一種釀酒酵母模塊共轉(zhuǎn)化組合篩選方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種釀酒酵母模塊共轉(zhuǎn)化組合篩選方法，步驟為：（1）每次從待篩選的啟動子元件庫、基因元件庫和終止子元件庫中各選一個元件組裝到帶有不同篩選標記的質(zhì)粒上得到模塊，不同的模塊中，相同基因元件所選篩選標記相同，由模塊組成模塊庫；（2）對模塊庫中的模塊進行排列組合設計；（3）利用釀酒酵母質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化技術，將與設計對應的模塊轉(zhuǎn)入釀酒酵母底盤菌中；（4）將轉(zhuǎn)化后的菌在選擇缺陷型培養(yǎng)基上培養(yǎng)，得到排列組合的正確釀酒酵母轉(zhuǎn)化子；（5）結(jié)合目標性狀的具體特征篩選得到高效模塊組合的釀酒酵母轉(zhuǎn)化子。本發(fā)明的方法極大的降低了工作量、提高了所構(gòu)建系統(tǒng)的靈活性。得到的組合不用測序，降低了成本。
【專利說明】一種釀酒酵母模塊共轉(zhuǎn)化組合篩選方法

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及合成生物學【技術領域】，具體涉及的是一種釀酒酵母模塊共轉(zhuǎn)化組合篩 選方法。

【背景技術】
[0002] 合成生物學是一門新型的交叉學科，是指通過重頭設計并構(gòu)建新的遺傳組件、設 備和系統(tǒng)，或?qū)ΜF(xiàn)有的、天然的生物系統(tǒng)進行重新設計和改造，以達到利用工程化的遺傳系 統(tǒng)或生物模型來處理信息、合成化合物、生產(chǎn)能源、提供食物以及改善環(huán)境等目的。合成生 物學的工程技術本質(zhì)是按照設計好的藍圖重新組裝分子元件，并轉(zhuǎn)入細胞，使這些工程化 的細胞執(zhí)行新的功能。將基因元件(啟動子、開放閱讀框、終止子、核糖體結(jié)合位點等）依據(jù) 工程化目標需要，有機重構(gòu)和連接起來，便形成了功能基因模塊。DNA組裝的誕生加速了合 成生物學功能元件庫(如啟動子庫)以及生物合成途徑的人工構(gòu)建。隨著合成生物學的快速 發(fā)展，對異源模塊在底盤細胞中表達的優(yōu)化和適配的需求不斷增加。
[0003] 由于合成生物學的研究模式是"轉(zhuǎn)移一組基因，表達一種蛋白"，因而需要在更大 規(guī)模更多層次上涉及到細胞網(wǎng)絡，如代謝網(wǎng)絡等。傳統(tǒng)的通過代謝工程網(wǎng)絡分析設計相關 模塊已經(jīng)無法滿足合成生物的需要，不同來源模塊之間的組合適配成為重要的應用方法之 一。在此過程中，底盤生物本身代謝網(wǎng)絡與新生物功能途徑相互協(xié)調(diào)，相互適配，最終得 到服務于特定生產(chǎn)和生活需要的"細胞工廠"提供了重要基礎。2010年Gregory組發(fā)表 在Science上的研究利用組合適配的方法將紫衫二烯在大腸桿菌中的表達量提高了 15000 倍，達到1克/升。其方法為優(yōu)化大腸桿菌內(nèi)源MEP途徑中關鍵酶和外源GGPP合成酶、紫 衫烯合成酶的啟動子組合、質(zhì)粒拷貝數(shù)組合，共產(chǎn)生組合數(shù)為32個。2012年，Huimin Zhao 組通過啟動子突變產(chǎn)生不同強度的啟動子庫，利用酵母內(nèi)源同源重組得到帶有突變啟動子 的不同組合，利用一次酵母轉(zhuǎn)化得到含有不同組合的混菌庫。在混菌中對表型進行篩選得 到一株在木糖培養(yǎng)基上高產(chǎn)乙醇的工業(yè)菌株。通過對得到的優(yōu)勢菌株提取酵母質(zhì)粒進行測 序得到最優(yōu)的啟動子組合方式。
[0004] 合成生物學現(xiàn)有的對模塊的組合研究方式多采用將所有模塊組裝到同一質(zhì)粒上， 并轉(zhuǎn)入底盤菌株中進行篩選。這種構(gòu)建模式的優(yōu)勢之處在于所構(gòu)建途徑比較穩(wěn)定、各模塊 表達量比較平衡。適用于已對所構(gòu)建途徑已有一定了解、能通過特定組合設計完成構(gòu)建的 途徑。但是同時也存在諸多缺點：組合后的質(zhì)粒很難對中間某一模塊進行替換或改造，所涉 及的研究范圍相對比較片面；在所涉及模塊數(shù)量較多或模塊組合數(shù)較多的情況下，對所有 模塊及組合進行組裝工作量巨大；大部分組裝方法均需對所有組裝模塊進行測序，價格昂 貴；受組合類型和數(shù)目的限制，難以對某一途徑的所有步驟及步驟之間的相互聯(lián)系進行系 統(tǒng)的研究。
[0005] 基于以上原因，目前需要一種可以將模塊進行系統(tǒng)的排列組合并快速篩選的新方 法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有不足，提供一種釀酒酵母模塊共轉(zhuǎn)化組合篩選方法。
[0007] 本發(fā)明的技術方案概述如下：
[0008] -種釀酒酵母模塊共轉(zhuǎn)化組合篩選方法，包括以下步驟：
[0009] (1)每次從待篩選的啟動子元件庫、基因元件庫和終止子元件庫中各選一個元件 組裝到帶有不同篩選標記的質(zhì)粒上得到模塊，不同的模塊中，相同基因元件所選篩選標記 相同，由模塊組成模塊庫，進行測序確保模塊庫中的各模塊序列正確；
[0010] (2)對所述模塊庫中的模塊進行排列組合設計；
[0011] (3)利用釀酒酵母質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化技術，按照步驟（2)的設計，將與所述設計對應的模 塊轉(zhuǎn)入釀酒酵母底盤菌中；
[0012] (4)將步驟（3)轉(zhuǎn)化后的菌在選擇缺陷型培養(yǎng)基上培養(yǎng)，得到步驟（2)所有排列組 合的正確釀酒酵母轉(zhuǎn)化子；
[0013] (5)結(jié)合目標性狀的具體特征篩選得到高效模塊組合的釀酒酵母轉(zhuǎn)化子。
[0014] 待篩選的基因元件庫中的基因元件優(yōu)選為對釀酒酵母目標途徑產(chǎn)生影響的釀酒 酵母內(nèi)源基因或外源基因。
[0015] 內(nèi)源基因元件優(yōu)選木酮糖激酶基因。
[0016] 外源基因優(yōu)選為畢赤酵母木糖還原酶基因、畢赤酵母木糖醇脫氫酶基因、紫色桿 菌素 VioA基因或紫色桿菌素 VioB基因。
[0017] 篩選標記優(yōu)選為Ura3、Hi s3和Leu2或選任意2個。
[0018] 質(zhì)粒是在釀酒酵母中可自主復制的著絲粒型質(zhì)?；蛟卺劸平湍钢锌勺灾鲝椭频?游離型質(zhì)粒。
[0019] 可自主復制的著絲粒型質(zhì)粒優(yōu)選為PRS416Y載體、PRS413Y載體或PRS415Y載體。
[0020] 在釀酒酵母中可自主復制的游離型質(zhì)粒優(yōu)選為PRS425載體或PRS426載體。
[0021] 步驟（2)排列組合的方式為將步驟（1)模塊庫中的模塊按照篩選標記分為2或3 組，從每組中選取一個模塊組成一個組合。
[0022] 釀酒酵母質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化技術優(yōu)選96孔板醋酸鋰轉(zhuǎn)化法。
[0023] 本發(fā)明可以實現(xiàn)在釀酒酵母中多個模塊組合的快速篩選，通過排列組合考察不同 模塊以及多個模塊之間的相互作用對目標代謝途經(jīng)的影響，極大的降低了工作量、提高了 所構(gòu)建系統(tǒng)的靈活性。對篩選結(jié)果的分析可以快速修改原有組合設計。除此之外，所有通 過共轉(zhuǎn)化所得到的組合不用測序，相比以往的方式極大地降低了成本。96孔板酵母質(zhì)粒共 轉(zhuǎn)化技術保障了大量的模塊組合篩選，從而實現(xiàn)了組合模塊在釀酒酵母底盤細胞中的快速 篩選。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0024] 圖1本發(fā)明的過程流程示意圖。
[0025] 圖2為釀酒酵母木糖代謝途徑示意圖。
[0026] 圖3為XR，XDH，XKS模塊構(gòu)建方法示意圖。
[0027] 圖4為載體PRS413Y圖譜。
[0028] 圖5為載體PRS415Y圖譜。
[0029] 圖6為載體PRS416Y圖譜。
[0030] 圖7為64種排列組合的轉(zhuǎn)化子在木糖培養(yǎng)基培養(yǎng)7天后平板結(jié)果。
[0031] 圖8為紫色桿菌素代謝途徑示意圖。
[0032] 圖9為9種排列組合的轉(zhuǎn)化子在SC-Ura-Leu-His培養(yǎng)基劃線48小時后平板結(jié) 果。
[0033] 圖10為酵母三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化64個模塊在96孔板上分布圖。

【具體實施方式】
[0034] 下面通過具體實施例和附圖對本發(fā)明作進一步的說明。
[0035] 下面的實施例是為了使本領域的技術人員能夠更好地理解本發(fā)明，但并不對本發(fā) 明作任何限制。
[0036] 如在下列實施例中沒有明確指出的操作，可以通過本領域技術人員常規(guī)的操作方 法進行。
[0037] 圖1為本發(fā)明的過程流程示意圖。
[0038] 實施例1
[0039] -種高效利用木糖的釀酒酵母模塊組合篩選方法
[0040] 釀酒酵母是傳統(tǒng)的乙醇生產(chǎn)菌株，具備良好的工業(yè)生產(chǎn)性狀。但是，釀酒酵母由 于缺乏木糖代謝途徑中將木糖轉(zhuǎn)化為木酮糖的酶而不能利用木糖，需要導入外源畢赤酵 母木糖還原酶基因（XR)、畢赤酵母木酮糖脫氫酶基因（XDH)以及過表達內(nèi)源木糖醇激酶基 因〇(KS)，見圖2。以帶有不同啟動子的木糖還原酶（XR)、帶有不同啟動子的木糖醇脫氫酶 (XDH)和帶有不同啟動子的木酮糖激酶UKS)模塊組合篩選為案例，篩選優(yōu)化啟動子組合， 得到在木糖培養(yǎng)基中具有更高木糖利用能力的優(yōu)勢菌株，可用于乙醇生產(chǎn)。
[0041] (1)每次從待篩選的啟動子元件庫、包含有XR，XDH，XKS基因的基因元件庫和終 止子元件庫中選擇一個啟動子元件、一個基因元件和一個終止子元件通過Yeast Golden Gate法分別組裝到帶有Ura3、His3、LeU2篩選標記的在釀酒酵母中可以獨立復制的著絲粒 載體上，得到模塊，所有模塊構(gòu)成模塊庫。其中XR基因選用篩選標記為Ura3的PRS416Y載 體、XDH基因選用篩選標記為His3的PRS413Y載體、XKS選用篩選標記為Leu2的PRS415Y 載體。
[0042] 具體步驟：
[0043] ①獲得待篩選的啟動子元件庫和終止子元件庫：
[0044] 在Yeast Golden Gate標準接口的啟動子庫（5'端接口序列為GGTCTCACAGT、3' 端接口序列為AATGAGAGACC)中選取表達強度為強、中強、中、弱四種不冋強度的啟動子兀 件組成啟動子元件庫1，如表1所示。
[0045] 表1啟動子強度及編號
[0046]

【權(quán)利要求】
1. 一種釀酒酵母模塊共轉(zhuǎn)化組合篩選方法，其特征在于包括以下步驟： (1) 每次從待篩選的啟動子元件庫、基因元件庫和終止子元件庫中各選一個元件組裝 到帶有不同篩選標記的質(zhì)粒上得到模塊，不同的模塊中，相同基因元件所選篩選標記相同， 由模塊組成模塊庫，進行測序確保模塊庫中的各模塊序列正確； (2) 對所述模塊庫中的模塊進行排列組合設計； (3) 利用釀酒酵母質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化技術，按照步驟（2)的設計，將與所述設計對應的模塊轉(zhuǎn) 入釀酒酵母底盤菌中； (4) 將步驟（3)轉(zhuǎn)化后的菌在選擇缺陷型培養(yǎng)基上培養(yǎng)，得到步驟（2)所有排列組合的 正確釀酒酵母轉(zhuǎn)化子； (5) 結(jié)合目標性狀的具體特征篩選得到高效模塊組合的釀酒酵母轉(zhuǎn)化子。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種釀酒酵母模塊共轉(zhuǎn)化組合篩選方法，其特征在于所述待 篩選的基因元件庫中的基因元件為對釀酒酵母目標途徑產(chǎn)生影響的釀酒酵母內(nèi)源基因或 外源基因。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種釀酒酵母模塊共轉(zhuǎn)化組合篩選方法，其特征在于所述內(nèi) 源基因元件為木酮糖激酶基因。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種釀酒酵母模塊共轉(zhuǎn)化組合篩選方法，其特征在于所述外 源基因為畢赤酵母木糖還原酶基因、畢赤酵母木糖醇脫氫酶基因、紫色桿菌素 VioA基因或 紫色桿菌素 VioB基因。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種釀酒酵母模塊共轉(zhuǎn)化組合篩選方法，其特征在于所述篩 選標記為Ura3、His3和Leu2或選任意2個。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種釀酒酵母模塊共轉(zhuǎn)化組合篩選方法，其特征在于所述質(zhì) 粒是在釀酒酵母中可自主復制的著絲粒型質(zhì)?；蛟卺劸平湍钢锌勺灾鲝椭频挠坞x型質(zhì)粒。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種釀酒酵母模塊共轉(zhuǎn)化組合篩選方法，其特征在于所述可 自主復制的著絲粒型質(zhì)粒為PRS416Y載體、PRS413Y載體或PRS415Y載體。
8. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種釀酒酵母模塊共轉(zhuǎn)化組合篩選方法，其特征在于所述在 釀酒酵母中可自主復制的游離型質(zhì)粒為PRS425載體或PRS426載體。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1或5所述的一種釀酒酵母模塊共轉(zhuǎn)化組合篩選方法，其特征在于步 驟（2)所述排列組合的方式為將步驟（1)模塊庫中的模塊按照篩選標記分為2或3組，從每 組中選取一個模塊組成一個組合。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種釀酒酵母模塊共轉(zhuǎn)化組合篩選方法，其特征在于所述 釀酒酵母質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化技術是96孔板醋酸鋰轉(zhuǎn)化法。
【文檔編號】C12N1/19GK104419718SQ201310386388
【公開日】2015年3月18日 申請日期:2013年8月29日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月29日
【發(fā)明者】元英進, 林秋卉, 賈斌, 杜昊星, 張文倩, 李炳志 申請人:天津大學