一種果糖基轉(zhuǎn)移酶及其基因、其分泌型表達載體和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種果糖基轉(zhuǎn)移酶，所述果糖基轉(zhuǎn)移酶由SEQ ID NO：2的氨基酸序列組成；還公開了編碼該果糖基轉(zhuǎn)移酶的多核苷酸，含有該多核苷酸的表達載體，轉(zhuǎn)化體，以及應(yīng)用所述果糖基轉(zhuǎn)移酶基因生產(chǎn)果糖基轉(zhuǎn)移酶的方法，構(gòu)建的工程菌搖瓶發(fā)酵酶活最高可達508U/ml，是原始菌株酶活的約41倍。本發(fā)明還涉及所述果糖基轉(zhuǎn)移酶在制備蔗果低聚糖中的應(yīng)用以及利用所述果糖基轉(zhuǎn)移酶制備蔗果低聚糖的方法。
【專利說明】一種果糖基轉(zhuǎn)移酶及其基因、其分泌型表達載體和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種果糖基轉(zhuǎn)移酶，其果糖基轉(zhuǎn)移酶基因及其分泌型表達載體和應(yīng) 用，屬于遺傳工程領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 低聚果糖（FOS)又稱寡果糖或蔗果三糖族低聚糖，是指在果糖基轉(zhuǎn)移酶的作用 下，通過轉(zhuǎn)移果糖基作用生成蔗果三糖，蔗果四糖及蔗果五糖及其混合物。蔗果低聚糖是一 種非還原性糖，具有難消化性、不致齲齒、雙岐桿菌增殖作用及水溶性食用纖維等獨特的生 理活性。
[0003] 果糖基轉(zhuǎn)移酶（fructosyltransferase，EC2. 4. L 9)，屬于糖苷酶32家族。果糖 基轉(zhuǎn)移酶廣泛的存在于生物界，不同微生物來源的果糖基轉(zhuǎn)移酶性質(zhì)不同。微生物果糖基 轉(zhuǎn)移酶作用于蔗糖，進行分子內(nèi)轉(zhuǎn)移果糖基反應(yīng)生成F0S。其中黑曲霉來源的果糖基轉(zhuǎn)移酶 是工業(yè)上主要用微生物來源的酶源。
[0004] 隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，果糖基轉(zhuǎn)移酶分子生物學(xué)始于上世紀(jì)九十年代，1995年， 第1個果糖基轉(zhuǎn)移酶的基因得到克隆。其后，不同物種的果糖基轉(zhuǎn)移酶基因得到研究。其中 對絲狀真菌果糖基轉(zhuǎn)移酶的研究較多，并對一些編碼果糖基轉(zhuǎn)移酶的基因進行了克隆。到 目前為止文獻報道不太多。
[0005] 畢赤酵母表達系統(tǒng)具有表達量高、生產(chǎn)成本低、產(chǎn)物可分泌到胞外和易于后續(xù)修 飾等優(yōu)點，利用畢赤酵母表達的蛋白已有上百種。畢赤酵母近年來已成為倍受青睞的外源 蛋白表達系統(tǒng)。
[0006] 本研究室從黑曲霉中克隆得到黑曲霉果糖基轉(zhuǎn)移酶基因（fts，全長基因）， 構(gòu)建了 pET22b-cFTS，pET22b-cFTSW質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，并構(gòu)建pGAPZA-cFTS， pGAPZ a A-cFTSW質(zhì)粒，線性化后電轉(zhuǎn)化畢赤酵母菌株GS115,得到陽性克隆搖瓶發(fā)酵48h， 測定培養(yǎng)液上清果糖基轉(zhuǎn)移酶（主要在胞外，少量在胞內(nèi)）酶活力最高為508U / ml。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0007] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種新型的果糖基轉(zhuǎn)移酶基因，以得到高表達 果糖基轉(zhuǎn)移酶的工程菌株，例如畢赤酵母菌株，從而得到大量的果糖基轉(zhuǎn)移酶。
[0008] 本發(fā)明人在黑曲霉10(CGMCC3. 316,購自中國微生物菌種保藏管理委員會普通微 生物中心（CGMCC，中國北京朝陽區(qū)大屯路中科院微生物研究所，100101))中克隆得到一種 新型基因，其編碼的蛋白具有果糖基轉(zhuǎn)移酶活性。經(jīng)測序鑒定該基因的基因組核苷酸序列 為SEQ ID NO :1，cDNA序列為SEQ ID NO :3,編碼氨基酸序列為SEQ ID NO :2的蛋白，該蛋 白具有果糖基轉(zhuǎn)移酶活性，為一種果糖基轉(zhuǎn)移酶。本發(fā)明人進一步檢索發(fā)現(xiàn)，該基因序列在 GenBank中沒有登記，屬于一種新基因發(fā)現(xiàn)。在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明人進一步在大腸桿菌和酵 母菌中表達該基因，對其進行功能驗證，從而完成了本發(fā)明。
[0009] 本發(fā)明人將編碼上述果糖基轉(zhuǎn)移酶的核苷酸序列克隆到表達載體中構(gòu)建重組表 達載體。其中所用的表達載體例如，但不限于，分泌型表達載體，包括，但不限于，pET-22b， pGAPZA或pGAPZ α A，這些載體均可從試劑公司購買得到。
[0010] 具體而言，本發(fā)明人將從黑曲霉10中克隆的編碼果糖基轉(zhuǎn)移酶的核苷酸序列按 照常規(guī)分子克隆方法克隆到商購的pET-22b，pGAPZA或pGAPZ a A載體中，構(gòu)建了重組表達 載體 pET22b-cFTS，pET22b-cFTSW，pGAPZA-cFTS 和 pGAPZ a A-cFTSW。其中 pET22b-cFTS 和 pET22b-cFTSW用于在大腸桿菌中進行表達，pGAPZA-cFTS和pGAPZ α A-cFTSW用于在酵母菌 中進行表達。表達后可以獲得具有果糖基轉(zhuǎn)移酶活性的酶蛋白，將其稱為果糖基轉(zhuǎn)移酶。 [0011] 在優(yōu)選的實施方案中，提供一種制備果糖基轉(zhuǎn)移酶的方法，所述方法包括下述步 驟：
[0012] (1)克隆或合成編碼SEQ ID NO :2所示的蛋白的核苷酸序列，并將其克隆到適當(dāng) 的表達載體中，構(gòu)建含有編碼SEQ ID NO :2所示的蛋白的核苷酸序列的重組表達載體；
[0013] (2)將步驟（1)得到的重組表達載體轉(zhuǎn)入適當(dāng)?shù)乃拗骷毎?，進行培養(yǎng)，表達SEQ ID NO :2所示的蛋白。
[0014] 本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解，上述方法還包括純化步驟，純化得到較高純度的果糖 基轉(zhuǎn)移酶。
[0015] 本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解，選擇分泌型載體來構(gòu)建表達本發(fā)明的果糖基轉(zhuǎn)移酶的 重組表達載體，目的是使目標(biāo)蛋白分泌到培養(yǎng)物上清中，而不是形成包涵體，從而得到的培 養(yǎng)物上清液本身就具有理想的果糖基轉(zhuǎn)移酶活性，并且可以經(jīng)過簡單的純化步驟即可得到 具有果糖基轉(zhuǎn)移酶活性的目標(biāo)蛋白，而不要經(jīng)過變性純化和復(fù)性的復(fù)雜過程。
[0016] 本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解，當(dāng)提及本發(fā)明的"果糖基轉(zhuǎn)移酶"時，該術(shù)語除了包括 由SEQ ID NO :2的氨基酸序列組成的蛋白之外，還包括由SEQ ID NO :2的氨基酸序列經(jīng)過 一個或多個氨基酸取代、缺失或插入而得到的具有與SEQ ID NO :2的氨基酸序列相同或相 似的果糖基轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白。
[0017] 因此，本發(fā)明提供下述：
[0018] L 一種果糖基轉(zhuǎn)移酶，其為：
[0019] (1)由SEQ ID NO :2的氨基酸序列組成的蛋白；或
[0020] (2)由SEQ ID NO : 2的氨基酸序列經(jīng)過一個或多個氨基酸取代、缺失或插入而得 到的具有與SEQ ID NO :2的氨基酸序列相同或相似的果糖基轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白。
[0021] 2.編碼第1項所述的果糖基轉(zhuǎn)移酶的多核苷酸序列。
[0022] 3.根據(jù)第2項所述的多核苷酸序列，其為如下⑴或⑵所示：
[0023] (I) SEQ ID NO :1或3或4所示的核苷酸序列；
[0024] (2)在嚴(yán)格條件下與（1)限定的核苷酸序列雜交且編碼具有果糖基轉(zhuǎn)移酶活性的 蛋白質(zhì)的核苷酸序列。
[0025] 4.含有第2或3項所述的編碼果糖基轉(zhuǎn)移酶的多核苷酸序列的重組表達載體。
[0026] 5.根據(jù)第4項所述的表達載體，其特征在于，所述表達載體為分泌型載體。
[0027] 6.根據(jù)第4項所述的表達載體，其中所用的表達載體選自pET_22b，pGAPZA或 pGAPZ a A0
[0028] 7.含有第2項所述的編碼果糖基轉(zhuǎn)移酶的多核苷酸序列或第4項所述的重組表達 載體的重組宿主細胞。
[0029] 8.根據(jù)第7項所述的重組宿主細胞，所述重組宿主細胞為轉(zhuǎn)基因細胞系或基因工 程菌，例如，重組的大腸桿菌或畢赤酵母。
[0030] 9.第2項所述的編碼果糖基轉(zhuǎn)移酶的多核苷酸序列，第4項所述的重組表達載體 或第7或8項所述的重組宿主細胞在果糖基轉(zhuǎn)移酶制劑生產(chǎn)中的應(yīng)用。
[0031] 10. -種制備第1項所述的果糖基轉(zhuǎn)移酶的方法，所述方法包括下述步驟：培養(yǎng)第 7或8項所述的重組宿主細胞，得到第1項所述的果糖基轉(zhuǎn)移酶。
[0032] 11.第1項所述的果糖基轉(zhuǎn)移酶在制備蔗果低聚糖中的應(yīng)用，所述應(yīng)用包括：以蔗 糖為底物，在反應(yīng)體系中加入第1項所述的果糖基轉(zhuǎn)移酶或第7或8項所述的重組宿主細 胞的培養(yǎng)物上清液，酶反應(yīng)后得到蔗果低聚糖，所述蔗果低聚糖包括蔗果三糖、蔗果四糖及 蔗果五糖及其混合物。
[0033] 12. -種制備蔗果低聚糖的方法，所述方法包括：以蔗糖為底物，在反應(yīng)體系中加 入第1項所述的果糖基轉(zhuǎn)移酶或第7或8項所述的重組宿主細胞的培養(yǎng)物上清液，酶反應(yīng) 后得到蔗果低聚糖，所述蔗果低聚糖包括蔗果三糖、蔗果四糖及蔗果五糖及其混合物。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0034] 從下面結(jié)合附圖的詳細描述中，本發(fā)明的上述特征和優(yōu)點將更明顯，其中：
[0035] 圖1顯示（A)重組表達載體pET22b-cFTS的物理圖譜；(B)重組表達載體 pET22b-cFTSW的物理圖譜；
[0036] 圖2顯示（A)重組表達載體pGAPZA-cFTS的物理圖譜；(B)重組表達載體 pGAPZ a A-cFTSW的物理圖譜；
[0037] 圖3顯示轉(zhuǎn)糖基產(chǎn)物的HPLC圖譜（G，葡萄糖；S，蔗糖；GF2,蔗果三糖；GF3,蔗果四 糖）。
[0038] 序列說明
[0039] SEQ ID NO :1果糖基轉(zhuǎn)移酶基因組DNA序列，其由1941個堿基組成，該序列 中含有1個內(nèi)含子，為5'端的第1767位到1820位
[0040] SEQ ID NO :2果糖基轉(zhuǎn)移酶推導(dǎo)的氨基酸序列，由628個氨基酸殘基組成，自 氮端第1 一15位氨基酸殘基是N端信號膚序列
[0041] SEQ ID NO :3果糖基轉(zhuǎn)移酶的cDNA堿基序列，具有N端信號肽序列，由1887 個堿基組成，簡稱cFTS
[0042] SEQ ID NO :4 cFTSW序列，即去掉了 15個氨基酸的N端信號肽序列且不包含 最后的終止密碼子的核苷酸序列
[0043] SEQ ID NO :5果糖基轉(zhuǎn)移酶的N端信號肽序列
【具體實施方式】
[0044] 下面參照具體的實施例進一步描述本發(fā)明，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解，本發(fā) 明并不限于這些具體的實施例。
[0045] 以下通過實施例來進一步闡述本發(fā)明，所描述的實施例是示例性的，僅用于解釋 本發(fā)明，而不能解釋為對本發(fā)明的限制。下列實施例中未注明具體條件的試驗方法，除非另 有說明，本發(fā)明的實施例將采用本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍之內(nèi)的分子生物學(xué)等領(lǐng)域的傳 統(tǒng)技術(shù)。另外，除非另有說明，在本文中，核酸以5'至3'的方向從左向右書寫，氨基酸序列 則以氨基端到羧基端的方向從左到右書寫。基本上都按照常見的分子克隆手冊所述的條件 進行操作。
[0046] 具體步驟如下：
[0047] (1)克隆果糖基轉(zhuǎn)移酶基因；
[0048] (2)構(gòu)建含有果糖基轉(zhuǎn)移酶基因的表達載體；
[0049] (3)表達載體轉(zhuǎn)化受體菌；
[0050] 所述表達載體為分泌型載體，優(yōu)選為pET_22b (購自Novagen)，pGAPZA或 pGAPZ a A (這兩種載體購自Invitrogen)。
[0051] 所述受體菌為大腸桿菌（E. coli BL21)或畢赤酵母。
[0052] (4)培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的受體菌，得到果糖基轉(zhuǎn)移酶。
[0053] 果糖基轉(zhuǎn)移酶酶活測定方法：
[0054] 參照王立梅等（2006,食品與生物技術(shù)學(xué)報25(2))取適當(dāng)稀釋的粗酶液0. 5ml與 25 %的蔗糖溶液（在0. IM pH5. 0磷酸-檸檬酸鹽緩沖液中配制）2ml混合均勻，45 °C下酶 解1小時，100°C煮沸15分鐘終止酶解反應(yīng)。果糖基轉(zhuǎn)移酶活通過測定酶解過程中所釋放 出的葡萄糖（G)和還原糖（R)的含量，按照下式計算酶解過程中所產(chǎn)生的果糖量（F)和被 轉(zhuǎn)移的果糖（Fe)量。
[0055] F=R-G
[0056] Fc=G-F=2G-R
[0057] 在相同條件下，以加入失活酶液的蔗糖溶液作為對照。在上述條件下，以每分鐘轉(zhuǎn) 移1 μ mol果糖所需的酶量為一個果糖轉(zhuǎn)移酶活力單位。
[0058] 材料和試劑：
[0059] 所用限制性內(nèi)切酶，PCR試劑購自NEB公司；RNA提取及反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自 Promega公司；T4DNA連接酶，DNA Marker等購于寶生物公司；pEASY-B載體，大腸桿菌感受 態(tài)細胞DH5 a，BL21，PCR純化試劑盒購自全式金，引物購于華大基因，DNA及質(zhì)粒提取試劑 盒購于天根生物；電轉(zhuǎn)移購自Bio-Rad公司；YPD、以及YPD-Zeocin均按照Invitrogen公司 操作手冊配制；其他試劑均為國內(nèi)外購買的分析純試劑。
[0060] 實施例1 :黑曲霉果糖基轉(zhuǎn)移酶基因的克隆
[0061] 提取黑曲霉10(CGMCC3. 316,購自中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中 心（CGMCC，中國北京朝陽區(qū)大屯路中科院微生物研究所，100101))基因組DNA。設(shè)計引物進 行PCR反應(yīng)，得到黑曲霉果糖基轉(zhuǎn)移酶全基因編碼序列（FTS)，其中所用的引物序列如下：
[0062] sense primer ：
[0063] 5，-TAGGCGGATCCCATGAAGCTTCAAACGGCTTC-3，
[0064] anti-sense primer ：
[0065] 5' -AGGGCGGA ATTCTTA AGACTGACGATCCGGC-3;
[0066] 提取黑曲霉10總RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA。設(shè)計引物進行PCR反應(yīng)，得到黑曲霉果 糖基轉(zhuǎn)移酶cDNA編碼序列（cFTS，為SEQ ID NO :3)，所用的引物序列如下同果糖基轉(zhuǎn)移酶 DNA引物序列。
[0067] pET22b_cFTS 載體的構(gòu)建
[0068] 所用的引物序列同果糖基轉(zhuǎn)移酶DNA序列引物。
[0069] 用BamH I和EcoR I雙酶切擴增的果糖基轉(zhuǎn)移酶cDNA序列（SEQ ID NO :3)與 pET22b (購自Novagen)。經(jīng)酶切的目的片段與載體pET22b用T4DNA連接酶連接過夜，熱激 法轉(zhuǎn)化大腸感受態(tài)細胞，挑選陽性菌株提取質(zhì)粒即得到重組質(zhì)粒pET22b-cFTS。
[0070] 實施例2 :pET22b-cFTSW載體的構(gòu)建
[0071] 引物序列如下：
[0072] cff s-p 11 ：
[0073] 5' -CTCGGAATTCAGCCTCTCCTTCCATGCAGAC-3'
[0074] cffs-p2w ：
[0075] 5, -TAGCGGCCGCAGACTGACGATCCGGCCAAG-3，
[0076] 將利用上述引物擴增得到的果糖基轉(zhuǎn)移酶核苷酸序列命名為cFTSW，其序列見SEQ ID NO :4。
[0077] cFTSW(SEQ ID NO :4)與 cFTS(SEQ ID NO :3)的區(qū)別如下：
[0078] cFTS是包含本身信號肽（蛋白氨基酸序列的前十五個氨基酸）的cDNA序列，由 1887個堿基組成；cFTSW是不包含自身信號肽的cDNA序列，由1839個堿基（不包含最后的 終止子）組成。
[0079] 用EcoR I和Not I雙酶切擴增的cFTSW序列（SEQ ID NO :4)與載體pET22b (購 自Novagen)。經(jīng)酶切的目的片段與載體pET22b用T4DNA連接酶連接過夜，熱激法轉(zhuǎn)化大腸 感受態(tài)細胞，挑選陽性菌株提取質(zhì)粒即得到重組質(zhì)粒pET22b-cFTSW。
[0080] 實施例3 :pGAPZA-cFTS載體的構(gòu)建
[0081] 引物序列如下：
[0082] ffs-pl ：
[0083] 5，-CTCGGAATTCATGAAGCTTCAAACGGCTTC-3'
[0084] cffs-p2 ：
[0085] 5，-TAGCGGCCGCTTAAGACTGACGATCCGGC-3，
[0086] 高保真Tag酶擴增果糖基轉(zhuǎn)移酶cDNA序列（SEQ ID NO :3)，同時擴培含有pGAPZA 質(zhì)粒（購自Invitrogen)大腸桿菌菌株并提取pGAPZA質(zhì)粒。EcoR I和Not I雙酶切擴 增的果糖基轉(zhuǎn)移酶cDNA序列（SEQ ID NO :3)與載體pGAPZA，T4DNA連接酶過夜連接經(jīng)酶 切的目的片段與載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞，挑選陽性菌株提取質(zhì)粒即得到重組質(zhì)粒 pGAPZA-cFTS。
[0087] 實施例4 :pGAPZ a A- cFTSW載體的構(gòu)建
[0088] 所用的引物如下：
[0089] cffs-pl ：
[0090] 5; -CTCGGAATTCGCCTCTCCTTCCATGCAGAC-3;
[0091] cffs-p2w ：
[0092] 5，-TAGCGGCCGCAGACTGACGATCCGGCCAAG-3，
[0093] 高保真Tag酶擴增不含自身信號肽序列的果糖基轉(zhuǎn)移酶cDNA序列（cFTSW，SEQ ID NO :4)，同時擴培含有pGAPZa A質(zhì)粒（購自Invitrogen)的大腸桿菌菌株并提質(zhì)粒。EcoR I和Not I雙酶切擴增的cFTSW序列與pGAPZ a A，T4DNA連接酶過夜連接經(jīng)酶切的目的片段 與載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞，挑選陽性菌株提取質(zhì)粒即得到重組質(zhì)粒pGAPZA-cFTSW。
[0094] 實施例 5 :pET22b-cFTS、pET22b-cFTSW 重組子轉(zhuǎn)化
[0095] 重組的陽性菌株擴培后提取質(zhì)粒，熱激轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21表達菌株。
[0096] 實施例 6 :pGAPZA_cFTS、pGAPZ a A-cFTSW 重組子轉(zhuǎn)化
[0097] 重組的陽性菌株擴培后提取質(zhì)粒，用BspH I單酶切為線性質(zhì)粒，總量為5 - IOug 進行電轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)入畢赤酵母GS115感受態(tài)細胞（畢赤酵母GS115購自Invitrogen，其感受態(tài)細 胞按照常規(guī)方法制備）。電轉(zhuǎn)儀設(shè)置為電壓1500v，電容25uF，電阻200 Ω。
[0098] 實施例7 :重組子的篩選及分子驗證
[0099] 熱激轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21后加入400ul LB培養(yǎng)基，37°C復(fù)蘇后涂布氨芐濃度為 IOOug / ml的LB平板。以長出的單菌落為模板，以基因特異引物進行PCR反應(yīng)，得到相應(yīng) 大小條帶即確定為陽性菌株。
[0100] 電轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115后加入Iml山梨醇溶液，30°C復(fù)蘇后涂布Zeocin濃度為 IOOug / ml的Yro平板，長出的單菌落接種Yro液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，取上清液測定果糖基轉(zhuǎn)移 酶活性，抗生素 Zeocin篩選的陽性畢赤酵母菌落的培養(yǎng)上清液均檢測到果糖基轉(zhuǎn)移酶活 性，由于各菌株表達果糖基轉(zhuǎn)移酶的能力有差別，可以選取果糖基轉(zhuǎn)移酶活性高的工程菌 株用于進一步的研究。
[0101] 實施例8 :PET22b-cFTS、pET22b-cFTSW重組子陽性菌株搖瓶發(fā)酵
[0102] 挑取陽性菌株單菌落，5ml試管培養(yǎng)過夜。取Iml到50ml LB三角瓶中， 37°C，250rpm，搖菌2. 5-3h，置于冰上5分鐘，（菌體溶度為0D6000. 6-0. 8)加入IOmM IPTG50-100ul誘導(dǎo)，25°C，震蕩培養(yǎng)。每隔一段時間取樣測酶活（即，取培養(yǎng)物上清測酶 活），24小時后酶活力達到I. 68U / ml。
[0103] 實施例9 :PGAPZA-cFTS、pGAPZ a A-cFTSW重組子陽性菌株搖瓶發(fā)酵
[0104] 參考Invitrogen公司操作手冊，挑取陽性菌株單菌落接種至5ml YH)培養(yǎng)基中， 28°C，250rpm搖床培養(yǎng)過夜，按1-4%的比例轉(zhuǎn)接到50ml YH)培養(yǎng)基三角瓶中，相同條件培 養(yǎng)，每隔12小時，取樣測酶活（S卩，取培養(yǎng)物上清測酶活），培養(yǎng)48小時后，胞外酶活達到最 高，為 508U / ml。
[0105] 實施例10 :酵母工程菌產(chǎn)果糖基轉(zhuǎn)移酶的酶解產(chǎn)物分析
[0106] 以25%蔗糖為底物，果糖基轉(zhuǎn)移酶含量為8單位每克蔗糖，pH5. 0,45°C下反應(yīng)，每 隔一段時間（例如，反應(yīng)后20分鐘，2小時，12小時，24小時）取適量反應(yīng)混合物進行產(chǎn)物 分析。HPLC分析表明，產(chǎn)物中首先出現(xiàn)的蔗果三糖（GF2)，蔗果四糖（GF3)，最后是蔗果五 糖。反應(yīng)液中果寡糖最高占總質(zhì)量的58%。圖3顯示轉(zhuǎn)糖基產(chǎn)物的HPLC圖譜，圖譜數(shù)據(jù)與 反應(yīng)液中果寡糖最高占總質(zhì)量的58%相一致，該HPLC圖譜中沒有顯示鹿果五糖，反應(yīng)延長 可出現(xiàn)蔗果五糖。
[0107] 應(yīng)該理解，盡管參考其示例性的實施方案，已經(jīng)對本發(fā)明進行具體地顯示和描述， 但是本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)該理解，在不背離由權(quán)利要求書所定義的本發(fā)明的精神和范 圍的條件下，可以在其中進行各種形式和細節(jié)的變化，可以進行各種實施方案的任意組合。
【權(quán)利要求】
1. 一種果糖基轉(zhuǎn)移酶，其為： (1) 由SEQ ID NO :2的氨基酸序列組成的蛋白；或 (2) 由SEQ ID NO :2的氨基酸序列經(jīng)過一個或多個氨基酸取代、缺失或插入而得到的 具有與SEQ ID NO :2的氨基酸序列相同或相似的果糖基轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白。
2. 編碼權(quán)利要求1所述的果糖基轉(zhuǎn)移酶的多核苷酸序列。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的多核苷酸序列，其為如下（1)或（2)所示： (1) SEQ ID NO :1或3或4所示的核苷酸序列； (2) 在嚴(yán)格條件下與（1)限定的核苷酸序列雜交且編碼具有果糖基轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白 質(zhì)的核苷酸序列。
4. 含有權(quán)利要求2或3所述的編碼果糖基轉(zhuǎn)移酶的多核苷酸序列的重組表達載體。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的表達載體，其特征在于，所述表達載體為分泌型載體。
6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的表達載體，其中所用的表達載體選自pET-22b，pGAPZA或 pGAPZ a A〇
7. 含有權(quán)利要求2所述的編碼果糖基轉(zhuǎn)移酶的多核苷酸序列或權(quán)利要求4所述的重組 表達載體的重組宿主細胞。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的重組宿主細胞，所述重組宿主細胞為轉(zhuǎn)基因細胞系或基因工 程菌，例如，重組的大腸桿菌或畢赤酵母。
9. 權(quán)利要求2所述的編碼果糖基轉(zhuǎn)移酶的多核苷酸序列，權(quán)利要求4所述的重組表達 載體或權(quán)利要求7或8所述的重組宿主細胞在果糖基轉(zhuǎn)移酶制劑生產(chǎn)中的應(yīng)用。
10. -種制備權(quán)利要求1所述的果糖基轉(zhuǎn)移酶的方法，所述方法包括下述步驟：培養(yǎng)權(quán) 利要求7或8所述的重組宿主細胞，得到權(quán)利要求1所述的果糖基轉(zhuǎn)移酶。
【文檔編號】C12N15/63GK104419688SQ201310392334
【公開日】2015年3月18日 申請日期:2013年9月2日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月2日
【發(fā)明者】張國青, 鈔亞鵬, 楊敬, 錢世鈞, 石家驥 申請人:中國科學(xué)院微生物研究所