由低拷貝變成多拷貝，以方便后期的操作。
[0008](2)將鴨病毒性腸炎(DEV)的全基因組通過同源重組的方法插入到BAC質粒上。
[0009](3)運用MAGIC的方法將鴨其他病原的免疫源性基因快速穩(wěn)定的插入DEV中。從而得到一個表達該外源基因的DEV病毒。
[0010](4)利用表達外源基因的DEV病毒控制鴨群中其他病毒和鴨瘟感染的問題。
[0011]更詳細的技術方案參見《【具體實施方式】》。
[0012]本發(fā)明優(yōu)點在于:
[0013]1利用本發(fā)明中的鴨腸炎病毒細菌人工染色體大大縮短了獲得重組病毒的周期。[0014]2本發(fā)明中的鴨腸炎病毒細菌人工染色體重組外源基因后對載體進行了剔除，無功能性外源序列插入，對基因組亦無影響，不存在遺傳物質發(fā)生跨物種轉移的可能。
[0015]3利用本發(fā)明中的鴨腸炎病毒細菌人工染色體重組外源基因可以達到一針同時防兩病甚至多種疾病的目的?！緦＠綀D】

【附圖說明】
[0016]序列表SEQ ID NO:1是pBlue_Lox空載體序列，序列長度為8284bp。
[0017]序列表SEQ ID NO:2 是 pBlue-UL27-UL26 序列，長度為 12557bp。
[0018]序列表SEQ ID NO:3 是 pCAGGS 的 chicken β -actin promotor-rabbit β -globinPloyA的表達框和同源臂序列，長度為2380bp。
[0019]序列表SEQ ID NO:4是Loxp序列，長度為644bp,從第485_518bp是切除BAC骨架后僅留下一個34bpLoxp位點的序列。
[0020]序列表SEQ ID NO:5是序列表SEQ ID NO:4中切除BAC骨架后僅留下一個Loxp位點的序列，序列長度為34bp。
[0021]序列表SEQ ID NO:6是Pacl酶切線性化的rBAC同源臂載體序列，長度為10717bp
[0022]圖1:是本發(fā)明的轉移載體pBlue-UL27-UL26的構建流程。其中:圖1中的左圖中的CMV Promoter是CMV啟動子；圖1中的下圖的CMV Promoter是CMV啟動子。
[0023]圖2:是本發(fā)明鴨腸炎病毒細菌人工染色體的構建的流程示意圖。
[0024]圖3:是本發(fā)明的轉移載體pBlue-UL27-UL26重組到鴨腸炎病毒上在雞的成纖維細胞上增殖的示意圖。其中:圖3A為轉移載體pBlue-UL27-UL26重組到鴨腸炎病毒上在雞的成纖維細胞上單獨形成空斑的照片；
[0025]圖3B為轉移載體pBlue-UL27_UL26重組到鴨腸炎病毒上，并且經過多次空斑純化后在雞的成纖維細胞增殖的示意圖。
[0026]圖4:是本發(fā)明pRThGA 載體改造成重組質粒pRTHGAl的示意圖。其中:圖中左上圖中的CMV Promoter是CMV啟動子；右上圖及下中圖中的Chicken beta-actin promoter是 Chicken beta-actin 啟動子，CMV.1E enhancer 是 CMV.1E 增強子。
[0027]圖5:是本發(fā)明構建的重組質粒PRTHGA-HA的示例圖。其中，圖中的Chickenbeta-actin promoter 是 Chicken beta-actin 的啟動子,CMV.1E enhancer 是 CMV.1E 增強子；質粒帶有Amp (氨節(jié)青霉素)抗性。
[0028]圖6:是本發(fā)明中所的應用MAGIC方法的示意圖。圖中供體菌A為Amp (氨芐青霉素)抗性；受體菌B為Kna (卡那霉素)抗體、Cam (氯霉素)抗性和Ara (阿拉伯糖)抗性。
[0029]圖7:是運用Western Blot檢測DEV-HA表達HA的結果。下圖中DEV-HA重組毒株與DEV毒株與內參GAPDH的單抗都發(fā)生反應產生明顯的條帶呈陽性，證明該實驗有效。圖7的上圖中DEV-HA重組毒株與抗HA的單抗發(fā)生反應產生明顯的條帶呈陽性，而DEV毒株則呈陰性，證明DEV-HA重組毒株構建成功。
【具體實施方式】
[0030]實施例1BAC同源臂的構建和多拷貝的形成
[0031]1、鴨病毒性腸炎(DEV)病毒基因組的提取
[0032]將凍存的鴨腸炎病毒疫苗株C-KCE (購自中國獸醫(yī)藥監(jiān)察所，該疫苗株C-KCE的基因組 DNA 序列已提交(登錄)，登錄號為 temporary gene bank accession N0.KF263690)的病變細胞連續(xù)凍融3次，4°C 8000rpm離心20min沉淀細胞碎片。收集上清，30% (w/w)蔗糖溶液墊底，4°C 16000rpm離心60min沉淀病毒粒子。棄掉上清，加入雙蒸水將病毒粒子懸浮。加入蛋白酶K至終濃度500 μ g/rnL，十二烷基硫酸鈉(SDS)至終濃度1%。置56°C水浴lh。將消化后產物用等體積的V(苯酚):V(氯仿)=體積比為1:1和氯仿各抽提一次，16000rpm離心15min。取上清液向其中加入有加入等體積的異丙醇輕輕混勻，_20°C沉淀核酸2h。4°C 16000rpm離心20min沉淀DNA, 70%冷乙醇洗漆一次，回收核酸沉淀,重懸于TER (含有RNA酶的TE)室溫作用lOmin，充分消化RNA，消化完畢后用作模板使用。
[0033]2.在UL26和UL27 (UL26和UL27是鴨腸炎病毒的部分基因組序列，GenBank:EU082088.2)之間插入BAC載體:UL26兩端引入NOTI和PACI的酶切位點(上下游引物分別為UL26-F和UL26-R，引物具體序列見表1)，UL27兩端分別引入Sal I和Pac I的酶切位點(上下游引物分別為UL27-F和UL27-R，引物具體序列見表1)。以C-KCE的基因組為模板將同源臂用PCR擴增下來(UL27的終止子位于正中間)。以ρ⑶NA3.1(湖北大學生命科學院馬立新教授贈送)為模板擴增AMP的復制子，并且在兩端引入Pac I的酶切位點(上下游引物分別為Amp-F和Amp-R，引物具體序列見表1)。PCR擴增體系=Easy-Taq0.25 μ L ；IOxbuf fer2.5 μ L，dNTP2 μ L，模板2 μ L，上下游引物各I μ L，ddH20補齊25 μ L，混勻后按以下程序進行反應:95°C預變性5min，94°C變性30s，按各引物退火溫度，40s，延伸lmin，30個循環(huán)，最后72°C延伸IOmin。
[0034]采用重疊PCR 方法(PCR 擴增體系:Easy_Taq0.25 μ L ； IOxbuffer2.5 μ L,dNTP2 μ L，模板2 μ L，三對上下游引物各I μ L，ddH20補齊25 μ L，混勻后按以下程序進行反應:95°C預變性5min，94°C變性30s，52°C退火，40s，72°C延伸5min，30個循環(huán)，最后72°C延伸IOmin)將三者連接在一起，然后克隆到Sal I，Not I酶切的pBlue_lox載體(湖北大學生命科學院馬立新教授贈送)上，獲得用于重組的BAC載體，將其命名為rBAC載體(上述過程見圖1)。
[0035]表1PCR及重疊PCR弓丨物
[0036]
【權利要求】
1.一種包含重組鴨腸炎病毒人工染色體pBAC-C-KCE質粒的大腸桿菌DHlOB-1S2/BAC-C-KCE，保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CCTCC NO:M2013377。
2.權利要求1所述的包含重組鴨腸炎病毒人工染色體pBAC-C-KCE質粒的大腸桿菌DH10B-1S2/BAC-C-KCE在重組鴨腸炎病毒包裝上的應用。
【文檔編號】C12N7/01GK103497967SQ201310374703
【公開日】2014年1月8日 申請日期:2013年8月26日 優(yōu)先權日:2013年8月26日
【發(fā)明者】金梅林, 李淑云, 鄒忠 申請人:華中農業(yè)大學