一種植物發(fā)光轉(zhuǎn)基因方法及發(fā)光仙人球的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提出一種植物發(fā)光轉(zhuǎn)基因方法，其包括步驟：熒光素酶基因群PCR擴(kuò)增；熒光素酶基因群與pM-18T載體的構(gòu)建；基因測(cè)序；融合基因轉(zhuǎn)入大腸桿菌，測(cè)序；目的基因與表達(dá)載體的連接；特定啟動(dòng)子與表達(dá)載體的構(gòu)建；融合基因轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌；將基因及熒光素的合成前提物一起轉(zhuǎn)入植物；以及進(jìn)行轉(zhuǎn)代篩選穩(wěn)定發(fā)光植物體。本發(fā)明還提出利用上述的轉(zhuǎn)基因方法獲得的發(fā)光仙人球。本發(fā)明的植物發(fā)光轉(zhuǎn)基因方法可以實(shí)現(xiàn)發(fā)光植物的產(chǎn)業(yè)化，增強(qiáng)園林景觀效果，開發(fā)旅游生態(tài)園，促進(jìn)花卉產(chǎn)業(yè)的大發(fā)展；同時(shí)，利用發(fā)光植物造景還可減少花園景觀持續(xù)的照明用電的需求，減少能源消耗。
【專利說明】一種植物發(fā)光轉(zhuǎn)基因方法及發(fā)光仙人球
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生命科學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及一種植物發(fā)光的轉(zhuǎn)基因技術(shù)，以及由此技術(shù)獲得的一種轉(zhuǎn)基因發(fā)光仙人球。
【背景技術(shù)】
[0002]在自然界，能發(fā)光的生物包括某些細(xì)菌、甲殼動(dòng)物、軟體動(dòng)物、昆蟲和魚類，但能發(fā)光的植物卻不多見?；蚬こ痰陌l(fā)展使科學(xué)家了解到，生物冷光也是由DNA分子中的基因協(xié)調(diào)控制的，基因工程學(xué)家已能把發(fā)光基因?qū)酥参锛?xì)胞中，培育出夜晚能發(fā)磷光或螢光的植物。
[0003]首開記錄的是美國(guó)紐約洲奧本大學(xué)的植物病理學(xué)家，他們?yōu)榱烁玫匮芯扛仕{(lán)的軟腐病，特意把發(fā)光細(xì)菌的磷光基因轉(zhuǎn)移到病原體黃單飽菌中，使它成為能發(fā)光的病囷，然后讓它感染一片甘監(jiān)葉，在暗室中用特制的夜視攝像機(jī)逐一拍下細(xì)囷在葉脈中移動(dòng)的情況，由此看出病菌是怎樣感染植物體的。
[0004]把發(fā)光基因?qū)霕淠炯?xì)胞中，培育出夜晚能發(fā)光的樹，是基因工程學(xué)家努力的又一個(gè)目標(biāo)。在美國(guó)，很多生物學(xué)家正致力發(fā)光樹的研究，他們把熒光基因先導(dǎo)入植物細(xì)菌有高度感染力的農(nóng)桿菌體內(nèi)，使農(nóng)桿菌發(fā)光，然后用它感染樹木細(xì)胞原生質(zhì)體，把發(fā)光基因整合到葉的質(zhì)粒中，再通過組織培養(yǎng)誘導(dǎo)成幼苗，培育夜晚能發(fā)光的樹。但是都沒有獲得真正的成功。
[0005]能催化熒光素或脂肪醛氧化產(chǎn)生生物發(fā)光的一類酶為熒光素酶(Luciferase)。從20世紀(jì)50年代就已經(jīng)有人開始了對(duì)發(fā)光素酶的研究。1954年，有人從哈氏弧菌中提取并純化出細(xì)菌熒光素酶；1967.年，有人對(duì)從費(fèi)氏弧菌中提取出的熒光素酶的結(jié)構(gòu)和反應(yīng)原理進(jìn)行了分析。1956年，螢火蟲發(fā)光素酶被提取出來，在1970年，這種螢火蟲發(fā)光素酶的結(jié)構(gòu)第一次被測(cè)定了。而從1986年，表達(dá)螢火蟲發(fā)光素酶基因(Iuc基因)的轉(zhuǎn)基因煙草第一次被成功地獲得以來，發(fā)光素酶的應(yīng)用和發(fā)展進(jìn)入了一個(gè)嶄新的時(shí)代。
[0006]目前對(duì)螢火蟲發(fā)光素酶(Firefly Luciferase, FL)的研究最多，它的應(yīng)用范圍極廣。它可從北美螢火蟲(Photinus pyralis)、日本螢火蟲(Luciclacr uciata)、北京螢火蟲(Pyrococelia pekinensis)等多種螢火蟲中提取出來。不像細(xì)菌突光素酶有兩個(gè)多肽鏈白組成，螢火蟲熒光素酶是由單一的多肽鏈組成，而且不同種類的螢火蟲提取出的螢火蟲發(fā)光素酶的相對(duì)分子質(zhì)量和結(jié)構(gòu)都各有差異。由北美螢火蟲提取出的蟲發(fā)光素酶的相對(duì)分子質(zhì)量約為62ku，是由551個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的含有大量的疏水氨基酸殘基的單一多肽鏈。而從日本螢火蟲提取出的蟲發(fā)光素酶的相對(duì)分子質(zhì)量約為61ku,含有548個(gè)氨基酸殘基。
[0007]目前，熒光素合成的基因也已經(jīng)發(fā)現(xiàn)幾個(gè)，但未能發(fā)現(xiàn)合成熒光素的全部基因。
[0008]目前轉(zhuǎn)基因發(fā)光植物實(shí)驗(yàn)還未能真正成功，原因在于熒光素的合成基因還沒有全面找到。
[0009]熒光素(如圖1所示的熒光素的分子結(jié)構(gòu)圖)是發(fā)光的關(guān)鍵底物，轉(zhuǎn)入熒光素酶的轉(zhuǎn)基因植物因缺乏熒光素而不能發(fā)光，轉(zhuǎn)基因植物怎樣獲得熒光素是關(guān)鍵。目前有兩個(gè)方法:一個(gè)是把熒光素的合成基因一起轉(zhuǎn)入植物中，讓其自身合成，但因合成熒光素的個(gè)別基因沒有找到，該方法目前走不通；另一個(gè)是由植物吸收熒光素，但因熒光素水溶性差，無法吸收，有的噴灑或侵泡，但都不能真正有效的解決這個(gè)問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的問題，本發(fā)明提出一種植物發(fā)光轉(zhuǎn)基因方法，把已發(fā)現(xiàn)的熒光素合成基因與熒光素酶基因一起轉(zhuǎn)入仙人球中，把合成熒光素的水溶性的半成品的氨基酸加入水中，讓植物吸收，就能最終合成熒光素，從而獲得真正意義上的發(fā)光植物。
[0011]具體的，本發(fā)明的所述的一種植物發(fā)光轉(zhuǎn)基因方法包括如下步驟:熒光素酶基因群PCR擴(kuò)增；熒光素酶基因群與PM-18T載體的構(gòu)建；基因測(cè)序；融合基因轉(zhuǎn)入大腸桿菌，測(cè)序；目的基因與表達(dá)載體的連接；特定啟動(dòng)子與表達(dá)載體的構(gòu)建；融合基因轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌(電轉(zhuǎn)化法)；將基因及熒光素的合成前提物一起轉(zhuǎn)入植物；以及進(jìn)行轉(zhuǎn)代篩選穩(wěn)定發(fā)光植物體。
[0012]根據(jù)本發(fā)明的另一目的，本發(fā)明還提出一種利用上述的轉(zhuǎn)基因方法獲得的發(fā)光仙人球。
[0013]本發(fā)明的植物發(fā)光轉(zhuǎn)基因·方法可以實(shí)現(xiàn)發(fā)光植物的產(chǎn)業(yè)化，增強(qiáng)園林景觀效果，開發(fā)旅游生態(tài)園，促進(jìn)花卉產(chǎn)業(yè)的大發(fā)展；同時(shí)，利用發(fā)光植物造景還可減少花園景觀持續(xù)的照明用電的需求，減少能源消耗。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]通過下面結(jié)合附圖的詳細(xì)描述，本發(fā)明前述的和其他的目的、特征和優(yōu)點(diǎn)將變得顯而易見。其中:
[0015]圖1所示為熒光素的分子結(jié)構(gòu)圖；
[0016]圖2所示為本發(fā)明的植物發(fā)光轉(zhuǎn)基因方法的步驟流程圖。
【具體實(shí)施方式】
[0017]參見圖2所示的為本發(fā)明的植物發(fā)光轉(zhuǎn)基因方法的步驟流程圖，所述方法包括步驟:
[0018]螢火中熒光素酶基因群PCR (Polymerase Chain Reaction，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))擴(kuò)增；
[0019]熒光素酶基因群與pM-18T載體的構(gòu)建；
[0020]基因測(cè)序；
[0021]融合基因轉(zhuǎn)入大腸桿菌，測(cè)序；
[0022]目的基因與表達(dá)載體的連接；
[0023]特定啟動(dòng)子與表達(dá)載體的構(gòu)建；
[0024]利用電轉(zhuǎn)化法將融合基因轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌；
[0025]將基因及熒光素的合成前提物一起轉(zhuǎn)入植物；以及
[0026]進(jìn)行轉(zhuǎn)代篩選穩(wěn)定發(fā)光植物體。[0027]本實(shí)施例中的螢火中突光素酶為由北美螢火蟲(Photinus pyralis)提取出的螢火蟲熒光素酶，其是由551個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的單一多肽鏈。把該基因與熒光素合成的相關(guān)基因群一起轉(zhuǎn)入仙人球中，把合成熒光素的水溶性的半成品(氨基酸類似物)加入水中，讓植物吸收，就能最終合成熒光素，從而獲得發(fā)光仙人球。
[0028]植物在黑暗中發(fā)出亮光的情節(jié)富有浪漫氣息，頗具吸引力，令人回味無窮。人們對(duì)植物和鮮花照亮夜晚的可能性充滿了期待，這是一個(gè)具有驚人市場(chǎng)潛力的市場(chǎng)。主要表現(xiàn)在:
[0029]1、發(fā)光植物必可撼動(dòng)花卉業(yè)，相信它們將在此行業(yè)占據(jù)主導(dǎo)地位，消費(fèi)者在戶內(nèi)或私人花園中或婚慶看到活的植物發(fā)出亮光，那必將賞心悅目；
[0030]2、發(fā)光植物技術(shù)可以增強(qiáng)園林景觀效果，以此開發(fā)旅游生態(tài)園。此技術(shù)可以用于一年生和多年生景觀和花壇植物，皆可形成獨(dú)特而美麗的景觀效果；發(fā)光產(chǎn)品也將使季節(jié)性展覽受益，其前景廣闊；
[0031]3、用發(fā)光植物造景或許還有助于節(jié)電，可減少花園景觀持續(xù)的照明用電的需求。
[0032]利用本發(fā)明的方法獲得的轉(zhuǎn)入熒光素酶基因及熒光素合成的相關(guān)基因的仙人球，能在黑夜中發(fā)出明亮的熒光，而在白晝看不到；雖然發(fā)光總體上偏弱，但已經(jīng)證明本發(fā)明的技術(shù)方案在實(shí)際應(yīng)用中的可行性。應(yīng)該說，本發(fā)明的技術(shù)方案已經(jīng)為上述的發(fā)光植物市場(chǎng)打開了大門，并可帶來此領(lǐng)域的可以預(yù)見的大力發(fā)展。
[0033]本發(fā)明并不局限于所述的實(shí)施例，本領(lǐng)域的技術(shù)人員在不脫離本發(fā)明的精神即公開范圍內(nèi)，仍可作一些修正或改變，故本發(fā)明的權(quán)利保護(hù)范圍以權(quán)利要求書限定的范圍為準(zhǔn)。.
【權(quán)利要求】
1.一種植物發(fā)光轉(zhuǎn)基因方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟:螢火中熒光素酶基因群PCR擴(kuò)增；熒光素酶基因群與PM-18T載體的構(gòu)建；基因測(cè)序；融合基因轉(zhuǎn)入大腸桿菌，測(cè)序；目的基因與表達(dá)載體的連接；特定啟動(dòng)子與表達(dá)載體的構(gòu)建；利用電轉(zhuǎn)化法將融合基因轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌；將基因及熒光素的合成前提物一起轉(zhuǎn)入植物；以及進(jìn)行轉(zhuǎn)代篩選穩(wěn)定發(fā)光植物體。
2.一種利用權(quán)利要 求1所述的植物發(fā)光轉(zhuǎn)基因方法獲得的發(fā)光仙人球。
【文檔編號(hào)】C12N15/82GK103436554SQ201310396243
【公開日】2013年12月11日 申請(qǐng)日期:2013年9月4日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月4日
【發(fā)明者】顧洪雁 申請(qǐng)人:無錫添然農(nóng)林科技有限公司