一種細(xì)胞培養(yǎng)基材及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于組織工程的生物材料【技術(shù)領(lǐng)域】，公開(kāi)一種細(xì)胞培養(yǎng)基材及其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明利用臍帶成纖維細(xì)胞自身分泌基質(zhì)，經(jīng)脫細(xì)胞處理、干燥滅菌后，獲得的天然組織工程材料，含有I型膠原、III型膠原、纖連蛋白、層粘連蛋白、核心蛋白聚糖等，可用于目標(biāo)間充質(zhì)干細(xì)胞的體外擴(kuò)增。本發(fā)明制備的細(xì)胞培養(yǎng)基材可顯著提高間充質(zhì)干細(xì)胞在體外擴(kuò)增的效率、保持干細(xì)胞特有的免疫表型、顯著降低干細(xì)胞的活性氧含量，同時(shí)原料來(lái)源廣泛，不會(huì)產(chǎn)生倫理道德問(wèn)題。
【專利說(shuō)明】一種細(xì)胞培養(yǎng)基材及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于組織工程的生物材料【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種細(xì)胞培養(yǎng)基材及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]間充質(zhì)干細(xì)胞由于其具有高度自我更新能力和多向分化潛能的特性，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于再生醫(yī)學(xué)、基因治療、組織工程、細(xì)胞因子替代療法等領(lǐng)域。
[0003]盡管間充質(zhì)干細(xì)胞治療正穩(wěn)步邁向臨床，但是將間充質(zhì)干細(xì)胞移植技術(shù)廣泛應(yīng)用于治療仍有面臨不少的困難。第一，移植間充質(zhì)干細(xì)胞的數(shù)量:臨床有效的移植要求間充質(zhì)干細(xì)胞達(dá)到一定的程度，但實(shí)踐證明體外難以獲得足夠的組織特異性的間充質(zhì)干細(xì)胞數(shù)量而又不喪失其干細(xì)胞潛能。第二，間充質(zhì)干細(xì)胞技術(shù)在臨床治療中能否成功，與間充質(zhì)干細(xì)胞的功能調(diào)控密切相關(guān)，尤其在病變狀態(tài)下，間充質(zhì)干細(xì)胞仍需保持其再生能力參與組織修復(fù)和疾病治療。
[0004]間充質(zhì)干細(xì)胞在體外擴(kuò)增時(shí)多采用常規(guī)的塑料組織培養(yǎng)系統(tǒng)，間充質(zhì)干細(xì)胞的體外擴(kuò)增能力、多次傳代后的分化潛力受到影響，不僅導(dǎo)致不能在短時(shí)間內(nèi)快速有效的大規(guī)模擴(kuò)增足夠數(shù)量的優(yōu)質(zhì)間充質(zhì)干細(xì)胞，而且使得間充質(zhì)干細(xì)胞的關(guān)鍵功能調(diào)控受到影響，不能滿足臨床干細(xì)胞治療的需求。
[0005]傳統(tǒng)的體外傳代培養(yǎng)方式擴(kuò)增干細(xì)胞，面臨著以下的困境和缺點(diǎn):
I)、傳統(tǒng)體外傳代培養(yǎng)方式損害間充質(zhì)干細(xì)胞自我更新能力，使得間充質(zhì)干細(xì)胞擴(kuò)增效率降低、花費(fèi)增高。有研究表明，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)過(guò)多次傳代之后，不但不能繼續(xù)增殖，同時(shí)也失去其多向分化的能力，傳代后期的干細(xì)胞一般只能向脂肪細(xì)胞方向分化。
`[0006]2)、傳統(tǒng)體外傳代培養(yǎng)方式不能滿足不同年齡病人自體間充質(zhì)干細(xì)胞臨床需求。目前自體間充質(zhì)干細(xì)胞已逐漸應(yīng)用于臨床治療，但是不同年齡的干細(xì)胞體外增殖、定向分化能力有很大差異。有研究表明，體外培養(yǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞的克隆數(shù)隨年齡的增長(zhǎng)而逐漸減少，按其與骨髓有核細(xì)胞的比率分別為:新生兒1:10000 ;青少年1:100000 ;50歲1:400000 ；80 歲 1:1~2000000。
[0007]如何能在體外大規(guī)模的擴(kuò)增間充質(zhì)干細(xì)胞，在提高其擴(kuò)增效率的同時(shí)，并保持其間充質(zhì)干細(xì)胞的特性，是目前間充質(zhì)干細(xì)胞治療面臨的一個(gè)難題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的發(fā)明目的在于針對(duì)上述現(xiàn)有擴(kuò)增間充質(zhì)干細(xì)胞技術(shù)的不足，提供一種細(xì)胞培養(yǎng)基材及其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明通過(guò)臍帶成纖維細(xì)胞分泌基質(zhì)制備細(xì)胞培養(yǎng)基材，得到的細(xì)胞培養(yǎng)基材不僅具有多種蛋白質(zhì)成分的特征，而且能用于間充質(zhì)干細(xì)胞的體外擴(kuò)增，具有生物相容性好、增殖效率高、干細(xì)胞表型一致、顯著降低細(xì)胞內(nèi)活性氧含量的優(yōu)點(diǎn)。
[0009]本發(fā)明的上述目的通過(guò)如下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn):一種細(xì)胞培養(yǎng)基材，所述細(xì)胞培養(yǎng)基材包括臍帶成纖維細(xì)胞體外培養(yǎng)所分泌的基質(zhì)。
[0010]所述臍帶成纖維細(xì)胞取自人源、豬源、鼠源或兔源。
[0011]一種細(xì)胞培養(yǎng)基材的制備方法，具體步驟為:
51.從人源、豬源、鼠源或兔源組織獲取臍帶成纖維細(xì)胞；
52.配置誘導(dǎo)培養(yǎng)液；
53.在普通細(xì)胞培養(yǎng)基材上體外培養(yǎng)臍帶成纖維細(xì)胞并誘導(dǎo)臍帶成纖維細(xì)胞分泌基質(zhì)；
54.脫細(xì)胞處理；
55.干燥、滅菌消毒，所述的滅菌消毒采用6tlCo或環(huán)氧乙烷滅菌。
[0012]步驟S3所述普通細(xì)胞培養(yǎng)基材為商用細(xì)胞培養(yǎng)皿、培養(yǎng)板或培養(yǎng)瓶。
[0013]步驟S3中所述誘導(dǎo)臍帶成纖維細(xì)胞分泌基質(zhì)具體步驟為將臍帶成纖維細(xì)胞加入步驟S2配置的誘導(dǎo)培養(yǎng)液后培養(yǎng)7~20天，隔日換液。
[0014]步驟S2中所述誘導(dǎo)培養(yǎng)液的組成為:培養(yǎng)基a -MEM 80^90%體積比，胎牛血清10~20%體積比，抗生素10~200 U/mL，腺嘌呤0.2~0.25禮，刺激因子組分。
[0015]所述刺激因子組分由抗壞血酸10-?00 μ g/mL,脯氨酸20~60 μ g/mL,地塞米松IOOnM~I μ M中的一種或幾種組成。
[0016]步驟S4中所述脫細(xì)胞處理為先加入含有NH4OH和Triton X-100的脫細(xì)胞處理液處理，再加入脫氧核糖核酸酶處理。
[0017]所述脫細(xì)胞處理液由PH7.4的磷酸鹽緩沖液配制，含有Triton Χ-100 δ%體積比和氨水0.8~5%體積比。
[0018]所述脫氧核糖核酸酶溶液由ρΗ7.4的磷酸鹽緩沖液配制，含有50(T800 U/mL脫氧核糖核酸酶。
[0019]本發(fā)明所述細(xì)胞培養(yǎng)基材在間充質(zhì)干細(xì)胞體外擴(kuò)增中的應(yīng)用。
[0020]所述細(xì)胞培養(yǎng)基材在間充質(zhì)干細(xì)胞體外擴(kuò)增中的應(yīng)用，具體步驟為:
56.配制間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)液，所述培養(yǎng)液組成為培養(yǎng)基a-MEM90%體積比，胎牛血清10%體積比，抗生素10^200 U/mL，腺嘌呤0.2~0.25 mM ；
57.培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞，隔日換液；
58.膠原酶溶液酶解細(xì)胞、離心分離。
[0021]步驟S8中所述膠原酶溶液由pH7.4的磷酸鹽緩沖液配制，含有重量比0.1%的膠原酶和重量比0.05%的胰酶。
[0022]本發(fā)明制備的細(xì)胞培養(yǎng)基材，是利用臍帶成纖維細(xì)胞自身分泌基質(zhì)，經(jīng)脫細(xì)胞處理、干燥滅菌后，獲得的天然組織工程材料，含有I型膠原、III型膠原、纖連蛋白、層粘連蛋白、核心蛋白聚糖等，可用于目標(biāo)間充質(zhì)干細(xì)胞的體外擴(kuò)增。
[0023]在體外重建干細(xì)胞生長(zhǎng)的天然微環(huán)境(包括類似體內(nèi)微環(huán)境的微觀結(jié)構(gòu)、基質(zhì)蛋白和誘導(dǎo)因子等)是解決間充質(zhì)干細(xì)胞體外大規(guī)模擴(kuò)增問(wèn)題的一條捷徑。在細(xì)胞所處的微環(huán)境中，細(xì)胞外基質(zhì)扮演著重要角色，在干細(xì)胞的貼附、存活、遷移、增殖、分化和基質(zhì)重建等方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。MSCs通常處于特定的細(xì)胞外基質(zhì)形成的微環(huán)境中，其中包括復(fù)雜的細(xì)胞外應(yīng)力信號(hào)和化學(xué)信號(hào)，引導(dǎo)MSCs的遷移、自我更新和定向分化。
[0024]本發(fā)明細(xì)胞培養(yǎng)基材含有臍帶成纖維細(xì)胞分泌的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)，不僅含有多種基質(zhì)成分，包括I型和III型膠原蛋白、纖維連接蛋白、粘連蛋白、彈性蛋白和大分子的蛋白聚糖等，而且具有與體內(nèi)微環(huán)境相似的三維結(jié)構(gòu)和柔韌性。同時(shí)，脫細(xì)胞處理后原有細(xì)胞留下的空間能為以后的MSCs培養(yǎng)(培養(yǎng)的MSCs)提供足夠的生長(zhǎng)空間。在三維的ECM微環(huán)境中，成纖維細(xì)胞能迅速的合成整合素Oj1和ανβ3與ECM接觸，類似其在體內(nèi)的反應(yīng)；而在二維培養(yǎng)環(huán)境或人工基底膜中，細(xì)胞需要較長(zhǎng)時(shí)間才能產(chǎn)生原始的貼壁行為。細(xì)胞分泌的ECM能在體外重建和模擬體內(nèi)的微環(huán)境,調(diào)控MSCs行為，從而影響MSCs的自我更新能力和定向分化潛能。
[0025]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果:
(1)、本發(fā)明制備的細(xì)胞培養(yǎng)基材，可顯著提高間充質(zhì)干細(xì)胞在體外擴(kuò)增的效率；
(2)、本發(fā)明制備的細(xì)胞培養(yǎng)基材，可保持間充質(zhì)干細(xì)胞特有的免疫表型；
(3)、本發(fā)明制備的細(xì)胞培養(yǎng)基材，可顯著降低間充質(zhì)干細(xì)胞的活性氧含量；
(4)、本發(fā)明制備的細(xì)胞培養(yǎng)基材具有原料來(lái)源廣泛的特點(diǎn)，不產(chǎn)生倫理道德問(wèn)題；
(5)、本發(fā)明的制備方法具有成本低、方法簡(jiǎn)單、易于操作的特點(diǎn)量。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0026]圖1為本發(fā)明所制備的細(xì)胞培養(yǎng)基材免疫熒光染色后的倒置熒光顯微鏡圖；
圖2為本發(fā)明制備的細(xì)胞培養(yǎng)基材擴(kuò)增目標(biāo)間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)圖片；
圖3為采用本發(fā)明制備的細(xì)胞培養(yǎng)基材與普通培養(yǎng)基材擴(kuò)增目標(biāo)間充質(zhì)干細(xì)胞的活性氧分析圖。`
【具體實(shí)施方式】
[0027]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的解釋說(shuō)明，但具體實(shí)施例并不對(duì)本發(fā)明作任何限定。除非特別說(shuō)明，實(shí)施例中所涉及的試劑、方法均為本領(lǐng)域常用的試劑和方法。
[0028]實(shí)施例1
I利用臍帶成纖維細(xì)胞分泌物制備細(xì)胞培養(yǎng)基材
(I)誘導(dǎo)培養(yǎng)液的配制，其組分包括有:商用最低必需培養(yǎng)基α-ΜΕΜ 80%體積比，胎牛血清20%體積比，抗生素10~200 U/mL,腺嘌呤0.25 mM,脯氨酸50 μ g/mL,地塞米松ΙΟΟηΜ。
[0029](2)誘導(dǎo)臍帶成纖維細(xì)胞分泌基質(zhì):將臍帶成纖維細(xì)胞按照20，000個(gè)細(xì)胞/cm2的密度接種于商用細(xì)胞培養(yǎng)板中，加入步驟(3)誘導(dǎo)培養(yǎng)液，于37°C的5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)疒20天，隔日換液。
[0030](3)脫細(xì)胞處理:先用ρΗ7.4的磷酸鹽緩沖液清洗3次，接著加入含有TritonX-100 5%體積比和氨水4%體積比的脫細(xì)胞處理液，于37° C的5%的CO2培養(yǎng)箱中靜置5分鐘，用pH7.4的磷酸鹽緩沖液清洗3次，再加入含有800U/mL脫氧核糖核酸酶溶液于37° C的5%的CO2培養(yǎng)箱中靜置60分鐘，用pH7.4的磷酸鹽緩沖液清洗3次。
[0031](4)干燥:將經(jīng)過(guò)脫細(xì)胞處理后的細(xì)胞培養(yǎng)基材進(jìn)行冷凍干燥。
[0032](5)滅菌消毒:采用環(huán)氧乙烷滅菌。
[0033]2制備得到的細(xì)胞培養(yǎng)基材免疫熒光染色。
[0034]將實(shí)施例1制得的細(xì)胞培養(yǎng)基材進(jìn)行I型膠原、III型膠原、纖連蛋白、核心蛋白聚糖免疫熒光染色。對(duì)于實(shí)施例1制得的細(xì)胞培養(yǎng)基材，首先冰甲醇固定15min，PBS洗3次，加5%BSA封閉30min，加入用1%BSA配制的一抗:1型膠原、III型膠原、纖連蛋白、核心蛋白聚糖，置于搖床上lh，PBS洗3次，加入偶聯(lián)FITC 二抗，室溫30min，PBS洗完后采用倒置熒光顯微鏡拍照。結(jié)果如圖1所示，細(xì)胞培養(yǎng)基材中I型膠原、III型膠原、纖連蛋白豐富表達(dá)，含量較高。
[0035]實(shí)施例2
I細(xì)胞培養(yǎng)基材擴(kuò)增目標(biāo)間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)檢測(cè)
將目標(biāo)間充質(zhì)干細(xì)胞接種于實(shí)施例1獲得的細(xì)胞培養(yǎng)基材，采用Olympus 1X71顯微鏡熒光拍照，獲得如圖2目標(biāo)間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)照片。細(xì)胞培養(yǎng)基材培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞保持良好的成纖維形態(tài)，細(xì)胞密度高，可為間充質(zhì)干細(xì)胞體外擴(kuò)增提供依據(jù)。
[0036]2本發(fā)明制備的細(xì)胞培養(yǎng)基材與普通培養(yǎng)基材擴(kuò)增目標(biāo)間充質(zhì)干細(xì)胞的活性氧分析將目標(biāo)間充質(zhì)干細(xì)胞接種于實(shí)施例1所獲得的細(xì)胞培養(yǎng)基材與普通培養(yǎng)板上，待細(xì)胞密度達(dá)90%左右收集細(xì)胞，采用2' ,7' - 二氯熒光乙酰乙酸鹽(DCFH-DA)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧。細(xì)胞于10 μ M DCFH-DA中37°C孵育IOmin孵育后，采用BD雙波長(zhǎng)激光流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度，每個(gè)樣品收集10000個(gè)細(xì)胞。如圖3所示，與普通培養(yǎng)基材相比，實(shí)施例1所獲得的細(xì)胞培養(yǎng)基材能明顯降低目標(biāo)間充質(zhì)干細(xì)胞內(nèi)活性氧，減少胞內(nèi)活性氧自由基生成，有效保護(hù)細(xì)胞內(nèi)`環(huán)境的穩(wěn)定。
【權(quán)利要求】
1.一種細(xì)胞培養(yǎng)基材，其特征在于，所述細(xì)胞培養(yǎng)基材包括臍帶成纖維細(xì)胞體外培養(yǎng)所分泌的基質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述細(xì)胞培養(yǎng)基材，其特征在于，所述臍帶成纖維細(xì)胞取自人源、豬源、鼠源或兔源。
3.—種權(quán)利要求1所述細(xì)胞培養(yǎng)基材的制備方法，其特征在于，具體步驟為: . 51.獲取臍帶成纖維細(xì)胞； . 52.配置誘導(dǎo)培養(yǎng)液； . 53.在普通細(xì)胞培養(yǎng)基材上體外培養(yǎng)臍帶成纖維細(xì)胞并誘導(dǎo)臍帶成纖維細(xì)胞分泌基質(zhì)； .54.脫細(xì)胞處理； . 55.干燥、滅菌消毒。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述細(xì)胞培養(yǎng)基材的制備方法，其特征在于，步驟S3所述普通細(xì)胞培養(yǎng)基材為商用細(xì)胞培養(yǎng)皿、培養(yǎng)板或培養(yǎng)瓶。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述細(xì)胞培養(yǎng)基材的制備方法，其特征在于，步驟S3中所述誘導(dǎo)臍帶成纖維細(xì)胞分泌基質(zhì)具體步驟為將臍帶成纖維細(xì)胞加入步驟S2配置的誘導(dǎo)培養(yǎng)液后培養(yǎng)疒20天，隔日換液。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述細(xì)胞培養(yǎng)基材的制備方法，其特征在于，步驟S2中所述誘導(dǎo)培養(yǎng)液的組成為:培養(yǎng)基α-ΜΕΜ 80-90%體積比，胎牛血清10-20%體積比，抗生素10~200 U/mL，腺嘌呤0.2^0.25 mM，刺激因子組分。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述細(xì)胞培養(yǎng)基材的制備方法，其特征在于，所述刺激因子組分由抗壞血酸10~100 μ g/mL,脯氨酸20-60 μ g/mL,地塞米松ΙΟΟnΜ~1 μ M中的一種或幾種組成。
8.根據(jù)權(quán)利要求3所述細(xì)胞培養(yǎng)基材的制備方法，其特征在于，步驟S4中所述脫細(xì)胞處理為先加入含有NH4OH和Triton X-100的脫細(xì)胞處理液處理，再加入脫氧核糖核酸酶處理。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述細(xì)胞培養(yǎng)基材的制備方法，其特征在于，所述脫細(xì)胞處理液由PH7.4的磷酸鹽緩沖液配制，含有Triton Χ-100 1~δ%體積比和氨水0.8~5%體積比；所述脫氧核糖核酸酶溶液由ΡΗ7.4的磷酸鹽緩沖液配制，含有50(T800 U/mL脫氧核糖核酸酶。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述細(xì)胞培養(yǎng)基材在間充質(zhì)干細(xì)胞體外擴(kuò)增中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N5/0775GK103497892SQ201310394069
【公開(kāi)日】2014年1月8日 申請(qǐng)日期:2013年9月3日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月3日
【發(fā)明者】何帆, 劉小珍, 譚子芳, 龔逸鴻 申請(qǐng)人:中山大學(xué)