一種篩選細(xì)菌新菌種的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種篩選細(xì)菌新菌種的方法，其步驟如下：（1）富集培養(yǎng)樣品中的細(xì)菌并對(duì)其進(jìn)行分離純化；（2）PCR純化產(chǎn)物的16S?rDNA、克隆、測(cè)序；（3）篩出與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中16SrDNA序列同源性低于97%的序列；（4）PCR含有目標(biāo)菌種16S?rDNA序列克隆子16S?rDNA可變區(qū)；（5）再次純化含目標(biāo)菌種的菌液，PCR其16S?rDNA可變區(qū)；（6）對(duì)步驟（5）中16S?rDNA可變區(qū)樣品進(jìn)行變性梯度凝膠電泳，以步驟（4）中PCR產(chǎn)物為標(biāo)記物，篩出含有目標(biāo)菌種且電泳條帶最少的純化產(chǎn)物；（7）以步驟（6）中篩選出的純化產(chǎn)物為基礎(chǔ)，重復(fù)步驟（5）、（6）的操作，直到獲得純化的新菌種。
【專利說(shuō)明】一種篩選細(xì)菌新菌種的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于微生物【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及一種將傳統(tǒng)微生物分離技術(shù)與現(xiàn)代分子生物技術(shù)結(jié)合來(lái)篩選細(xì)菌新菌種的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]傳統(tǒng)的微生物篩選方法主要是通過(guò)觀察微生物的個(gè)體形態(tài)、菌落形態(tài)以及一些生理生化特征對(duì)篩選所得微生物進(jìn)行初步分門歸屬，該方法對(duì)于篩選一些常見(jiàn)微生物較為實(shí)用，但往往只能將微生物的分類學(xué)地位確定到屬。對(duì)于分離純化尚未被培養(yǎng)的新菌種而言，由于環(huán)境中存在的微生物類別復(fù)雜，一些微生物的菌落形態(tài)特征以及個(gè)體形態(tài)差別甚微，特別是同一個(gè)屬下不同種的微生物，新菌種的個(gè)體形態(tài)特征、菌落形態(tài)可能與已知菌種十分接近，并且篩選者并非對(duì)所有微生物的形態(tài)都了然，在篩選過(guò)程中極易出現(xiàn)漏篩和錯(cuò)篩新菌種的情況，因而通過(guò)觀察的方法來(lái)指導(dǎo)篩選新菌種的準(zhǔn)確性不高、難度大。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種篩選細(xì)菌新菌種的方法，該方法準(zhǔn)確、快速，可避免傳統(tǒng)篩選方法的盲目性及隨機(jī)性。
[0004]一種篩選細(xì)菌新菌種的方法，步驟如下:
[0005](I)富集培養(yǎng)樣品中的細(xì)菌并對(duì)其進(jìn)行分離純化，得到第一代純化產(chǎn)物；
[0006](2)提取、純化步驟(I)中每一個(gè)第一代純化產(chǎn)物的總DNA，然后PCR擴(kuò)增其16SrDNA，將所得總16S rDNA插入到原核載體中構(gòu)建原核重組質(zhì)粒，然后將原核重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞中培養(yǎng)，篩選出陽(yáng)性克隆子，提取陽(yáng)性克隆子質(zhì)粒，并對(duì)其進(jìn)行酶切分析，將酶切圖譜相同的歸為同一個(gè) 分類操作單位，從每個(gè)分類操作單位中取I~2個(gè)克隆子的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序；
[0007](3)分別將步驟(2)中測(cè)得的16S rDNA序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的16S rDNA序列進(jìn)行比對(duì)，篩選出與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的16S rDNA序列同源性低于97%的序列，即目標(biāo)菌種16SrDNA 序列；
[0008](4)取含有目標(biāo)菌種16S rDNA序列的克隆子，提取其質(zhì)粒，PCR擴(kuò)增質(zhì)粒中的16SrDNA可變區(qū)，并將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物保存?zhèn)溆茫?br> [0009](5)將含目標(biāo)菌種的第一代純化產(chǎn)物進(jìn)一步分離純化，得第二代純化產(chǎn)物，PCR擴(kuò)增每一個(gè)第二代純化產(chǎn)物的16S rDNA可變區(qū)；
[0010](6)分別對(duì)步驟(5)獲得的16S rDNA可變區(qū)樣品進(jìn)行變性梯度凝膠電泳，以步驟
(4)所得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為標(biāo)記物，篩選出含有目標(biāo)菌種且電泳條帶最少的第二代純化產(chǎn)物；
[0011](7)以步驟(6)中篩選出的純化產(chǎn)物為基礎(chǔ)，重復(fù)步驟(5)、(6)的操作對(duì)所述純化產(chǎn)物進(jìn)行進(jìn)一步的分離純化，直到16S rDNA可變區(qū)樣品的電泳條帶中只含有與標(biāo)記物的電泳條帶位置一致的電泳條帶，即篩選得到純化的新菌種。
[0012]上述方法中，細(xì)菌的培養(yǎng)條件及培養(yǎng)基的組成參照樣品細(xì)菌群落中的優(yōu)勢(shì)菌種的相似菌中的培養(yǎng)條件及培養(yǎng)基的組成來(lái)確定；所述優(yōu)勢(shì)菌種的相似菌種可由下述方法確定:通過(guò)細(xì)菌樣品的16S rDNA的分子克隆文庫(kù)獲知細(xì)菌樣品中占優(yōu)勢(shì)的16S rDNA序列，將優(yōu)勢(shì)16S rDNA序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的16S rDNA序列進(jìn)行比對(duì)，篩選獲得與優(yōu)勢(shì)16S rDNA序列同源性最高的菌種，即為相似菌種。
[0013]上述方法中，細(xì)菌的培養(yǎng)條件及培養(yǎng)基的組成也可根據(jù)目標(biāo)菌種的功能特點(diǎn)來(lái)確定。
[0014]上述方法中，對(duì)細(xì)菌進(jìn)行分離純化時(shí)，采用亨蓋特嚴(yán)格厭氧技術(shù)對(duì)嚴(yán)格厭氧細(xì)菌進(jìn)行分離純化。
[0015]上述方法中，步驟(2)所述原核載體為pUCm-T，所述感受態(tài)細(xì)胞為大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞。
[0016]上述方法中，對(duì)細(xì)菌進(jìn)行分離純化時(shí)，應(yīng)挑取所有菌落形態(tài)不同的單菌落進(jìn)行培養(yǎng)。
[0017]上述方法中，所述挑取所有菌落形態(tài)不同的單菌落進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，最好從每個(gè)單菌落中挑取2~3個(gè)樣品進(jìn)行培養(yǎng)。
[0018]上述方法中，所述進(jìn)行變性梯度凝膠電泳時(shí)，若16S rDNA可變區(qū)樣品的電泳條帶中含有與所述標(biāo)記物電泳條帶位置一致的條帶，則該16S rDNA可變區(qū)樣品對(duì)應(yīng)的菌液中含有目標(biāo)菌種，16S rDNA可變區(qū)樣品的電泳條帶越少，表明該16S rDNA可變區(qū)樣品對(duì)應(yīng)的菌液中目標(biāo)菌種的純化程度越 高，下一步純化時(shí)便以該菌液為基礎(chǔ)；若16S rDNA可變區(qū)樣品的電泳條帶中只含有與標(biāo)記物的電泳條帶位置一致的電泳條帶時(shí)，表明該16S rDNA可變區(qū)樣品對(duì)應(yīng)的菌液中只含有目標(biāo)菌種，純化完成。
[0019]上述方法中，在步驟(7)獲得純化的新菌種后，對(duì)所得純化的新菌種進(jìn)行16S rDNA測(cè)序，并將測(cè)得的16S rDNA序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的16S rDNA序列進(jìn)行比對(duì)，以確保純化的菌種為新菌種。
[0020]本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)及有益的技術(shù)效果:
[0021]1.本發(fā)明為細(xì)菌新菌種的篩選提供了一種新方法，該方法采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、16S rDNA克隆、酶切分析、分子測(cè)序等技術(shù)獲得細(xì)菌的16S rDNA序列，根據(jù)16S rDNA序列可準(zhǔn)確、快速地判斷樣品中是否含有新菌種，即目標(biāo)菌種，從而有針對(duì)性地對(duì)含有新菌種的樣品進(jìn)行后續(xù)的分離純化操作，可避免篩選的盲目性，減少不必要的篩選過(guò)程。
[0022]2.本發(fā)明所述方法，在確定樣品中含有新菌種后，在分離純化新菌種的過(guò)程中結(jié)合了變性梯度凝膠電泳技術(shù)，根據(jù)變性梯度凝膠電泳的條帶位置及數(shù)量來(lái)判斷目標(biāo)新菌種在篩選過(guò)程中是否被漏篩以及被純化的程度，從而保證分離純化過(guò)程的準(zhǔn)確及快速，避免篩選過(guò)程的隨機(jī)性，顯著降低篩選過(guò)程中新菌種損失的概率。
[0023]3.本發(fā)明所述方法與傳統(tǒng)方法相比較，在獲得相同篩選準(zhǔn)確度的情況下，能節(jié)約篩選新菌種的時(shí)間和成本。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0024]圖1是本發(fā)明所述方法的篩選過(guò)程示意圖，圖中N為> 2的正整數(shù)；
[0025]圖2是實(shí)施例1篩選獲得的純的菌液的變性梯度凝膠電泳圖譜，其中I為標(biāo)記物的16S rDNA V7-V8區(qū)電泳條帶，2為純化的新菌種的16S rDNA V7-V8區(qū)電泳條帶；[0026]圖3是實(shí)施例1篩選獲得的新菌種的電子顯微鏡圖片。
【具體實(shí)施方式】
[0027]以下結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明所述篩選細(xì)菌新菌種的方法作進(jìn)一步說(shuō)明，其中未作詳細(xì)闡述的具體實(shí)驗(yàn)條件的，均按照本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)操作進(jìn)行，或參照廠商所建議的條件。
[0028]實(shí)施例1
[0029]本實(shí)施例以窖泥中嚴(yán)格厭氧細(xì)菌新菌種Aminobacterium shui jingfangii的篩選為例，其保藏單位為中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，保藏號(hào)為CICC10731T，具體說(shuō)明本發(fā)明所述篩選細(xì)菌新菌種的方法，具體步驟如下:
[0030]窖泥來(lái)源于水井坊股份有限公司窖齡為20年的窖池。
[0031]圖1是本發(fā)明所述方法的篩選過(guò)程示意圖。 [0032]1、樣品中細(xì)菌的富集培養(yǎng)及分離純化
[0033]通過(guò)細(xì)菌16S rDNA克隆文庫(kù)分析所述窖泥樣品中細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)組成，得知NCBI登陸號(hào)為AB699891的16S rDNA序列是窖泥樣品中的優(yōu)勢(shì)序列，以該序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)Blast同源性比對(duì)，結(jié)果顯示該優(yōu)勢(shì)序列與Petrimonas sulfuriphila BN3的同源性最高，其同源性為99%,所以Petrimonas sulfuriphila BN3的培養(yǎng)條件選擇培養(yǎng)基組成及培養(yǎng)條件，參見(jiàn)文獻(xiàn)-1nternational Journal of Systematic and EvolutionaryMicrobiology(2005), 55, 1113 - 1121:Petrimonas sulfuriphila gen.nov., sp.nov., amesophilic fermentative bacterium isolated from a biodegraded oil reservoir。
[0034]下述培養(yǎng)過(guò)程中采用的培養(yǎng)基均為嚴(yán)格厭氧菌培養(yǎng)基，其組成如下:
[0035](I)液體培養(yǎng)基:氯化銨NH4Cl0.33g、磷酸二氫鉀KH2PO40.33g、氯化鉀KC10.33g、酵母提取物0.5g、胰蛋白胨3g、半胱氨酸鹽酸鹽0.5g、l.0mL微量元素溶液SL_10、10mL維生素溶液141、乳酸鈉1.68g、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的氯化鈣溶液33mL、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的氯化鎂溶液16.5mL、刃天青l(xiāng)mL、蒸餾水IOOOmL,煮沸半小時(shí)，分裝時(shí)通入N2與CO2的混合氣體，N2與CO2的體積比為4:1;
[0036]所述維生素溶液141的配方如下:
[0037]
【權(quán)利要求】
1.一種篩選細(xì)菌新菌種的方法，其特征在于步驟如下: (1)富集培養(yǎng)樣品中的細(xì)菌并對(duì)其進(jìn)行分離純化，得到第一代純化產(chǎn)物； (2)提取、純化步驟(I)中每一個(gè)第一代純化產(chǎn)物的總DNA，然后PCR擴(kuò)增其16SrDNA，將所得總16S rDNA插入到原核載體中構(gòu)建原核重組質(zhì)粒，然后將原核重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞中培養(yǎng)，篩選出陽(yáng)性克隆子，提取陽(yáng)性克隆子質(zhì)粒，并對(duì)其進(jìn)行酶切分析，將酶切圖譜相同的歸為同一個(gè)分類操作單位，從每個(gè)分類操作單位中取I~2個(gè)克隆子的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序； (3)分別將步驟(2)中測(cè)得的16SrDNA序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的16S rDNA序列進(jìn)行比對(duì)，篩選出與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的16S rDNA序列同源性低于97%的序列，即目標(biāo)菌種16SrDNA序列； (4)取含有目標(biāo)菌種16SrDNA序列的克隆子，提取其質(zhì)粒，PCR擴(kuò)增質(zhì)粒中的16S rDNA可變區(qū)，并將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物保存?zhèn)溆茫? (5)將含目標(biāo)菌種的第一代純化產(chǎn)物進(jìn)一步分離純化，得第二代純化產(chǎn)物，PCR擴(kuò)增每一個(gè)第二代純化產(chǎn)物的16S rDNA可變區(qū)； (6)分別對(duì)步驟(5)獲得的16SrDNA可變區(qū)樣品進(jìn)行變性梯度凝膠電泳，以步驟(4)所得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為標(biāo)記物，篩選出含有目標(biāo)菌種且電泳條帶最少的第二代純化產(chǎn)物； (7)以步驟(6)中篩選出的純化產(chǎn)物為基礎(chǔ)，重復(fù)步驟(5),(6)的操作對(duì)所述純化產(chǎn)物進(jìn)行進(jìn)一步的分離純化，直到16S rDNA可變區(qū)樣品的電泳條帶中只含有與標(biāo)記物的電泳條帶位置一致的電泳條帶，即篩選得到純化的新菌種。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述篩選細(xì)菌新菌種的方法，其特征在于細(xì)菌的培養(yǎng)條件及培養(yǎng)基的組成參照樣品細(xì)菌群落中的優(yōu)勢(shì)菌種的相似菌種的培養(yǎng)條件及培養(yǎng)基的組成來(lái)確定，或者根據(jù)目標(biāo)菌種的功能特點(diǎn)來(lái)確定。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述篩選細(xì)菌新菌種的方法，其特征在于對(duì)細(xì)菌進(jìn)行分離純化時(shí)，采用亨蓋特嚴(yán)格厭氧技術(shù)對(duì)嚴(yán)格厭氧細(xì)菌進(jìn)行分離純化。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述篩選細(xì)菌新菌種的方法，其特征在于對(duì)細(xì)菌進(jìn)行分離純化時(shí)，采用亨蓋特嚴(yán)格厭氧技術(shù)對(duì)嚴(yán)格厭氧細(xì)菌進(jìn)行分離純化。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述篩選細(xì)菌新菌種的方法，其特征在于步驟(2)所述原核載體為pUCm-T，所述感受態(tài)細(xì)胞為大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述篩選細(xì)菌新菌種的方法，其特征在于對(duì)細(xì)菌進(jìn)行分離純化時(shí)，應(yīng)挑取所有菌落形態(tài)不同的單菌落進(jìn)行培養(yǎng)。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述篩選細(xì)菌新菌種的方法，其特征在于所述挑取所有菌落形態(tài)不同的單菌落進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，從每個(gè)單菌落中挑取2~3個(gè)樣品進(jìn)行培養(yǎng)。
【文檔編號(hào)】C12N1/20GK103468802SQ201310392561
【公開(kāi)日】2013年12月25日 申請(qǐng)日期:2013年9月2日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月2日
【發(fā)明者】張文學(xué), 黃丹, 劉超蘭, 吳正云, 李文芳, 張勁, 羅青春 申請(qǐng)人:四川大學(xué)