用重組細(xì)胞合成長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及在重組細(xì)胞(例如酵母或植物細(xì)胞)內(nèi)合成長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸(特別是二十碳五烯酸、二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸)的方法。也提供了生產(chǎn)長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸的重組細(xì)胞或植物。此外，本發(fā)明涉及一組新的具有能應(yīng)用于合成長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸的方法的去飽和酶或延長(zhǎng)酶活性的酶。
【專(zhuān)利說(shuō)明】用重組細(xì)胞合成長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸
[0001]本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為2005年4月22日，申請(qǐng)?zhí)枮?00580020696.3，發(fā)明名稱(chēng)為“用重組細(xì)胞合成長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸”的中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明涉及在重組細(xì)胞例如酵母或植物細(xì)胞中合成長(zhǎng)鏈脂肪酸、特別是二十碳五烯酸、二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸的方法。也提供了生產(chǎn)長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸的重組細(xì)胞或植物。此外，本發(fā)明涉及一組新的具有能用于合成長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸的方法的去飽和酶(desaturase)或延長(zhǎng)酶(elongase)活性的酶。
【背景技術(shù)】
[0003]ω-3長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸現(xiàn)在被公認(rèn)為是與人類(lèi)及動(dòng)物健康相關(guān)的重要化合物?？梢詮娘嬍硜?lái)源中直接獲得這些脂肪酸，或者通過(guò)轉(zhuǎn)化亞油酸(LA，ω-6)或α亞麻酸(ALA, ω-3)等脂肪酸可以獲得這些脂肪酸，這兩種脂肪酸都被認(rèn)為是人類(lèi)飲食中的必需脂肪酸。雖然人類(lèi)和多種其他的脊椎動(dòng)物都能將來(lái)自于植物來(lái)源的LA或ALA轉(zhuǎn)化成LC-PUFA，但是它們只能以非常低的效率進(jìn)行這種轉(zhuǎn)化。此外，絕大多數(shù)現(xiàn)代社會(huì)都有著失衡的飲食，其中至少90%的多不飽和脂肪酸是由ω-6脂肪酸組成，而不是4:1或更低的ω-6: ω-3比例，該比例被認(rèn)為是理想的比例(Trautwein, 2001)。人類(lèi)的LC-PUFA例如二十碳五烯酸(EPA, 20:5)和二十二碳六烯酸(DHA，22:6)的直接飲食來(lái)源絕大多數(shù)都來(lái)自于魚(yú)或魚(yú)油。專(zhuān)業(yè)保健人員因此推薦在人體飲食中常規(guī)地包括含有非常高水平LC-PUFA的魚(yú)。魚(yú)類(lèi)來(lái)源的LC-PUFA油越來(lái)越多地被組合到食品中并且被用于嬰兒配方。但是，因?yàn)槿蚝腿珖?guó)漁業(yè)的衰退，需要這些有益的強(qiáng)化健康的油的其他來(lái)源。
[0004]在人類(lèi)飲食中包含co-3LC-PUFA例如EPA和DHA已經(jīng)與許多種健康相關(guān)益處有關(guān)。這些益處包括預(yù)防或減少冠狀動(dòng)脈疾病、高血壓、2型糖尿病、腎臟疾病、類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、潰瘍性結(jié)腸炎和慢性阻塞性肺病，以`及有助于腦部發(fā)育和生長(zhǎng)(SimOpOulOS，2000)。最近，多個(gè)研究也已經(jīng)表明《-3PUFA可以有益于嬰兒營(yíng)養(yǎng)和發(fā)育，以及有益于抗各種精神病例如精神分裂癥、注意力缺陷多動(dòng)癥和Alzheimer病。
[0005]與動(dòng)物相反，高等植物缺少合成鏈長(zhǎng)大于18個(gè)碳的多不飽和脂肪酸的能力。具體地，農(nóng)作物和園藝植物與其他的被子植物都不具有合成源自ALA的長(zhǎng)鏈ω-3脂肪酸例如EPA、DPA和DHA所需的酶。植物生物技術(shù)學(xué)的一個(gè)重要目標(biāo)因此是遺傳工程化產(chǎn)大量LC-PUFA的農(nóng)作物植物，特別是油籽農(nóng)作物，據(jù)此提供了這些化合物的其他來(lái)源。
[0006]LC-PUFA合成的途徑
[0007]通過(guò)如圖1中圖解所示的一系列交替的氧依賴(lài)性的去飽和反應(yīng)和延長(zhǎng)反應(yīng)可以使得在生物體(例如微藻類(lèi)、苔蘚和真菌)體內(nèi)發(fā)生從亞油酸和α亞麻酸脂肪酸向LC-PUFA的生物合成。在一種途徑(圖1，II)中，由Λ 6、Λ5和Λ 4去飽和酶催化去飽和反應(yīng)，每種酶都給脂肪酸碳鏈增加一個(gè)額外雙鍵，而每個(gè)Λ6和△ 5延長(zhǎng)反應(yīng)都添加一個(gè)二碳單位，以延長(zhǎng)碳鏈。因此這些生物體中的ALA向DHA的轉(zhuǎn)化要求三個(gè)去飽和反應(yīng)和兩個(gè)延長(zhǎng)反應(yīng)。已經(jīng)從各種微生物和低等植物例如微藻類(lèi)、苔蘚和真菌中克隆出編碼在該需氧途徑中生產(chǎn)DHA所需的酶的基因。已經(jīng)從脊椎動(dòng)物包括哺乳動(dòng)物中分離出編碼其中一些酶(包括催化第五個(gè)步驟的酶，Δ5延長(zhǎng)酶)的基因(Sayanova and Napier綜述,2004)。但是，從人類(lèi)細(xì)胞中分離到的△ 5延長(zhǎng)酶并非特異于EPA到DPA的反應(yīng)，其對(duì)脂肪酸底物具有廣泛的特異性(Leonard et al.,2002)。
[0008]在一些生物體中，已經(jīng)顯示出存在著ALA到DHA途徑的兩個(gè)部分的其他途徑。在某些原生生物和破囊壺菌(thraustochytrids)中，通過(guò)Δ 9延長(zhǎng)酶和Δ 8去飽和酶的組合(所謂的Λ 8去飽和途徑，見(jiàn)圖1，IV)可以實(shí)現(xiàn)ALA向ETA的轉(zhuǎn)化，如分離到編碼這些酶的基因所證實(shí)的那樣(Wallis and Browse, 1999 ；Qi et al., 2002) ?在哺乳動(dòng)物中，所謂的“Sprecher”途徑可以通過(guò)不依賴(lài)Λ 4去飽和酶的三個(gè)反應(yīng)將DPA轉(zhuǎn)化成DHA (Sprecher etal.，1995)。
[0009]除了這些去飽和酶/延長(zhǎng)酶系統(tǒng)外，通過(guò)多種生物體例如Shewanella、Mortiella、和 Schizhochytrium 中的厭氧途徑也可以合成 EPA 和 DHA(Abbadi et al.,2001)。已經(jīng)從一些細(xì)菌中克隆出編碼這些聚酮化合物合酶(PKS)酶復(fù)合體的操縱子(Morita et al.,2000 ；Metz et al.,2001 ；Tanaka et al., 1999 ；Yazawa,1996 ；Yu et al.,2000 ；W000 / 42195)。已經(jīng)在 Synechococcus 中表達(dá)從 Shewanella spp 中分離到的 EPAPKS操縱子，以便容許其合成EPA (Takeyama et al.，1997)。編碼這些酶的基因排列于相當(dāng)大的操縱子上，還沒(méi)有報(bào)道它們?cè)谵D(zhuǎn)基因植物中的表達(dá)。因此，仍然需要研究厭氧的PKS樣系統(tǒng)對(duì)于轉(zhuǎn)基因合成LC-PUFA是否是更為經(jīng)典的需氧的去飽和酶/延長(zhǎng)酶的可能的替代系統(tǒng)。
[0010]去飽和酶
[0011]已經(jīng)顯示出參 與LC-PUFA的去飽和酶都屬于一組所謂的“前端”去飽和酶，它們的特點(diǎn)是在每種蛋白的N末端都具有細(xì)胞色素b5結(jié)構(gòu)域。細(xì)胞色素b5可能作為去飽和作用所需的電子的受體(Napier et al., 1999 ；Sperling and Heinz, 2001)。
[0012]Λ 5去飽和酶催化C20LC-PUFA的更多的去飽和作用，導(dǎo)致產(chǎn)生了花生四烯酸(ARA, 20:4ω6)和EPA (20:5ω3)。已經(jīng)從多種生物體中分離出編碼這個(gè)酶的基因，生物體包括藻類(lèi)(破囊壺菌(Thraustochytrium sp.) Qiu et al.,2001)、真菌(M.alpine、畸雌腐霉(Pythium irregulare), Michaelson et al., 1998 ；Hong et al.，2002)、秀_ 隱桿線蟲(chóng)(Caenorhabditis elegans)和哺乳動(dòng)物。也已經(jīng)從斑馬魚(yú)中鑒定出編碼雙功能Δ5 / Δ 6去飽和酶的基因(Hasting et al.，2001)。編碼這種酶的基因可能代表“前端去飽和酶”的祖先形式，之后其復(fù)制并進(jìn)化出不同的功能。生產(chǎn)DHA的最后的去飽和步驟是由Λ4去飽和酶催化的，已經(jīng)從淡水原生生物物種纖細(xì)眼蟲(chóng)(Euglena gracilis)和海洋物種破囊壺菌中分離出編碼這個(gè)酶的基因(Qiu et al., 2001 ；Meyer et al.,2003)。
[0013]延長(zhǎng)酶
[0014]已經(jīng)分離出一些編碼PUFA延長(zhǎng)酶的基因(Sayanova and Napier, 2004)。該基因家族的成員與高等植物體內(nèi)的涉及飽和和單不飽和脂肪酸的延長(zhǎng)的延長(zhǎng)酶基因(例如擬南芥屬(Arabidopsis)的FAE1)無(wú)關(guān)。后者的實(shí)例是蕓苔屬(Brassicas)中的芥酸(22:1)。在一些原始生物物種中，通過(guò)在用Λ8去飽和酶進(jìn)行去飽和(圖1，IV部分；“Λ8去飽和”途徑)之前，用C2單位延長(zhǎng)亞油酸或α亞麻酸可以合成LC-PUFA。在這些物種中沒(méi)有檢測(cè)到Λ6去飽和酶和Λ6延長(zhǎng)酶活性。取而代之的是，在這些生物體中檢測(cè)到了 Λ9延長(zhǎng)酶活性，支持這一點(diǎn)的是，最近已經(jīng)從球等鞭金藻(Isochrysis galbana)中分離出了C18 Δ 9 延長(zhǎng)酶(Qi et al.，2002)。
[0015]LC-PUFA的遺傳工程化生產(chǎn)
[0016]已經(jīng)提議將通過(guò)插入這些基因而被遺傳工程化為生產(chǎn)主要LC-PUFA的轉(zhuǎn)基因油籽作物作為營(yíng)養(yǎng)重要的脂肪酸的恒定來(lái)源。但是，由于需要可能來(lái)自不同來(lái)源的基因所編碼的五種新酶的協(xié)同表達(dá)及活性，這一直使得這個(gè)目標(biāo)難以實(shí)現(xiàn)，該提議至今仍是一種推測(cè)。
[0017]通過(guò)共表達(dá)Λ 6延長(zhǎng)酶和Λ6及Λ 5脂肪酸去飽和酶已經(jīng)成功地在酵母中構(gòu)建出產(chǎn)生EPA的LC-PUFA氧依賴(lài)性生物合成的途徑(圖1)，造成了由外源供應(yīng)的亞油酸和α亞麻酸所產(chǎn)生的ARA及EPA的少量的但顯著的蓄積(Beaudoin et al., 2000 ；Zank etal.，2000)。這表明從屬于LC-PUFA合成途徑的基因能在異種生物體中發(fā)揮作用。但是，產(chǎn)生EPA的效率是非常低的。例如，在酵母中表達(dá)了來(lái)自秀麗隱桿線蟲(chóng)、琉璃苣(Boragoofficinalis)和高山被抱霉(Mortierella alpina)的三種基因(Beaudoin et al., 2000)。當(dāng)給轉(zhuǎn)化酵母供應(yīng)18:2gj-3(LA)或18:3ω-3 (ALA)時(shí)，只產(chǎn)生了少量的20:4ω-6或20:
5ω-3，轉(zhuǎn)化效率分別是0.65%和0.3%。其他研究者通過(guò)在酵母中應(yīng)用表達(dá)兩種去飽和酶和一種延長(zhǎng)酶的基因，同樣獲得了非常低效率的EPA的產(chǎn)生(Domergue et al.,2003a ；Zanket al.，2002)。因此，仍需要提高在生物體例如酵母中產(chǎn)生EPA的效率，使得能單獨(dú)地產(chǎn)生需要提供附加的酶步驟的C22PUFA。
[0018]在探索將需氧的LC-PUFA生物合成途徑引入到高等植物(包括油籽作物)內(nèi)的研究中已經(jīng)取得了一些進(jìn)步( 綜述，Sayanova and Napier, 2004 ；Drexler et al., 2003 ；Abbadi et al.，2001)。在轉(zhuǎn)基因的煙草和擬南芥屬中表達(dá)從琉璃苣中分離到的編碼Λ 6脂肪酸去飽和酶的基因，使得在轉(zhuǎn)基因植物中產(chǎn)生了 GLA (18:3ω6)和SDA (18:4ω3)，它們是LC-PUFA的直接前體(Sayanova et al.，1997 ; 1999)。但是，這僅僅提供了單個(gè)第一步驟。
[0019]Domergue等(2003a)在酵母和轉(zhuǎn)基因亞麻子中使用了三種編碼Λ 6_和Λ 5_脂肪酸去飽和酶及Λ6-延長(zhǎng)酶的基因的組合。去飽和酶基因來(lái)自于硅藻三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum),以及延長(zhǎng)酶基因來(lái)自于苔蘚小立碗蘚(Physcomitrellapatens)。對(duì)于酵母細(xì)胞內(nèi)源性產(chǎn)生的Λ 6_脂肪酸，只獲得了較低的延長(zhǎng)產(chǎn)率(即組合第一個(gè)和第二個(gè)酶步驟)，所形成的主要C20PUFA產(chǎn)物是20:2Δ11’14，代表著不需要的副反應(yīng)。Domergue等(2003a)也聲稱(chēng)(沒(méi)有顯示數(shù)據(jù))在轉(zhuǎn)基因亞麻中表達(dá)三種基因的組合，隨后產(chǎn)生了 ARA和EPA，但是生產(chǎn)是無(wú)效率的。他們認(rèn)為在高等植物的種子中存在著如在酵母中觀察到的相同問(wèn)題，以及需要解決在油籽作物中產(chǎn)生LC-PUFA的“瓶頸”。
[0020]W02004 / 071467 (DuPont)報(bào)道了各種去飽和酶和延長(zhǎng)酶在大豆細(xì)胞中的表達(dá)，但是沒(méi)有顯示DHA在重組植物或種子中的合成。
[0021]Abbadi等(2004)描述了在轉(zhuǎn)基因亞麻中表達(dá)去飽和酶和延長(zhǎng)酶的組合的嘗試，但是只獲得了低水平的EPA的合成。
[0022]Abbadi等(2004)表明他們的低水平的EPA的產(chǎn)生也是因?yàn)槲粗摹捌款i”。
[0023]Qi等(2004)在葉中實(shí)現(xiàn)了合成，但是沒(méi)有報(bào)道在種子中的結(jié)果。這是一個(gè)重要的問(wèn)題，因?yàn)長(zhǎng)C-PUFA合成的性能在葉和種子之間可以有所不同。具體地，油籽種子在種子中所儲(chǔ)存的脂質(zhì)大多數(shù)都是TAG，而葉合成的脂質(zhì)大多數(shù)都是磷脂酰脂。此外，Qi等(2004)只產(chǎn)生了 AA和EPA。
[0024]因此，需要更多的在重組細(xì)胞中產(chǎn)生長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸(特別是EPA、DPA和DHA)的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0025]在第一方面，本發(fā)明提供了能合成長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸(LC-PUFA)的重組細(xì)胞，包括一種或多種編碼至少兩種酶的多核苷酸，所述酶是Λ 5 / Λ 6雙功能去飽和酶、Δ 5去飽和酶、Δ 6去飽和酶、Δ5 / Δ6雙功能延長(zhǎng)酶、Δ 5延長(zhǎng)酶、Λ 6延長(zhǎng)酶、Λ 4去飽和酶、Δ 9延長(zhǎng)酶、或△ 8去飽和酶，其中所述一種或多種多核苷酸與能指導(dǎo)所述多核苷酸在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的一種或多種啟動(dòng)子可操縱地連接，其中所述重組細(xì)胞衍生自不能合成所述LC-PUFA的細(xì)胞。
[0026]在第二個(gè)方面，本發(fā)明提供了相對(duì)于等基因非重組細(xì)胞具有增強(qiáng)的合成LC-PUFA的能力的重組細(xì)胞，包括一種或多種編碼至少兩種酶的多核苷酸，所述酶是Λ5 / Λ6雙功能去飽和酶、Δ 5去飽和酶、Δ 6去飽和酶、Δ5 / Δ6雙功能延長(zhǎng)酶、Δ 5延長(zhǎng)酶、Λ 6延長(zhǎng)酶、Λ4去飽和酶、Λ9延長(zhǎng)酶、或Λ 8去飽和酶，其中所述一種或多種多核苷酸與使得能在所述重組細(xì)胞內(nèi)表達(dá)所述多核苷酸的一種或多種啟動(dòng)子可操縱地連接。
[0027]在一個(gè)實(shí)施方式中，至少一種酶是Λ 5延長(zhǎng)酶。
[0028]本
【發(fā)明者】首次鑒定出具有比Λ6延長(zhǎng)酶活性更高的Λ5延長(zhǎng)酶活性的酶。因此，該酶提供了一種在重組細(xì)胞中產(chǎn)生DPA的有效方法，因?yàn)镋PA的Λ 5延長(zhǎng)要優(yōu)于SDA的Λ 6延長(zhǎng)。因此，在一種實(shí)施方式中，Λ 5延長(zhǎng)酶是相對(duì)特異的，即Λ5延長(zhǎng)酶也具有Λ6延長(zhǎng)酶活性，延長(zhǎng)酶在從EPA合成DPA中比其在`從SDA合成ETA中更為有效。
[0029]在另一個(gè)實(shí)施方式中，Λ 5延長(zhǎng)酶包括:
[0030]i)如SEQ ID NO:2所提供的氨基酸序列；
[0031]ii)與SEQ ID NO:2具有至少50%、更優(yōu)選的至少80%、甚至更優(yōu)選的至少90%相同性的氨基酸序列；或
[0032]或ii)的生物學(xué)活性片段。
[0033]在另一個(gè)實(shí)施方式中，Λ5延長(zhǎng)酶可純化自藻類(lèi)。
[0034]在另一個(gè)實(shí)施方式中，其中至少一種酶是Λ 9延長(zhǎng)酶。
[0035]本
【發(fā)明者】首次鑒定出具有Λ 9延長(zhǎng)酶活性和Λ 6延長(zhǎng)酶活性的酶。當(dāng)該酶在具有Λ 6去飽和酶和Δ 8去飽和酶的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)時(shí)，該酶利用兩種可行途徑從ALA產(chǎn)生ΕΤΑ，從LA產(chǎn)生DGLA、或兩者(見(jiàn)圖1)，因此增加了 ETA和/或DGLA產(chǎn)生的效率。因此，在一個(gè)實(shí)施方式中，Λ 9延長(zhǎng)酶也具有Λ 6延長(zhǎng)酶活性。優(yōu)選地，Λ 9延長(zhǎng)酶在從ALA合成ETrA中比其在從SDA合成ETA中更為有效。此外，在另一個(gè)實(shí)施方式中，在酵母細(xì)胞中，Λ 9延長(zhǎng)酶能將SDA延長(zhǎng)為ETAjf GLA延長(zhǎng)為DGLA，或兩者均可。
[0036]在另一個(gè)實(shí)施方式中，Λ 9延長(zhǎng)酶包括:
[0037]i)如 SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:85 或 SEQ ID NO:86 所提供的氨基酸序列；
[0038]ii)與 SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:85 或 SEQ ID NO:86 具有至少 50%、更優(yōu)選的至少80%、甚至更優(yōu)選的至少90%相同性的氨基酸序列；或[0039]或ii)的生物學(xué)活性片段。
[0040]優(yōu)選地，可以從藻類(lèi)或真菌中純化出Λ 9延長(zhǎng)酶。
[0041]本領(lǐng)域公知的是，生物體中的轉(zhuǎn)基因的數(shù)目越多，損害生物體的至少一種適應(yīng)性參數(shù)的可能性就越大，所述適應(yīng)性參數(shù)是例如至少一種轉(zhuǎn)基因的表達(dá)水平、生長(zhǎng)速度、油籽產(chǎn)生、繁殖能力等。因此，需要將重組細(xì)胞中的轉(zhuǎn)基因的數(shù)目最小化。至今為止，本
【發(fā)明者】已經(jīng)提出了多種在細(xì)胞中產(chǎn)生LC-PUFA的策略，這些策略避免了相關(guān)途徑中的每一步驟都對(duì)應(yīng)于一個(gè)基因的需要。
[0042]因此，在另一個(gè)實(shí)施方式中，至少其中一種酶是Λ5 / Λ6雙功能去飽和酶或Δ5 / Λ 6雙功能延長(zhǎng)酶。用淡水魚(yú)種可以天然地產(chǎn)生Λ5 / Λ 6雙功能去飽和酶。
[0043]在一個(gè)【具體實(shí)施方式】中，Λ5 / Λ 6雙功能去飽和酶包括:
[0044]i)如SEQ ID NO:15所提供的氨基酸序列；
[0045]ii)與SEQ ID NO:15具有至少50%、更優(yōu)選的至少80%、甚至更優(yōu)選的至少90%相同性的氨基酸序列；或
[0046]或ii)的生物學(xué)活性片段。
[0047]優(yōu)選地，用淡水魚(yú)種可以天然地產(chǎn)生Λ5 / Λ 6雙功能去飽和酶。
[0048]優(yōu)選地，Λ 5 / Λ 6雙功能延長(zhǎng)酶包括:
[0049]i)如SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:14所提供的氨基酸序列；
[0050]ii)與SEQ ID NO:2或SEQ ID NO: 14具有至少50%、更優(yōu)選的至少80%、甚至更優(yōu)選的至少90%相同性的氨基酸序列；或
[0051]或ii)的生物學(xué)活性片段。
[0052]在另一個(gè)實(shí)施方式中，至少其中一種酶是Λ 5去飽和酶。
[0053]在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，至少其中一種酶是Λ8去飽和酶。
[0054]在另一個(gè)實(shí)施方式中，LC-PUFA是二十二碳六烯酸(DHA)。
[0055]優(yōu)選地，所引入的多核苷酸編碼三種或四種酶，所述酶是Λ5 / Λ6雙功能去飽和酶、Λ 5去飽和酶、Δ 6去飽和酶、Δ5 / Δ6雙功能延長(zhǎng)酶、Δ 5延長(zhǎng)酶、Δ 6延長(zhǎng)酶、或Λ 4去飽和酶。更優(yōu)選地，所述酶是如下組合中的任一組合:
[0056]?) Δ5 / Δ6雙功能去飽和酶、Λ 5 / Λ 6雙功能延長(zhǎng)酶和Λ 4去飽和酶；
[0057]?) Δ5 / Δ6雙功能去飽和酶、Λ 5延長(zhǎng)酶、Λ 6延長(zhǎng)酶和Λ 4去飽和酶；或
[0058]iii) Λ 5去飽和酶、Λ 6去飽和酶、Δ5 / Δ6雙功能延長(zhǎng)酶、和Λ 4去飽和酶。
[0059]在另一個(gè)實(shí)施方式中，LC-PUFA是DHA，以及所引入的多核苷酸編碼五種酶，其中酶是如下組合中的任一組合:
[0060]i) Δ4去飽和酶、Λ 5去飽和酶、Δ 6去飽和酶、Δ 5延長(zhǎng)酶和Λ 6延長(zhǎng)酶；或
[0061]ii) Λ 4去飽和酶、Λ 5去飽和酶、Λ 8去飽和酶、Λ 5延長(zhǎng)酶和Λ 9延長(zhǎng)酶。
[0062]在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，細(xì)胞是適合于發(fā)酵的生物體，酶是至少一種Λ5 / Λ6雙功能去飽和酶、Λ 5延長(zhǎng)酶、Λ 6延長(zhǎng)酶、和Λ 4去飽和酶。
[0063]在另一個(gè)實(shí)施方式中，LC-PUFA是二十二碳五烯酸(DPA)。
[0064]優(yōu)選地，所引入的多核苷酸編碼兩種或三種酶，所述酶是Λ5 / Λ 6雙功能去飽和酶、Λ 5去飽和酶、Δ 6去飽和酶、Δ5 / Δ6雙功能延長(zhǎng)酶、Δ 5延長(zhǎng)酶、或Λ 6延長(zhǎng)酶。更優(yōu)選的，酶是如下組合中的任一組合:[0065]i) Δ5 / Λ 6雙功能去飽和酶和Λ5 / Λ 6雙功能延長(zhǎng)酶；
[0066]?) Δ5 / Δ6雙功能去飽和酶、Λ 5延長(zhǎng)酶、和Λ 6延長(zhǎng)酶；或
[0067]iii) Δ5去飽和酶、Λ 6去飽和酶、Δ5 / Δ6雙功能延長(zhǎng)酶。
[0068]在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，LC-PUFA是DPA，以及所引入的多核苷酸編碼四種酶，其中酶是下面任一的組合:
[0069]?) Δ5去飽和酶、Λ 6去飽和酶、Δ 5延長(zhǎng)酶和Λ 6延長(zhǎng)酶；或
[0070]ii) Λ 5去飽和酶、Λ 8去飽和酶、Δ 5延長(zhǎng)酶和Λ 9延長(zhǎng)酶。
[0071]在另一個(gè)實(shí)施方式中，細(xì)胞是適合于發(fā)酵的生物體，且所述酶至少是Λ5 / Λ6雙功能去飽和酶、Λ 5延長(zhǎng)酶和Λ 6延長(zhǎng)酶。
[0072]在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，LC-PUFA是二十碳五烯酸(EPA)。
[0073]優(yōu)選地，所引入的多核苷酸編碼Λ5 / Λ6雙功能去飽和酶和Λ5 / Λ6雙功能延長(zhǎng)酶。
[0074]在另一個(gè)實(shí)施方式中，所引入的多核苷酸編碼三種酶，其中酶是如下組合中的任
一組合:
[0075]?) Δ5去飽和酶、Λ 6去飽和酶和Λ 6延長(zhǎng)酶；或
[0076]ii) Λ 5去飽和酶、Λ 8去飽和酶和Λ 9延長(zhǎng)酶。
`[0077]至今為止的事實(shí)表明在至少一些重組細(xì)胞(特別是酵母)中所表達(dá)的去飽和酶具有相當(dāng)?shù)偷幕钚?。但是，?br> 【發(fā)明者】已經(jīng)鑒定出酶活性可能是去飽和酶在LC-PUFA合成中利用脂酰輔酶A作為底物的能力的函數(shù)。對(duì)此，也已經(jīng)確定出脊椎動(dòng)物來(lái)源的去飽和酶對(duì)于在重組細(xì)胞例如植物細(xì)胞、種子、或酵母中產(chǎn)生LC-PUFA是特別有用的。因此，在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，重組細(xì)胞包括:
[0078]i)至少一種催化細(xì)胞內(nèi)的EPA轉(zhuǎn)化成DPA的Λ 5延長(zhǎng)酶；或
[0079]ii)至少一種能作用于脂酰輔酶A底物的去飽和酶；或
[0080]iii)至少一種來(lái)自脊椎動(dòng)物的去飽和酶或其去飽和酶變體；或
[0081]iv)i)、ii)或 iii)的任一組合。
[0082]在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，Λ 5延長(zhǎng)酶包括:
[0083]i)如SEQ ID NO:2提供的氨基酸序列；
[0084]ii)與SEQ ID NO:2具有至少50%相同性的氨基酸序列；或
[0085]或ii)的生物學(xué)活性片段。
[0086]能作用于脂酰輔酶A底物或來(lái)自脊椎動(dòng)物的去飽和酶可以是Λ 5去飽和酶、Λ 6去飽和酶或兩者。在一個(gè)【具體實(shí)施方式】中，去飽和酶包括:
[0087]i)如 SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:21 或 SEQ ID NO:22 提供的氨基酸序列；
[0088]ii)與 SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:21 或 SEQ ID NO:22 具有至少 50%相同性的氨
基酸序列；或
[0089]或ii)的生物學(xué)活性片段。
[0090]優(yōu)選地，至少一種去飽和酶是由脊椎動(dòng)物天然產(chǎn)生的。
[0091]或者，當(dāng)細(xì)胞是酵母細(xì)胞時(shí)，LC-PUFA是DHA，且所述酶至少是Λ 5/Λ 6雙功能去飽和酶、Λ 5延長(zhǎng)酶、Λ 6延長(zhǎng)酶、和Λ 4去飽和酶。
[0092]或者，當(dāng)細(xì)胞是酵母細(xì)胞時(shí)，LC-PUFA是DPA，且所述酶至少是Λ 5/ Λ 6雙功能去飽和酶、Λ 5延長(zhǎng)酶和Λ 6延長(zhǎng)酶。
[0093]盡管細(xì)胞可以是任一細(xì)胞類(lèi)型，優(yōu)選地，所述細(xì)胞能從內(nèi)源性產(chǎn)生的亞油酸(LA)、α亞麻酸(ALA)或兩者產(chǎn)生所述的LC-PUFA。更優(yōu)選地，內(nèi)源性產(chǎn)生的ALA與LA的比例至少是1:1或至少是2:1。
[0094]在一個(gè)實(shí)施方式中，細(xì)胞是植物細(xì)胞、被子植物的植物細(xì)胞、油籽種子植物細(xì)胞、或種子中的細(xì)胞。優(yōu)選地，至少一種啟動(dòng)子是種子特異性啟動(dòng)子。
[0095]在另一個(gè)實(shí)施方式中，細(xì)胞是單細(xì)胞的微生物。優(yōu)先地，單細(xì)胞的微生物適合于發(fā)酵。優(yōu)選地，微生物是酵母。
[0096]在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，細(xì)胞是非人類(lèi)動(dòng)物細(xì)胞或體外的人體細(xì)胞。
[0097]在進(jìn)一步的實(shí)施方式中， 重組細(xì)胞產(chǎn)生了 LC-PUFA，其整合于所述細(xì)胞的三酰甘油內(nèi)。更優(yōu)選地，在所述細(xì)胞中所產(chǎn)生的至少50%的LC-PUFA整合于三酰甘油內(nèi)。
[0098]在另一個(gè)實(shí)施方式中，至少?gòu)脑孱?lèi)基因中獲得了一種、兩種或多種多核苷酸的蛋白編碼區(qū)。優(yōu)選地，藻類(lèi)基因是來(lái)自于巴夫藻(Pavlova)屬,例如來(lái)自Pavlova Salina0
[0099]在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了能由脂肪酸例如ALA、LA、GLA、ARA、SDA、ETA、EPA、或它們的任一組合或混和物產(chǎn)生DHA的重組細(xì)胞，其中所述重組細(xì)胞衍生自不能合成DHA的細(xì)胞。
[0100]在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供了能由脂肪酸例如ALA、LA、GLA、ARA、SDA、ETA、EPA、或它們的任一組合或混和物產(chǎn)生DPA的重組細(xì)胞，其中所述重組細(xì)胞衍生自不能合成DPA的細(xì)胞。
[0101]仍在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供了能由脂肪酸例如ALA、LA、GLA、SDA、ETA、EPA、或它們的任一組合或混和物產(chǎn)生EPA的重組細(xì)胞，其中所述重組細(xì)胞衍生自不能合成EPA的細(xì)胞。
[0102]在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了能由ALA產(chǎn)生ETrA和由SDA產(chǎn)生ETA、以及能由脂肪酸例如ALA、LA、GLA、SDA、ETA、或它們的任一組合或混和物產(chǎn)生EPA的重組細(xì)胞，其中所述重組細(xì)胞衍生自不能合成ETrA、ETA或兩者的細(xì)胞。
[0103]在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供了能用于發(fā)酵過(guò)程的生物體的重組細(xì)胞，其中所述細(xì)胞能由LA、ALA、花生四烯酸(ARA)、二十碳四烯酸(ETA)、或它們的任一組合或混和產(chǎn)生DPA，其中所述重組細(xì)胞衍生自不能合成DPA的細(xì)胞。
[0104]在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了能由LA、ALA、EPA、或它們的任一組合或混和產(chǎn)生DPA的重組植物細(xì)胞，其中植物細(xì)胞來(lái)自被子植物。
[0105]在一個(gè)實(shí)施方式中，植物細(xì)胞還能產(chǎn)生DHA。
[0106]仍在另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了能合成DGLA的重組細(xì)胞，包括編碼下面的一種或兩種多肽的多核苷酸:
[0107]a) 一種多肽，其是Λ 9延長(zhǎng)酶，其中Λ 9延長(zhǎng)酶選自以下一組:
[0108]i)包括如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:85或SEQ ID NO:86提供的氨基酸序列的多肽；
[0109]ii)包括與 SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:85 或 SEQ ID NO:86 具有至少 40%相同性的氨基酸序列的多肽；和
[0110]或ii)的生物學(xué)活性片段，和/或[0111]b) 一種多肽，其是λ 8去飽和酶，其中Δ 8去飽和酶選自以下一組:
[0112]i)包括如SEQ ID NO:1提供的氨基酸序列的多肽；
[0113]ii)包括與SEQ ID NO:1具有至少40%相同性的氨基酸序列的多肽；和
[0114]或ii)的生物學(xué)活性片段，
[0115]其中多核苷酸與一種或多種能指導(dǎo)所述多核苷酸在細(xì)胞表達(dá)的啟動(dòng)子可操縱地連接，且其中所述重組細(xì)胞衍生自不能合成DGLA的細(xì)胞。
[0116]在一個(gè)實(shí)施方式中，細(xì)胞能將DGLA轉(zhuǎn)化成ARA。
[0117]在另一個(gè)實(shí)施方式中，細(xì)胞還包括編碼Δ 5去飽和酶的多核苷酸，其中編碼Λ5去飽和酶的多核苷酸與一種或多種能指導(dǎo)所述多核苷酸在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的啟動(dòng)子可操縱地連接，且其中細(xì)胞能產(chǎn)生ARA。
[0118]在具體的實(shí)施方式中，細(xì)胞缺乏ω 3去飽和酶活性，并且不能產(chǎn)生ALA。這些細(xì)胞可以是天然存在的，或者通過(guò)用本領(lǐng)域公知的技術(shù)降低細(xì)胞的ω3去飽和酶活性可以產(chǎn)生這些細(xì)胞。
[0119]優(yōu)選地，細(xì)胞是植物細(xì)胞或者是適合于發(fā)酵的生物體的細(xì)胞。
[0120]在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，本發(fā)明的重組細(xì)胞具有實(shí)施將EPA轉(zhuǎn)化成DHA的“Sprecher”途徑所需的酶。這些酶可能是細(xì)胞天然具有的或者重組產(chǎn)生的。這些酶至少包括一種Δ7延長(zhǎng)酶、Δ 6去飽和酶和將二十四碳六烯酸過(guò)氧化物酶體β氧化產(chǎn)生DHA所需的酶。
[0121]本
【發(fā)明者】已經(jīng)鑒定出一組新的去飽和酶和延長(zhǎng)酶。因此，本發(fā)明的進(jìn)一步的方面涉及這些酶以及它們的同源物/變體/衍生物。
[0122]多肽可以是融合蛋白，其還包括至少一種其他的多肽序列。
[0123]所述的至少一種其他的多肽可以是增強(qiáng)本發(fā)明多肽的穩(wěn)定性的多肽，或者是有助于純化融合蛋白的多肽。
[0124]也提供了分離的多核苷酸，其編碼本發(fā)明的多肽。
[0125]在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供了包括或編碼本發(fā)明的多核苷酸的載體。優(yōu)選地，多核苷酸與種子特異性啟動(dòng)子可操縱地連接。
[0126]在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了包括本發(fā)明的分離的多核苷酸的重組細(xì)胞。
[0127]在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供了產(chǎn)生能合成一種或多種LC-PUFA的細(xì)胞的方法，所述方法包括將一種或多種編碼至少兩種酶的多核苷酸引入到細(xì)胞內(nèi)，所述酶是Δ5/Δ6雙功能去飽和酶、Δ 5去飽和酶、Δ 6去飽和酶、Δ5/Δ6雙功能延長(zhǎng)酶、Δ 5延長(zhǎng)酶、Δ6延長(zhǎng)酶、Δ4去飽和酶、Δ9延長(zhǎng)酶、或Δ 8去飽和酶，其中所述一種或多種多核苷酸與能指導(dǎo)所述多核苷酸在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的啟動(dòng)子可操縱地連接。
[0128]在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了產(chǎn)生具有增強(qiáng)的合成一種或多種LC-PUFA的能力的重組細(xì)胞，方法包括將一種或多種編碼至少兩種酶的多核苷酸引入到第一細(xì)胞，所述酶是Λ 5/Λ 6雙功能去飽和酶、Λ 5去飽和酶、Λ 6去飽和酶、Λ 5/Λ 6雙功能延長(zhǎng)酶、Λ 5延長(zhǎng)酶、Λ 6延長(zhǎng)酶、Δ 4去飽和酶、Δ 9延長(zhǎng)酶、或Λ 8去飽和酶，其中所述一種或多種多核苷酸與一種或多種能指導(dǎo)所述多核苷酸在重組細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的啟動(dòng)子可操縱地連接，且其中所述重組細(xì)胞相對(duì)于所述的第一細(xì)胞具有增強(qiáng)的合成所述一種或多種LC-PUFA的能力。
[0129]自然要明白，與本發(fā)明的重組細(xì)胞有關(guān)的在此所述的每個(gè)實(shí)施方式都功能等同地應(yīng)用于產(chǎn)生所述細(xì)胞的方法。
[0130]在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明的方法所產(chǎn)生的細(xì)胞。
[0131]在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了包括本發(fā)明的至少一種重組細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因植物。
[0132]優(yōu)選地，植物是被子植物。更優(yōu)選地，植物是油籽植物。
[0133]在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，轉(zhuǎn)基因植物或其包括轉(zhuǎn)基因種子的部分不包括編碼酶的轉(zhuǎn)基因，所述酶優(yōu)先地將ω 6LC-PUFA轉(zhuǎn)化成ω -3LC-PUFA。
[0134]在仍進(jìn)一步的實(shí)施方式中，轉(zhuǎn)基因植物或其包括轉(zhuǎn)基因種子的部分包括編碼Λ8去飽和酶和/或Λ 9延長(zhǎng)酶的轉(zhuǎn)基因。
[0135]在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供了產(chǎn)生油籽的方法，所述方法包括:
[0136]i)在合適的條件下生長(zhǎng)本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因的油籽植物，和
[0137]ii)收集植物的種子。
[0138]在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物的一部分，其中相對(duì)于等基因的非轉(zhuǎn)化的植物的對(duì)應(yīng)部分，所述部分在其脂肪酸中包含水平升高的LC-PUFA。
[0139]優(yōu)選地，所述植物部分選自但不限于由種子、葉、莖、花、花粉、根或?qū)ｉT(mén)的儲(chǔ)藏器官(例如塊莖)構(gòu)成的組。
[0140]先前還沒(méi)有顯示出可以在植物種子中產(chǎn)生LC-PUFA，這些LC-PUFA也不能被整合于植物油例如三酰甘油內(nèi)。
`[0141]因此，在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了包括LC-PUFA的轉(zhuǎn)基因種子。
[0142]優(yōu)選地，LC-PUFA選自:
[0143]i)EPA,
[0144]ii)DPA,
[0145]iii)DHA,
[0146]i v) EPA 和 DPAJP
[0147]v) EPA、DHA 和 DPA。
[0148]更優(yōu)選地，LC-PUFA選自:
[0149]i)DPA,
[0150]ii)DHA，或
[0151]iii)DHA 和 DPA。
[0152]甚至更優(yōu)選地，LC-PUFA是 EPA、DHAjP DPA。
[0153]優(yōu)選地，種子源自產(chǎn)LA和/或ALA的等基因非轉(zhuǎn)基因種子。更優(yōu)選地，等基因非轉(zhuǎn)基因種子的脂肪酸包括比LA更高濃度的ALA。甚至更優(yōu)選地，等基因非轉(zhuǎn)基因種子的脂肪酸包括至少約13% ALA或至少約27% ALA或至少約50% ALA。
[0154]優(yōu)選地，種子油中的總脂肪酸包括至少9%的C20脂肪酸。
[0155]優(yōu)選地，種子源自油籽植物。更優(yōu)選地，油籽植物是油籽油菜(Brassica napus)、玉米(Zea mays) > 向曰葵(Helianthus annuus)、大豆(Glycine max)、高梁(Sorghumbicolor)、亞麻(Linum usitatissimum)、鹿糖(Saccharum officinarum)、舌甘菜(Betavulgaris)、棉花(Gossypium hirsutum)、花生(Arachis hypogaea)、磐粟(Papaversomniferum)、芥菜(Sinapis alba)、蓖麻(Ricinus communis)、芝麻(Sesamum indicum)、或紅花(Carthamus tinctorius)。[0156]優(yōu)選的是種子具有與等基因非轉(zhuǎn)基因種子基本相同的發(fā)芽率。
[0157]更優(yōu)選的是種子的發(fā)芽時(shí)機(jī)與等基因非轉(zhuǎn)基因種子的發(fā)芽時(shí)機(jī)基本相同。
[0158]優(yōu)選地，至少25 %、或至少50 %、或至少75 %的LC-PUFA構(gòu)成了種子中的三酰甘油的部分。
[0159]出乎意料的是，本
【發(fā)明者】已經(jīng)發(fā)現(xiàn)利用本發(fā)明的方法所產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因種子具有與等基因非轉(zhuǎn)基因種子基本相同的ALA和LA水平。因此，優(yōu)選的是，轉(zhuǎn)基因種子具有與等基因非轉(zhuǎn)基因種子基本相同的ALA和LA水平。此外，出乎意料地發(fā)現(xiàn)，利用本發(fā)明的方法所產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因種子降低了單不飽和脂肪酸的水平。因此，在更優(yōu)選的實(shí)施方式中，轉(zhuǎn)基因種子比等基因非轉(zhuǎn)基因種子具有降低了水平的單不飽和脂肪酸。
[0160]在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了生產(chǎn)本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因種子的方法，所述方法包括:
[0161]i)將一種或多種編碼至少兩種酶的多核苷酸引入到種子的祖細(xì)胞中，所述酶是Λ 5/Λ 6雙功能去飽和酶、Λ 5去飽和酶、Λ 6去飽和酶、Λ 5/Λ 6雙功能延長(zhǎng)酶、Λ 5延長(zhǎng)酶、Λ 6延長(zhǎng)酶、Δ 4 去飽和酶、Δ 9延長(zhǎng)酶、或Λ 8去飽和酶，其中所述一種或多種多核苷酸與一種或多種能指導(dǎo)所述多核苷酸在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的啟動(dòng)子可操縱地連接，據(jù)此產(chǎn)生重組的祖細(xì)胞；
[0162]ii)培養(yǎng)所述的重組祖細(xì)胞，以便產(chǎn)生包括所述轉(zhuǎn)基因種子的植物；和
[0163]iii)從所產(chǎn)植物中收集種子。
[0164]在仍進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供了生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因種子的方法，其包括培養(yǎng)產(chǎn)本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因種子的轉(zhuǎn)基因植物，并從植物中采收所述的轉(zhuǎn)基因種子。
[0165]在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物、或本發(fā)明的植物部分、或本發(fā)明的種子的提取物，其中相對(duì)于等基因非轉(zhuǎn)化植物的相應(yīng)提取物，所述提取物在其脂肪酸中包含水平升高的LC-PUFA。
[0166]優(yōu)選地，提取物是基本上純化的油，其包括至少50%三酰甘油。
[0167]在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供了非人類(lèi)的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，其包括至少一種本發(fā)明的重組細(xì)胞。
[0168]也提供了產(chǎn)生LC-PUFA的方法，所述方法包括在合適的條件下培養(yǎng)本發(fā)明的重組細(xì)胞。
[0169]在一個(gè)實(shí)施方式中，細(xì)胞是適合于發(fā)酵的生物體的細(xì)胞，且所述方法還包括將細(xì)胞暴露于至少一種LC-PUFA前體。
[0170]優(yōu)選地，LC-PUFA前體是至少一種亞油酸或α-亞麻酸。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，用植物油提供LC-PUFA前體。
[0171]在另一個(gè)實(shí)施方式中，細(xì)胞是藻類(lèi)細(xì)胞，以及方法還包括在合適的條件下生長(zhǎng)藻類(lèi)細(xì)胞，以便產(chǎn)生所述的LC-PUFA。
[0172]在進(jìn)一步的不服那，本發(fā)明提供了生產(chǎn)一種或多種LC-PUFA的方法，所述方法包括在合適的條件下培養(yǎng)本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物。
[0173]在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了生產(chǎn)包括至少一種LC-PUFA的油的方法，其包括獲得本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物、或本發(fā)明的植物部分、或本發(fā)明的種子，以及從所述植物、植物部分或種子中提取出油。
[0174]優(yōu)選地，通過(guò)壓榨所述種子從種子中提取出所述的油。[0175]在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了由EPA產(chǎn)生DPA的方法，所述方法包括在合適的條件下將EPA暴露于本發(fā)明的多肽和脂肪酸前體。
[0176]在一個(gè)實(shí)施方式中，可以在細(xì)胞內(nèi)實(shí)現(xiàn)方法，其利用聚酮化合物樣系統(tǒng)生產(chǎn)EPA。
[0177]在仍另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了發(fā)酵過(guò)程，其包括步驟:
[0178]i)提供含有液體組合物的容器，所述液體組合物包括本發(fā)明的細(xì)胞以及發(fā)酵和脂肪酸生物合成所需的組分；和
[0179]ii)提供有助于所述容器中所含的液體組合物的發(fā)酵的條件。
[0180]優(yōu)選地，發(fā)酵和脂肪酸生物合成所需的組分是LA。
[0181]優(yōu)選地，細(xì)胞是酵母細(xì)胞。
[0182]在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了包括本發(fā)明的細(xì)胞、或其提取物或其包括LC-PUFA的部分、以及合適載體的組合物。
[0183]在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了包括本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物、或本發(fā)明的植物部分、或本發(fā)明的種子、或其提取物或其包括LC-PUFA的部分、以及合適載體的組合物。
[0184]在仍另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了包括本發(fā)明的細(xì)胞、本發(fā)明的植物、本發(fā)明的植物部分、本發(fā)明的種子、本發(fā)明的提取物、本發(fā)明的方法的產(chǎn)物、或本發(fā)明的發(fā)酵過(guò)程的產(chǎn)物、或本發(fā)明的組合物的飼料。
[0185]優(yōu)選地，飼料至少包括DPA，其中用細(xì)胞內(nèi)的重組酶進(jìn)行至少一個(gè)DPA生產(chǎn)中的酶
反應(yīng)。`
[0186]此外，優(yōu)選的是飼料至少包括DHA，其中用細(xì)胞內(nèi)的重組酶進(jìn)行至少一個(gè)DPA生產(chǎn)中的酶反應(yīng)。
[0187]在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供了制備飼料的方法，所述方法包括混和本發(fā)明的細(xì)胞、本發(fā)明的植物、本發(fā)明的植物部分、本發(fā)明的種子、本發(fā)明的提取物、本發(fā)明的方法的產(chǎn)物、本發(fā)明的發(fā)酵過(guò)程的產(chǎn)物、或本發(fā)明的組合物和合適的載體。
[0188]優(yōu)選地，飼料是給哺乳動(dòng)物或魚(yú)食用的飼料。
[0189]在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供了增加生物體中的LC-PUFA水平的方法，所述方法包括給生物體施用本發(fā)明的細(xì)胞、本發(fā)明的植物、本發(fā)明的植物部分、本發(fā)明的種子、本發(fā)明的提取物、本發(fā)明的方法的產(chǎn)物、本發(fā)明的發(fā)酵過(guò)程的產(chǎn)物、或本發(fā)明的組合物、或本發(fā)明的飼料。
[0190]優(yōu)選地，施用途徑是口服。
[0191]優(yōu)選地，生物體是脊椎動(dòng)物。更優(yōu)選地，脊椎動(dòng)物是人、魚(yú)、寵物或家畜動(dòng)物。
[0192]在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供了治療或預(yù)防可從LC-PUFA中獲益的疾病的方法，所述方法包括給對(duì)象施用本發(fā)明的細(xì)胞、本發(fā)明的植物、本發(fā)明的植物部分、本發(fā)明的種子、本發(fā)明的提取物、本發(fā)明的方法的產(chǎn)物、本發(fā)明的發(fā)酵過(guò)程的產(chǎn)物、或本發(fā)明的組合物、或本發(fā)明的飼料。
[0193]優(yōu)選地，疾病是心律不齊、血管成形術(shù)、炎癥、哮喘、牛皮癬、骨質(zhì)疏松癥、腎結(jié)石、AIDS、多發(fā)性硬化、類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、Crohn病、精神分裂癥、癌癥、胎兒乙醇綜合征、注意缺陷多動(dòng)癥、囊性纖維化、苯丙酮尿癥、單相抑郁癥、進(jìn)攻性敵意(aggressive hostility)、腦白質(zhì)腎上腺萎縮癥、冠狀動(dòng)脈疾病、高血壓、糖尿病、肥胖癥、Alzheimer病、慢性阻塞性肺病、潰瘍性結(jié)腸炎、血管成形術(shù)后再狹窄、濕疹、高血壓、血細(xì)胞聚集、胃腸道出血、子宮內(nèi)膜異位癥、經(jīng)前綜合征、肌痛性腦脊髓炎、病毒感染后慢性疲勞或眼部疾病。
[0194]雖然給對(duì)象提供任一量的LC-PUFA都將有益于對(duì)象，但是優(yōu)選地施用治療疾病的
有效量。
[0195]在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明的細(xì)胞、本發(fā)明的植物、本發(fā)明的植物部分、本發(fā)明的種子、本發(fā)明的提取物、本發(fā)明的方法的產(chǎn)物、本發(fā)明的發(fā)酵過(guò)程的產(chǎn)物、或本發(fā)明的組合物、或本發(fā)明的飼料在制備用于治療或預(yù)防可從LC-PUFA中獲益的疾病的藥物中的用途。
[0196]先前已經(jīng)在酵母中表達(dá)秀麗隱桿線蟲(chóng)Λ6延長(zhǎng)酶，其已經(jīng)顯示出能將十八碳四烯酸轉(zhuǎn)化成二十碳四烯酸。但是，本
【發(fā)明者】已經(jīng)出乎意料地發(fā)現(xiàn)該酶也具有Λ5延長(zhǎng)酶活性，能將二十碳五烯酸轉(zhuǎn)化成二十二碳五烯酸。
[0197]在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了生產(chǎn)包括22個(gè)碳原子的不分支的LC-PUFA的方法，所述方法包括將不分支的20個(gè)碳原子的LC-PUFA與多肽一起溫育，所述多肽選自以下一組: [0198]i)包括如SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:14提供的氨基酸序列的多肽；
[0199]ii)包括與SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:14具有至少50%相同性的氨基酸序列的多肽，和
[0200]或ii)的生物學(xué)活性片段，
[0201]其中多肽也具有Λ 6延長(zhǎng)酶活性。
[0202]優(yōu)選地，包括22個(gè)碳原子的不分支的LC-PUFA是DPA，以及不分支的20個(gè)碳原子的 LC-PUFA 是 EPA。
[0203]優(yōu)選地，在重組細(xì)胞內(nèi)實(shí)施生產(chǎn)多肽和EPA的方法。
[0204]在仍進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供了基本上純化的抗體、或其片段，所述抗體或其片段與本發(fā)明的多肽特異性結(jié)合。
[0205]在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了鑒定出能合成一種或多種LC-PUFA的重組細(xì)胞、組織或生物體的方法，所述方法包括檢測(cè)在所述細(xì)胞、組織或生物體中是否存在一種或多種多核苷酸，所述多核苷酸編碼至少兩種酶，所述酶是Λ 5/ Λ 6雙功能去飽和酶、Λ 5去飽和酶、Λ 6去飽和酶、Δ5/Δ6雙功能延長(zhǎng)酶、Δ 5延長(zhǎng)酶、Δ 6延長(zhǎng)酶、Δ 4去飽和酶、Δ 9延長(zhǎng)酶、或△ 8去飽和酶，其中所述一種或多種多核苷酸與一種或多種能指導(dǎo)所述多核苷酸在細(xì)胞、組織或生物體內(nèi)表達(dá)的啟動(dòng)子可操縱地連接。
[0206]優(yōu)選地，方法包括核酸擴(kuò)增步驟、核酸雜交步驟、檢測(cè)細(xì)胞、組織或生物體內(nèi)是否存在轉(zhuǎn)基因的步驟、或確定出細(xì)胞、組織或生物體內(nèi)的脂肪酸含量或組成的步驟。
[0207]優(yōu)選地，生物體是動(dòng)物、植物、被子植物或微生物。
[0208]在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了由EPA產(chǎn)生DPA的方法，所述方法包括在合適的條件下將EPA暴露于本發(fā)明的Λ 5延長(zhǎng)酶和脂肪酸前體。
[0209]優(yōu)選地，在細(xì)胞內(nèi)實(shí)現(xiàn)利用聚酮化合物樣系統(tǒng)產(chǎn)生EPA的方法。
[0210]包括在此所提供的新的多核苷酸的重組(轉(zhuǎn)基因)細(xì)胞、植物、非人類(lèi)動(dòng)物也可以天然地產(chǎn)生其他的延長(zhǎng)酶和/或去飽和酶，例如在此所定義的延長(zhǎng)酶和/或去飽和酶。
[0211]顯而易見(jiàn)的是，本發(fā)明的一個(gè)方面的優(yōu)選的特點(diǎn)和特征都可應(yīng)用于本發(fā)明的許多其他的部分。[0212]在本說(shuō)明書(shū)全文中，詞語(yǔ)“包括”或“包含”都被理解為包含給定的元件、整體或步驟、或元件、整體或步驟的組，但不排除任何其他的元件、整體或步驟、或元件、整體或步驟的組。
[0213]此后通過(guò)下面的非限制性實(shí)施例并參照附圖描述本發(fā)明。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0214]圖1: ω3和ω6LC-PUFA合成的可能途徑。標(biāo)記為Ι、ΙΙ、ΙΙΙ和IV的部分分別對(duì)應(yīng)于ω6(Λ6)、ω3(Λ6)、ω6(Λ8)、和ω3(Λ)途徑。I和II部分中的化合物是ω6化合物,而II和IV部分中的那些化合物是ω 3化合物?！癉es”表示途徑中的經(jīng)所示的去飽和酶催化的去飽和酶步驟，而“Elo”表示經(jīng)所示的延長(zhǎng)酶催化的延長(zhǎng)酶步驟。虛線箭頭代表在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行的用于由DPA產(chǎn)生DHA的“Sprecher”途徑中的步驟。
[0215]圖2:LC_PUFA在微藻類(lèi)綱中的分布。綠藻綱和Prasinophyceae被描述為“綠藻” ；Eustigmatophyceae為“黃綠藻”；紅藻綱為“紅藻”、以及Bacillariophyceae和Prymnesiophyceae為娃藻和金褐藻。
[0216]圖3:用于在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)LC-PUFA生物合成途徑的遺傳構(gòu)建體。
[0217]圖4:去飽和酶的PILEUP。d8_atg-Pavlova salina Δ 8去飽和酶、眼蟲(chóng)屬(euglena) -AAD45877 ( Λ 8 去飽和酶，纖細(xì)眼蟲(chóng))、根霉屬(rhizopus) -AAP83964 ( Δ 6去飽和酶、根霉屬NK030037)、毛霉菌屬(mucor) -BAB69055 ( Λ 6去飽和酶，Mucorcircinelloides) > mortierella-AAL73948 ( Δ 6 去飽和酶，Mortierella isabellina)、malpina-BAA85588 ( Δ 6 去飽和酶，高山被抱霉)、physcomitrelIa-CAAl 1032 ( Δ 6 酸基脂去飽和酶，小立碗蘚)、ceratadon-CAB94992 (Δ6脂肪乙塊酶,角齒蘚(Ceratodonpurpureus))。
[0218]圖5:PCR產(chǎn)物與Elol或Elo2`探針雜交的Southern印跡。
[0219]圖6:延長(zhǎng)酶的PILEUP。
[0220]圖7:用于在擬南芥屬中表達(dá)編碼LC-PUFA生物合成酶的基因的轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體。“EPA構(gòu)建體” pSSP-5/6D.6E (在實(shí)施例5中也稱(chēng)作pZebdesatCeloPWvec8)(圖7A)含有斑馬魚(yú)的雙功能的Λ 5/Λ 6去飽和酶(D5/D6Des)和線蟲(chóng)的Λ 6延長(zhǎng)酶(D6Elo)，兩者都受截?cái)嗟膎apin啟動(dòng)子(Fpl)驅(qū)動(dòng)，以及受CaMV_35S (35SP)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的潮霉素耐藥性選擇標(biāo)記物基因(hph)。“DHA構(gòu)建體”pXZP355(圖7B)包括都受截?cái)嗟膎apin啟動(dòng)子(Fpll)驅(qū)動(dòng)的Pavlova salina的Λ 4去飽和酶(D4Des)和△ 5延長(zhǎng)酶(D5Elo)基因、以及受胭脂氨酸(nopaline)合酶啟動(dòng)子(NosP)驅(qū)動(dòng)的卡那霉素耐藥性選擇標(biāo)記物基因(nptll)。所有基因的3’端側(cè)翼都是胭脂氨酸合酶終止子(NosT)。
[0221]圖8:A:顯不攜帶EPA和DHA基因構(gòu)建體的擬南芥(Arabidopsis thaliana)株DOll的脂肪酸譜的氣相色譜(GLC)。B:從擬南芥株DOll中獲得的EPA和DHA的質(zhì)譜。
[0222]圖9:如實(shí)施例12所示的，在低嚴(yán)格性或高嚴(yán)格性的條件下，用由如右側(cè)所示的P.salina基因編碼區(qū)構(gòu)成的放射性標(biāo)記探針與上方所示的各種微藻類(lèi)物種的DNA所進(jìn)行的點(diǎn)印跡雜交的放射自顯像圖。
[0223]圖10:高等植物的Λ6和Λ8去飽和酶的氨基酸序列排列。用PILEUP(GCG，Wisconsin, USA)排列來(lái)自 E.plantagineum (EplD6Des) (SEQ ID NO:64)、E.gentianoides(EgeD6Des,登錄號(hào) AY055117) (SEQ ID NO:65)、E.pitardii (EpiD6Des，AY055118) (SEQ ID NO:66)、琉璃苣(BofD6Des, U79010) (SEQ ID NO:67) Λ6 去飽和酶以及來(lái)自琉璃苣(BofD8Des，AF133728) (SEQ ID NO:68)、向日葵(Helianthus annus)(HanD8Des, S68358) (SEQ ID NO:69)、和擬南芥(AtD8DesA、AAC62885.1 ；和 AtD8DesB、CAB71088.1)(分別是SEQ ID NO:70和SEQ ID NO:71)的Λ 8去飽和酶的氨基酸序列。ΗΒΙ、HBI I,HBI11是三個(gè)保守的組氨酸框。Fl和Rl是用于擴(kuò)增cDNA的簡(jiǎn)并引物EpD6Des_Fl和EpD6Des-Rl的對(duì)應(yīng)區(qū)域。也顯示了具有保守的HPGG基序的N末端的細(xì)胞色素b5結(jié)構(gòu)域。
[0224]圖11:所分離到的變體EplD6Des酶以及代表性的酶活性。具有細(xì)胞色素b5、組氨酸框1、11和III的EplD6Des分別被顯示為b5、HB1、HBI1、和HBIII。在A組中以下面的格式顯示了所分離到的變體:野生型氨基酸-位點(diǎn)編號(hào)-變體氨基酸?？招牧庑伪硎撅@著降低酶活性的突變，而實(shí)心菱形表示對(duì)酶活性沒(méi)有顯著影響的變體。B組顯示了兩種變體的轉(zhuǎn)基因煙草葉子中的GLA及SDA產(chǎn)量與野生型酶的比較。
[0225]圖 12:由 ALA (18:3)合成 ω 3LC-PUFA SDA (18:4)、EPA(20:5)和 DHA (22:6)的其他途徑。分別用實(shí)心箭頭、空心箭頭和虛線顯示出了去飽和酶、延長(zhǎng)酶和酰基轉(zhuǎn)移酶。僅僅在脂酰輔酶A底物上出現(xiàn)鏈的延長(zhǎng)，而去飽和作用可以出現(xiàn)于?；鵓C(A&B)或脂酰輔酶A底物。還沒(méi)有確定出最終的Λ4去飽和酶步驟在?；鵓C或脂酰輔酶A之間的底物偏向性。涉及?；鵓C去飽和酶的途徑需要?；D(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的PC和輔酶A底物之間的?；拇┧笞兾?。組A和B分別顯示了?；鵓C去飽和酶途徑的“Λ6途徑”以及“Λ8途徑”。組C顯示了在本研究中所表達(dá)的途徑，其中斑馬魚(yú)Λ 6/Λ 5雙功能去飽和酶編碼脂酰輔酶ΑΛ 6和Λ5去飽和酶活性。通過(guò)相同組的 反應(yīng)可以合成co6LC-PUFA例如ARA(20:4)，只是開(kāi)始時(shí)用LA (18:2)作為初始底物。
[0226]圖13:Synechococcus7002 在 22°C、25°C、3(TC 的生長(zhǎng)率。
[0227]圖14:不同生長(zhǎng)溫度下的Synechococcus7002的亞油酸和亞麻酸水平。
[0228]序列列表
[0229]SEQ ID NO:1-Pavlova salina 的 Δ8 去飽和酶；
[0230]SEQ ID NO:2_Pavlova salina 的 Δ 5 延長(zhǎng)酶；
[0231]SEQ ID NO:3_Pavlova salina 的 Δ 9 延長(zhǎng)酶；
[0232]SEQ ID NO:4-Pavlova salina 的 Δ 4 去飽和酶；
[0233]SEQ ID NO:5_編碼Pavlova salina的Λ 8去飽和酶的開(kāi)放讀框的cDNA ；
[0234]SEQ ID NO:6_ 編碼 Pavlova salina 的 Λ 8 去飽和酶的全長(zhǎng) cDNA ；
[0235]SEQ ID NO:7_編碼Pavlova salina的Δ 5延長(zhǎng)酶的開(kāi)放讀框的cDNA ;
[0236]SEQ ID NO:8_ 編碼 Pavlova salina 的 Λ 5 延長(zhǎng)酶的全長(zhǎng) cDNA ；
[0237]SEQ ID NO:9_編碼Pavlova salina的Δ 9延長(zhǎng)酶的開(kāi)放讀框的cDNA ;
[0238]SEQ ID NO:10_ 編碼 Pavlova salina 的 Λ 9 延長(zhǎng)酶的全長(zhǎng) cDNA ；
[0239]SEQ ID NO: 11-編碼Pavlova salina的Λ 4去飽和酶的N末端部分的部分cDNA ;
[0240]SEQ ID NO: 12-編碼Pavlova salina的Δ 4去飽和酶的開(kāi)放讀框的cDNA ;
[0241]SEQ ID NO:13_ 編碼 Pavlova salina 的 Δ 4 去飽和酶的全長(zhǎng) cDNA ；
[0242]SEQ ID NO:14_秀麗隱桿線蟲(chóng)的Λ 5/ Λ 6雙功能延長(zhǎng)酶；
[0243]SEQ ID NO: 15-斑馬魚(yú)(Danio rerio)的 Δ 5/Λ 6 雙功能去飽和酶;[0244]SEQ ID NO:16-人類(lèi)的 Δ 5 去飽和酶(Genbank 登錄號(hào) No:AAF29378)；
[0245]SEQ ID NO:17_ 畸雌腐霉的 Δ 5 去飽和酶(Genbank 登錄號(hào) No:AAL13311)；
[0246]SEQ ID NO:18_ 破囊壺菌的 Λ 5 去飽和酶(Genbank 登錄號(hào) No:ΑΑΜ09687)；
[0247]SEQ ID NO:19_高山被孢霉的Δ 5去飽和酶(Genbank登錄號(hào)No:074212)；
[0248]SEQ ID NO:20_秀麗隱桿線蟲(chóng)的Λ 5去飽和酶(Genbank登錄號(hào)No:Τ43319)；
[0249]SEQ ID NO:21- 人類(lèi)的 Λ 6 去飽和酶(Genbank 登錄號(hào) No:AAD20018)；
[0250]SEQ ID NO:22_ 小鼠的 Λ 6 去飽和酶(Genbank 登錄號(hào) No:ΝΡ_062673)；
[0251]SEQ ID NO:23_ 畸雌腐霉的 Λ 6 去飽和酶(Genbank 登錄號(hào) No:AAL13310)；
[0252]SEQ ID NO:24- 琉璃苣的 Λ 6 去飽和酶(Genbank 登錄號(hào) No:AAD01410)；
[0253]SEQ ID NO:25-Anemone Ieveillei 的 Δ6 去飽和酶(Genbank 登錄號(hào) No:AAQ10731)；
[0254]SEQ ID NO:26- 角齒蘚的 Λ 6 去飽和酶(Genbank 登錄號(hào) No:CAB94993)；
[0255]SEQ ID NO:27- 小立碗蘚的 Λ 6 去飽和酶(Genbank 登錄號(hào) No =CAAl 1033)；
[0256]SEQ ID NO:28_ 高山被孢霉的 Λ 6 去飽和酶(Genbank 登錄號(hào) No:BAC82361)；
[0257]SEQ ID NO:29-秀麗隱桿線蟲(chóng)的Λ 6去飽和酶(Genbank登錄號(hào)No:AAC15586)；
[0258]SEQ ID NO:30_ 人類(lèi)的 Λ 5 延長(zhǎng)酶(Genbank 登錄號(hào) No:ΝΡ_068586)；
[0259]SEQ ID NO:31_ 小立碗蘚的△ 6 延長(zhǎng)酶(Genbank 登錄號(hào) No:AAL84174)；
[0260]SEQ ID NO:32_ 高山被孢霉的 Λ 6 延長(zhǎng)酶(Genbank 登錄號(hào) No:AAF70417)；
[0261]SEQ ID NO:33_ 破囊壺菌的 Λ 4 去飽和酶(Genbank 登錄號(hào) No:ΑΑΜ09688)；
[0262]SEQ ID NO:34_ 纖細(xì)眼蟲(chóng)的 Λ 4 去飽和酶(Genbank 登錄號(hào) No:AAQ19605)；
[0263]SEQ ID NO:35_ 球等鞭金藻的 Λ 9 延長(zhǎng)酶(Genbank 登錄號(hào) No:AAL37626)；
[0264]SEQ ID NO:36_ 纖細(xì)眼蟲(chóng)的 Λ 8 去飽和酶(Genbank 登錄號(hào) No:AAD45877)；
[0265]SEQ ID NO:37-編碼秀麗隱桿線蟲(chóng)的Λ 5/ Λ 6雙功能延長(zhǎng)酶的cDNA ；
[0266]SEQ ID N0:38_編碼斑馬魚(yú)(Danio rerio)的Λ 5/Λ 6雙功能去飽和酶的cDNA ;
[0267]SEQ ID NO:39 至 42、46、47、50、51、53、54、56、57、81、82、83、84 和 87-寡核苷酸引物；
[0268]SEQ ID NO:43至45、48、49和52-各種去飽和酶/延長(zhǎng)酶的保守基序；
[0269]SEQ ID NO:55_ 編碼 Pavlova salina FAE 樣延長(zhǎng)酶的部分 cDNA ;
[0270]SEQ ID NO:58_ 編碼 Pavlova salina 的 Λ 5 去飽和酶的全長(zhǎng) cDNA ；
[0271]SEQ ID NO:59_編碼Pavlova salina的Λ 5去飽和酶的開(kāi)放讀框的cDNA ；
[0272]SEQ ID NO:60-Pavlova salina 的 Λ 5 去飽和酶；
[0273]SEQ ID NO:61 和 62-Echiumpitardii 的 Δ 6 去飽和酶的片段；
[0274]SEQ ID NO:63_ 編碼 Echium plantagineum 的 Δ 6 去飽和酶的開(kāi)放讀框的 cDNA ;
[0275]SEQ ID NO:64_Echium plantagineum 的 Δ 6 去飽和酶；
[0276]SEQID NO:65_Echium gentianoides 的 Δ6 去飽和酶(Genbank 登錄號(hào) No:AY055117)；
[0277]SEQ ID NO:66_Echium pitardii 的 Δ6 去飽和酶(Genbank 登錄號(hào) No:AY055118)；
[0278]SEQ ID NO:67- 琉璃苣的 Λ 6 去飽和酶(Genbank 登錄號(hào) No:U79010)；[0279]SEQ ID NO:68-琉璃苣的 Λ 8 去飽和酶(Genbank 登錄號(hào) No:AF133728)；
[0280]SEQ ID NO:69_ 向日葵的 Λ 8 去飽和酶(Genbank 登錄號(hào) No:S68358)；
[0281]SEQ ID NO:70_ 擬南芥的 Δ 8 去飽和酶 A (Genbank 登錄號(hào) No:AAC62885.1)；
[0282]SEQ ID NO:71_ 擬南芥的 Δ 8 去飽和酶 B (Genbank 登錄號(hào) No:CAB71088.1)；
[0283]SEQ ID NO:72和73- Λ 6_和Δ 8_去飽和酶的保守基序；
[0284]SEQ ID NO:74_ 破囊壺菌的 Λ 6 延長(zhǎng)酶(Genbank 登錄號(hào) No:ΑΧ951565)；
[0285]SEQ ID NO:75_ 斑馬魚(yú)的 Λ 9 延長(zhǎng)酶(Genbank 登錄號(hào) No:ΝΜ -199532)；
[0286]SEQ ID NO:76-Pavlova Iutheri 的 Δ 9 延長(zhǎng)酶；
[0287]SEQ ID NO:77_ 斑馬魚(yú)的 Λ 5 延長(zhǎng)酶(Genbank 登錄號(hào) No:AF532782)；
[0288]SEQ ID NO:78-Pavlova Iutheri 的 Δ 5 延長(zhǎng)酶；
[0289]SEQ ID NO:79_編碼延長(zhǎng)酶的Heterocapsa niei的部分基因序列；
[0290]SEQ ID N0:80_由SEQ ID NO:79編碼的蛋白，終止密碼子的存在說(shuō)明SEQ ID NO:79內(nèi)存在一個(gè)內(nèi)含子；
[0291]SEQ ID NO:85_Pavlova salina 的 Λ 9 延長(zhǎng)酶，由 SEQ ID NO:9 的位點(diǎn) 31 上的替代起始密碼子編碼；
`[0292]SEQ ID NO:86_Pavlova salina 的 Λ 9 延長(zhǎng)酶，由 SEQ ID NO:9 的位點(diǎn) 85 上的替代起始密碼子編碼；
[0293]SEQ ID NO:88_直鏈藻屬(Melosirasp.)的部分延長(zhǎng)酶氨基酸序列；
[0294]SEQ ID NO:89_編碼直鏈藻屬的部分延長(zhǎng)酶的cDNA序列。
[0295]發(fā)明詳沭
[0296]—般技術(shù)和定義
[0297]除非有特殊的不同定義，在此所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)都應(yīng)當(dāng)具有如本領(lǐng)域(例如細(xì)胞培養(yǎng)、植物生物學(xué)、分子遺傳學(xué)、免疫學(xué)、免疫組織化學(xué)、蛋白化學(xué)、脂肪酸合成、和生物化學(xué))的一般人員通常所理解的相同的含義。
[0298]除非另有說(shuō)明，本發(fā)明所用的重組核酸、重組蛋白、細(xì)胞培養(yǎng)和免疫學(xué)技術(shù)都是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的標(biāo)準(zhǔn)方法。在文獻(xiàn)中已經(jīng)充分地描述和解釋了這些技術(shù)，例如 J.Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley andSons (1984) ；J.Sambrook et al., Molecular Cloning:A Laboratory Manual, ColdSpring Harbour Laboratory Press (1989) ；T.A.Brown (editor), Essential MolecularBiology:A Practical Approach, Volumes land2, IRL Press (1991) ；D.M.Gloverand B.D.Hames(editors), DNA Cloning:A Practical Approach, Volumesl-4, IRLPress(1995andl996)；和 F.M.Ausubel et al.(editors), Current Protocols inMolecular Biology, Greene Pub.Associates and Wiley-1nterscience (1988,包括最近的所有更新);Ed Harlow and David Lane (editors) Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbour Laboratory, (1988)；和 J.E.Coligan etal.(editors)CurrentProtocols in Immunology, John Wiley & Sons (包括最近的所有更新)，并通過(guò)引用將其并入本申請(qǐng)。
[0299]術(shù)語(yǔ)“長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸”、“LC-PUFA”或“C20+多不飽和脂肪酸”指的是其碳鏈上包括至少20個(gè)碳原子以及至少三個(gè)碳-碳雙鍵的脂肪酸。術(shù)語(yǔ)“超長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸”、“VLC-PUFA”或“C22+多不飽和脂肪酸”在此指的是其碳鏈上包括至少22個(gè)碳原子以及至少三個(gè)碳-碳雙鍵的脂肪酸。脂肪酸碳鏈上的碳原子的數(shù)目一般指的都是非分支的碳鏈。如果碳鏈有分支，那么碳原子的數(shù)目要除外側(cè)向基團(tuán)上的那些碳原子數(shù)目。在一個(gè)實(shí)施方式中，長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸是ω 3脂肪酸，即在脂肪酸的甲基末端起的第三個(gè)碳-碳鍵中具有不飽和性(碳-碳雙鍵)的脂肪酸。在另一個(gè)實(shí)施方式中，長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸是ω6脂肪酸，即在脂肪酸的甲基末端起的第6個(gè)碳-碳鍵中具有不飽和性(碳-碳雙鍵)的脂肪酸。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸選自由花生四烯酸(ARA，20:4 Λ 5，8，11，14 ;ω6)、二十碳四烯酸(ETA, 20:4Δ8, 11，14，17 ; ω 3)、二十碳五烯酸(EPA,20:5Δ5, 8, 11，14，17 ;ω 3)、二十二碳五烯酸(DPA, 22:5Δ7, 10，13，16，19 ; ω 3)、或二十二碳六烯酸(DHA,22:6Δ4, 7，10，13，16，19 ; ω 3)構(gòu)成的組。LC-PUFA 也可以是 dihomo-Y -亞油酸(DGLA)或二十碳三烯酸(ETrA，20:3 Λ 11，14，17 ; ω 3)。顯而易見(jiàn)的是，本發(fā)明所生產(chǎn)的LC-PUFA可以是上面的任一或所有脂肪酸的混和物，或者可以包括其他的LC-PUFA或任一這些LC-PUFA的衍生物。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，ω 3脂肪酸是EPA、DPA或DHA，甚至更優(yōu)選地是DPA或DHA。
[0300]此外，術(shù)語(yǔ)“長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸”或“超長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸”在此指的是游離狀態(tài)的脂肪酸或者是酯化形式 的脂肪酸，例如作為甘油三酯、甘油雙酯、甘油單酯、結(jié)合脂酰輔酶A的形式或其他的結(jié)合形式。脂肪酸可以被酯化成磷脂，例如磷酸卵磷脂、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、或雙磷脂酰甘油形式。因此，LC-PUFA可以表現(xiàn)為細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)形式的混和物或純化的油或從細(xì)胞、組織或生物體中提取到的脂質(zhì)。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了包括至少75%或85%甘油三酯的油，剩余的部分表現(xiàn)為其他形式的脂質(zhì)，例如那些上面所提及的脂質(zhì)，以及至少所述的甘油三酯包括LC-PUFA?？梢赃M(jìn)一步地純化或處理油，例如用強(qiáng)堿水解，以便釋放出游離的脂肪酸，或通過(guò)分鎦、蒸鎦等。
[0301]縮寫(xiě)“LC-PUFA”和“VLC-PUFA”在此可以表示單一類(lèi)型的脂肪酸或者多種類(lèi)型的脂肪酸。例如，產(chǎn)生LC-PUFA的本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物可以產(chǎn)生EPA、DPA和DHA。
[0302]可以用于本發(fā)明的去飽和酶和延長(zhǎng)酶蛋白以及編碼所述蛋白的基因是本領(lǐng)域已知的任一蛋白和基因或者它們的同源物或衍生物。在表I中羅列了這些基因以及所編碼的蛋白的實(shí)例。已經(jīng)顯示出參與LC-PUFA生物合成的去飽和酶都屬于所謂的“前端”去飽和酶組，其特點(diǎn)是在每個(gè)蛋白的N末端都具有細(xì)胞色素b5樣結(jié)構(gòu)域。細(xì)胞色素b5樣結(jié)構(gòu)域可能作為去飽和作用所需的電子的受體(Napier et al., 1999 ；Sperling and Heinz,2001)。
[0303]表1:所克隆的參與LC-PUFA生物合成的基因。
【權(quán)利要求】
1.產(chǎn)生二十碳五烯酸(EPA)的方法，所述方法包括在合適條件下培養(yǎng)合成EPA的重組細(xì)胞，其中所述重組細(xì)胞具有多于一種的異源多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼以下的酶: a)Δ6去飽和酶、Λ 6延長(zhǎng)酶和Λ 5去飽和酶；或 b)Δ5 / Δ6雙功能去飽和酶和Λ 6延長(zhǎng)酶； 其中所述多于一種的多核苷酸與一種或多種能指導(dǎo)所述多核苷酸在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的啟動(dòng)子可操縱地連接，且其中至少一種去飽和酶能作用于脂酰輔酶A底物。
2.產(chǎn)生包含二十碳五烯酸(EPA)的油的方法，所述方法包括從合成EPA的重組細(xì)胞提取油，其中所述重組細(xì)胞具有多于一種的異源多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼以下的酶: a)Δ6去飽和酶、Λ 6延長(zhǎng)酶和Λ 5去飽和酶；或 b)Δ5 / Δ6雙功能去飽和酶和Λ 6延長(zhǎng)酶； 其中所述多于一種的多核苷酸與一種或多種能指導(dǎo)所述多核苷酸在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的啟動(dòng)子可操縱地連接，且其中至少一種去飽和酶能作用于脂酰輔酶A底物。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述細(xì)胞形成植物、植物部分或種子。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述植物時(shí)油籽植物或所述種子是油籽。
5.權(quán)利要求3的方法，其中至少一種啟動(dòng)子是種子特異性啟動(dòng)子。
6.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述細(xì)胞是酵母細(xì)胞。
7.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述多核苷酸編碼的酶還包括至少一種Λ5延長(zhǎng)酶，其在細(xì)胞內(nèi)催化EPA轉(zhuǎn)化為二十二碳五烯酸(DPA)。
8.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述細(xì)胞內(nèi)的總脂肪酸包含至少1.5%的ΕΡΑ。
9.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述細(xì)胞能夠合成DPA。
10.權(quán)利要求9的方法，其中所述細(xì)胞能夠從亞油酸(LA)、Y-亞麻酸(GLA)或花生四烯酸(ARA)或它們的任一組合或混合物合成DPA。
11.權(quán)利要求9的方法，其中所述細(xì)胞的總脂肪酸包含至少0.13%、至少0.15%、至少0.5%或至少1.0%的DPA。
12.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述細(xì)胞能夠合成二十二碳六烯酸(DHA)。
13.權(quán)利要求12的方法，其中所述細(xì)胞能夠從亞油酸(LA)、Y-亞麻酸(GLA)或花生四烯酸(ARA)或它們的任一組合或混合物合成DHA。
14.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述細(xì)胞能夠從亞油酸(LA)產(chǎn)生ΕΡΑ。
15.權(quán)利要求3的方法，其中通過(guò)壓榨所述種子從所述種子提取所述油。
16.權(quán)利要求2的方法，其中在提取之后純化所述油。
17.權(quán)利要求16的方法，其中使用強(qiáng)堿通過(guò)水解處理所述油以便釋放游離脂肪酸。
18.權(quán)利要求16的方法，其中處理所述油以制備藥物組合物。
19.通過(guò)權(quán)利要求1或2的方法產(chǎn)生的二十碳五烯酸(EPA)。
20.包含通過(guò)權(quán)利要求2的方法產(chǎn)生的EPA的油。
21.組合物，其包含通過(guò)權(quán)利要求1或2的方法產(chǎn)生的EPA以及合適載體。
22.包含通過(guò)權(quán)利要求1或2的方法產(chǎn)生的EPA的飼料。
23.通過(guò)權(quán)利要求1或2的方法產(chǎn)生的EPA在制備用于治療或預(yù)防可從EPA獲益的疾病的藥物中的用途。
24.產(chǎn)生合成EPA的重組細(xì)胞的方法，所述方法包括向細(xì)胞內(nèi)引入多于一種的異源多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼以下的酶: a)Δ6去飽和酶、Λ 6延長(zhǎng)酶和Λ 5去飽和酶；或 b)Δ5 / Δ6雙功能去飽和酶和Λ 6延長(zhǎng)酶； 其中所述多于一種的多核苷酸與一種或多種能指導(dǎo)所述多核苷酸在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的啟動(dòng)子可操縱地連接，且其中至少一種去飽和酶能作用于脂酰輔酶A底物。
25.產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因種子的方法，所述方法包括: i)向植物細(xì)胞內(nèi)引入一種或多種異源多核苷酸，所述多核苷酸編碼: a)Δ6去飽和酶、Λ 6延長(zhǎng)酶和Λ 5去飽和酶；或 b)Δ5 / Δ6雙功能去飽和酶和Λ 6延長(zhǎng)酶； 其中所述一種或多種多核苷酸與一種或多種能指導(dǎo)所述多核苷酸在種子內(nèi)表達(dá)的啟動(dòng)子可操縱地連接，且其中至少一種去飽和酶能作用于脂酰輔酶A底物，由此產(chǎn)生重組細(xì)胞， ?)培養(yǎng)所述重組細(xì)胞以產(chǎn)生植物，和 iii)回收所產(chǎn)生的植物的種子`。
【文檔編號(hào)】C12N15/82GK103451246SQ201310392524
【公開(kāi)日】2013年12月18日 申請(qǐng)日期:2005年4月22日 優(yōu)先權(quán)日:2004年4月22日
【發(fā)明者】蘇林德?tīng)枴づ翣枴ば粮? 斯坦利·蘇雷什·羅伯特, 彼得·戴維·尼科爾斯, 蘇珊·艾琳·艾利斯·布萊克本, 周雪榮, 詹姆斯·羅伯遜·皮特里, 艾倫·格雷厄姆·格林 申請(qǐng)人:聯(lián)邦科學(xué)技術(shù)研究組織