一種以鈣化海藻酸鈉固載酶的優(yōu)化方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種以鈣化海藻酸鈉固載酶的優(yōu)化方法，其特征是：以超臨界二氧化碳處理鈣化海藻酸鈉固載酶的凝膠小球。超臨界狀態(tài)下的二氧化碳可以以其特殊的流體性質(zhì)穿透海藻酸鈉凝膠外殼，與鈣化海藻酸鈉凝膠中的鈣離子結(jié)合形成納米級(jí)的球狀碳酸鈣小顆粒并附著在海藻酸鈉固載酶凝膠體系的外殼，從而大大加強(qiáng)了該凝膠外殼的強(qiáng)度，使得該固載酶體系的循環(huán)利用次數(shù)大幅增加。該優(yōu)化方法不僅增加了酶的使用次數(shù)節(jié)省了成本，且操作過(guò)程中無(wú)任何有害物質(zhì)產(chǎn)生，是一種易于操作、節(jié)約資源、對(duì)環(huán)境友好的優(yōu)化方法。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種以鈣化海藻酸鈉固載酶的優(yōu)化方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種以鈣化海藻酸鈉固載酶的優(yōu)化方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 隨著生物【技術(shù)領(lǐng)域】的發(fā)展，酶促反應(yīng)越來(lái)越多的應(yīng)用于工業(yè)及醫(yī)藥生產(chǎn)。然而酶 促反應(yīng)中最重要的元素-生物酶具有不易保存、難于回收利用等缺點(diǎn)。因此科學(xué)家們研究 出以各種高分子固載酶的方法來(lái)解決這一問(wèn)題，其中以鈣化海藻酸鈉固載酶的方法尤為簡(jiǎn) 便易行而被廣泛應(yīng)用。海藻酸鈉是一種天然高分子，性質(zhì)溫和無(wú)毒害，常溫下溶于水，可與 二價(jià)陽(yáng)離子結(jié)合交聯(lián)形成凝膠。鈣化海藻酸鈉固載酶的方法是將海藻酸鈉與酶混合溶于水 中，將此液體滴加于二價(jià)鈣離子的鹽溶液中形成凝膠顆粒，再將該凝膠顆粒作為一個(gè)催化 整體應(yīng)用于酶促反應(yīng)中，如需終止反應(yīng)只需將該凝膠顆粒取出進(jìn)行回收利用。
[0003] 然而海藻酸鈉與二價(jià)陽(yáng)離子的結(jié)合并不穩(wěn)定，鈣化海藻酸鈉固載酶的凝膠顆粒經(jīng) 5-8次循環(huán)利用就會(huì)破碎，這樣酶就無(wú)法再回收利用且污染了反應(yīng)體系。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的就是為了解決上述問(wèn)題。本發(fā)明公開(kāi)了一種方法可有效加強(qiáng)鈣化海 藻酸鈉凝膠外殼的強(qiáng)度，使得以鈣化海藻酸鈉固載酶的循環(huán)利用次數(shù)大幅增加，從而優(yōu)化 了該固載方法。該方法利用超臨界二氧化碳處理鈣化海藻酸鈉固載酶的凝膠顆粒，不僅增 加了酶的使用次數(shù)節(jié)省了成本，且操作過(guò)程中無(wú)任何有害物質(zhì)產(chǎn)生，是一種易于操作、節(jié)約 資源、對(duì)環(huán)境友好的優(yōu)化方法。
[0005] 首先將酶與海藻酸鈉按一定比例混合溶于水中，將此液體以針管吸出，逐滴滴加 于2%氯化鈣溶液中，形成凝膠小球。將此凝膠小球凍干以備后用。其中酶與海藻酸鈉最優(yōu) 比為 1 :0· 2-1 :0· 5。
[0006] 然后將凍干后的凝膠小球置于超臨界二氧化碳反應(yīng)釜中，加入去離子水，以超臨 界二氧化碳處理。最優(yōu)化條件為：溫度32°C -35°C;壓力7. 5-8. 5MPa ;水與凝膠小球體積比 為3 :1-2 :1 ;處理時(shí)間1-2小時(shí)。
[0007] 目前，超臨界二氧化碳以其介于氣體和液體之間的特殊流體性質(zhì)多用于萃取、清 洗、干燥等技術(shù)，本發(fā)明所示的方法首次提出了超臨界二氧化碳應(yīng)用于加固海藻酸鈉固載 酶外殼。同時(shí)，超臨界二氧化碳臨界值T=31. 1°C，P=7. 38MPa，在實(shí)驗(yàn)研究或工業(yè)應(yīng)用上是 較易達(dá)到的條件。
[0008] 實(shí)驗(yàn)證明在本發(fā)明的優(yōu)化方法中超臨界狀態(tài)下的二氧化碳可以以其特殊的流體 性質(zhì)穿透海藻酸鈉凝膠外殼，與鈣化海藻酸鈉凝膠中的鈣結(jié)合形成納米級(jí)的球狀碳酸鈣小 顆粒并附著在海藻酸鈉固載酶凝膠體系的外殼，從而大大加強(qiáng)了該凝膠外殼的強(qiáng)度，使得 該固載酶體系的循環(huán)利用次數(shù)大幅增加。經(jīng)超臨界二氧化碳處理后的鈣化海藻酸鈉固載酶 體系的循環(huán)利用次數(shù)可由原來(lái)的5-8次提升為30次。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0009] 附圖是本發(fā)明優(yōu)化方法及效果的示意圖。
[0010] 注釋?zhuān)?-酶；2-超臨界二氧化碳處理前的鈣化海藻酸鈉固載酶凝膠小球；3-超臨 界二氧化碳處理后的鈣化海藻酸鈉固載酶凝膠小球；4-超臨界二氧化碳高壓反應(yīng)釜。

【具體實(shí)施方式】
[0011] 第一步：酶的固載
[0012] 將海藻酸鈉溶于去離子水中并充分?jǐn)嚢?待攪拌均勻后,加入液態(tài)酶,充分混合。 以6號(hào)針頭的一次性注射器吸出后不斷滴加于2%的CaCl2溶液中，使其凝成直徑為2-3mm 的小球。將小球浸泡于2% CaCl2的溶液中靜置40分鐘，以布氏漏斗抽濾并放于凍干機(jī)中 凍干10小時(shí)。其中各原料比例為：海藻酸鈉：去尚子水：酶為I :200 :0. 2。
[0013] 第二步：超臨界二氧化碳處理，并以實(shí)驗(yàn)檢測(cè)循環(huán)利用次數(shù)
[0014] 超臨界二氧化碳處理后鈣化海藻酸鈉固載酶的凝膠小球明顯變得堅(jiān)硬具有韌性， 再以實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其循環(huán)利用效果。下面的實(shí)施例將結(jié)合說(shuō)明書(shū)附圖對(duì)本發(fā)明予以進(jìn)一步說(shuō) 明，但并不因此而限制本發(fā)明。實(shí)施例和對(duì)比例中所得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果列于表1，實(shí)施例和對(duì)比 例中所用的海藻酸鈉及酯水解酶均購(gòu)于北京百靈威科技有限公司。
[0015] 實(shí)施例
[0016] 本實(shí)施例所選取的反應(yīng)為標(biāo)準(zhǔn)化酯水解酶催化水解對(duì)硝基苯酚丁酸酯的反應(yīng)。該 反應(yīng)具有反應(yīng)迅速、靈敏、產(chǎn)率較高等優(yōu)點(diǎn)，可快捷的檢測(cè)出本發(fā)明方法的優(yōu)化效果。
[0017] 取制備好凍干后的固載有酶（1)的鈣化海藻酸鈉凝膠小球（2)0. 02g放置于IOml 的超臨界二氧化碳高壓反應(yīng)釜（4)中加入2ml去離子水，使得凝膠小球與水的體積比為1 : 2。將反應(yīng)釜密封，打入IOml超臨界二氧化碳，保持體系溫度在35°C、壓力在7. 5MPa，攪拌 反應(yīng)2小時(shí)。
[0018] 取出處理好的鈣化海藻酸鈉固載酶凝膠小球（3)放入20ml燒杯中，加入3ml去離 子水，再取〇. 〇6mmol對(duì)硝基苯酚丁酸酯滴入反應(yīng)體系中。將反應(yīng)體系置于恒溫水浴35°C中 反應(yīng)，攪拌30分鐘后停止，以紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)分析表征。紫外波段在311nm下的吸光 度可作為水解產(chǎn)物對(duì)硝基苯酚的產(chǎn)率判斷依據(jù)。然后將凝膠小球取出，重新添加反應(yīng)物，重 復(fù)上述實(shí)驗(yàn)，其實(shí)驗(yàn)結(jié)果列于表1。由表1中實(shí)施例可看出經(jīng)超臨界二氧化碳處理后的凝 膠小球（3)可重復(fù)利用達(dá)30次，由于受到酶活性難以保持時(shí)間過(guò)長(zhǎng)的限制，在重復(fù)26次以 后，凝膠小球雖然完好，但其中包載的酶大部分已經(jīng)失活，導(dǎo)致產(chǎn)率下降。
[0019] 對(duì)比例
[0020] 以相同條件下的鈣化海藻酸鈉固載酶凝膠小球，但不經(jīng)過(guò)超臨界二氧化碳處理， 進(jìn)行相同的反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)（見(jiàn)表1)重復(fù)利用5次后該凝膠小球破裂，無(wú)法再繼續(xù)參與反 應(yīng)，并使反應(yīng)體系變得渾濁，污染了反應(yīng)系統(tǒng)。
[0021] 表 1
[0022]

【權(quán)利要求】
1. 一種以鈣化海藻酸鈉固載酶的優(yōu)化方法，其特征是，利用超臨界二氧化碳處理鈣化 海藻酸鈉固載酶的凝膠顆粒。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種以鈣化海藻酸鈉固載酶的優(yōu)化方法，其特征是，加入去 離子水，以超臨界二氧化碳處理，最優(yōu)化條件為：溫度32°C -35°C;壓力7. 5-8. 5MPa ;水與凝 膠小球體積比為3 :1-2 :1 ;處理時(shí)間1-2小時(shí)。
【文檔編號(hào)】C12N11/04GK104419698SQ201310393095
【公開(kāi)日】2015年3月18日 申請(qǐng)日期:2013年9月3日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月3日
【發(fā)明者】楊曉曦 申請(qǐng)人:楊曉曦