一種高賴氨酸蛋白基因GhLRP及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種新的高賴氨酸蛋白基因GhLRP，該基因是從棉花基因組中克隆得到，其核苷酸序列如SEQ?ID?No.1所示。本發(fā)明利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將所述基因轉(zhuǎn)化到禾本科植物中，實(shí)現(xiàn)了提高禾本科作物種子中賴氨酸和蛋白質(zhì)含量的目的。
【專利說(shuō)明】一種高賴氨酸蛋白基因GhLRP及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地說(shuō)，涉及一種高賴氨酸蛋白基因及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]賴氨酸作為人和單胃動(dòng)物所必需的氨基酸，在主要禾谷類作物如玉米、水稻、小麥的種子中含量很低，成為主要的限制性氨基酸，嚴(yán)重影響了其營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)。
[0003]隨著生物技術(shù)的發(fā)展，采用傳統(tǒng)育種與分子育種相結(jié)合的方法，打破了物種生殖隔離的障礙，實(shí)現(xiàn)了物種之間基因的自由交流。而利用植物基因工程改良作物營(yíng)養(yǎng)及加工品質(zhì)，其應(yīng)用潛力不僅僅在于提高初級(jí)農(nóng)產(chǎn)品本身的價(jià)值，還涉及到加工成本的降低、加工工藝的簡(jiǎn)化、產(chǎn)品市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力的提高等多個(gè)環(huán)節(jié)。通過(guò)轉(zhuǎn)基因的方法提高作物中的賴氨酸含量，主要有以下幾個(gè)途徑:
[0004]1、改變賴氨酸的合成代謝途徑
[0005]植物體中涉及到的賴氨酸代謝相關(guān)途徑已經(jīng)被研究的較為透徹，主要包括天冬氨酸代謝途徑中涉及到的賴氨酸合成步驟以及賴氨酸分解相關(guān)代謝途徑。
[0006]天冬氨酸代謝途徑是一個(gè)復(fù)雜的生化過(guò)程，該過(guò)程涉及到的第一個(gè)關(guān)鍵酶天冬氨酸激酶(aspartate kinase, AK)和賴氨酸合成相關(guān)的第一個(gè)關(guān)鍵酶二氫批唳二羧酸合成酶(dihydrodipicolinate synthase, DHDPS)分別受賴氨酸和蘇氨酸等代謝終產(chǎn)物的反饋抑制調(diào)節(jié)(Azevedoet al.，1997，2006)。植物中有兩種類型的AK，即單功能酶AK和雙功能酶AK-HSDH (aspartate kinase-homoserine dehydrogenase) (Wang et al.，2007)o 單功能酶AK受賴氨酸的反饋抑制調(diào)節(jié)，玉米中共有Askl和Ask2兩個(gè)編碼單功能AK的基因，當(dāng)這些基因被突變后，AK對(duì)賴氨酸變得`不敏感，從而使游離的賴氨酸含量增加(Diedricketal., 1990; Dotson et al., 1990a, b;Muehlbaueret al.，1994a)。雙功能酶AK受蘇氨酸的反饋抑制調(diào)節(jié)，目前，在玉米cDNA中克隆出了三個(gè)編碼雙功能酶AK的基因，其中有兩個(gè)基因被分別定位在2號(hào)染色體的長(zhǎng)臂和4號(hào)染色體的短臂上(Muehlbaueret al., 1994b)。依據(jù)這些性質(zhì)與特點(diǎn)，科研工作者們通過(guò)篩選突變體的技術(shù)開展了一些研究，希望篩選到含有對(duì)賴氨酸和蘇氨酸不敏感的AK的突變體。在一些大麥突變體中，AK對(duì)賴氨酸的反饋抑制調(diào)節(jié)變得不敏感，結(jié)果使大麥種子中蘇氨酸的含量提高了幾倍，但是賴氨酸含量卻沒(méi)有被大量的提高(Bright et al., 1982;Rogneset al., 1983;Arruda et al.，1984)。同樣的，在一些玉米突變體中，蘇氨酸的含量也提高了幾倍，但是賴氨酸含量卻沒(méi)有增加(Hibberd andGreen, 1982)。對(duì)這一現(xiàn)象，Bright等人解釋說(shuō)盡管AK受到抑制,但是DHDPS的活性仍然受到賴氨酸的反饋抑制調(diào)節(jié)，從而阻礙了賴氨酸含量的增加(Bright et al.，1982)。為了解決這個(gè)問(wèn)題，一些賴氨酸不敏感的DHDPS突變體也被篩選出來(lái)(Frankard et al.，1992)，在一些突變體中，賴氨酸對(duì)DHDPS的反饋抑制作用減弱，使得植物葉片中的賴氨酸含量增加，但是種子中的賴氨酸含量卻沒(méi)有發(fā)生明顯的變化(Negrutiuet al.，1984;Azevedoetal.，2002)。
[0007]目前，一些有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的高賴氨酸玉米品種已經(jīng)作為動(dòng)物的飼料被應(yīng)用，如LY038，該轉(zhuǎn)基因株系是通過(guò)在玉米胚中特異性表達(dá)來(lái)自谷氨酸棒狀桿菌的對(duì)賴氨酸不敏感的DHDPS來(lái)實(shí)現(xiàn)的，轉(zhuǎn)基因玉米種子中游離賴氨酸的含量為0.96mg/g (干重)，而野生型只有 0.05mg/g (Lucas et al.，2007)。
[0008]2、降低醇溶蛋白含量，增加賴氨酸含量
[0009]醇溶蛋白是谷類作物中含量最為豐富的一類蛋白，缺少賴氨酸和色氨酸，因此通過(guò)降低主要醇溶蛋白的含量也可以提高種子中賴氨酸的含量。在o2突變體中，醇溶蛋白的含量減少，但是受02調(diào)控的其它一些蛋白的表達(dá)也受到了影響，以至于玉米籽粒呈現(xiàn)出opaque表型。目前，主要是通過(guò)RNAi和轉(zhuǎn)基因技術(shù)減少或抑制必需氨基酸缺乏的醇溶蛋白的表達(dá)。Segal等人構(gòu)建了使編碼22kDaa -zein基因沉默的RNAi載體，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因玉米中賴氨酸含量提到，而且玉米籽粒表型正常(Segal et al.，2003)。Huang等人構(gòu)建了使編碼19kDaa -zein基因沉默的RNAi載體，結(jié)果種子賴氨酸、色氨酸和甲硫氨酸含量均增加(Huang et al., 2004)。此后,該課題組又構(gòu)建了 RNAi的嵌合載體使19kDaa -zein和22kDaa -zein的合成積累量顯著地減少，結(jié)果玉米種子中賴氨酸和色氨酸含量均增加(Huang et al., 2006)。
[0010]3、引入編碼富含賴氨酸蛋白的基因
[0011]目前，主要有三種編碼富含賴氨酸蛋白的基因被應(yīng)用:(1)密碼子經(jīng)過(guò)改造的高賴氨酸蛋白基因；(2)人工合成的高賴氨酸基因(3)植物中或非植物中天然存在的高賴氨酸蛋白基因(Ufazet al.，2008)。
[0012](I)密碼子經(jīng)過(guò)改造的高賴氨酸蛋白基因
[0013]該方法主要是將一些主要的儲(chǔ)藏蛋白基因進(jìn)行定點(diǎn)誘變或是向其插入編碼富含賴氨酸的核苷酸序列。因此，選擇合適的誘變或插入位點(diǎn)是實(shí)驗(yàn)成功與否的關(guān)鍵，主要是選擇序列不保守的位置進(jìn)行改造，避免使經(jīng)改造的蛋白的結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性以及功能發(fā)生改變(Sun and Liu, 2004)。玉米中的醇溶蛋白是主要的儲(chǔ)藏蛋白，而且賴氨酸缺乏，因此主要是通過(guò)改造一些醇溶蛋白基因來(lái)提高種子賴氨酸含量。最早的相關(guān)報(bào)道是將編碼19kDaa-zein的基因進(jìn)行改造，然后將其mRNA注射到非洲爪蟾的卵母細(xì)胞中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)改造的19kDaa -zein在卵母細(xì)胞中的合成、加工、穩(wěn)定性以及形成蛋白體等的性質(zhì)沒(méi)有改變(Wallace et al.，1988)。Torrent等人用富含賴氨酸的序列替代Y-zeins的富含脯氨酸的序列，然后將其在玉米中超表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些經(jīng)過(guò)改造的Y-zeins在玉米胚乳相應(yīng)的位置上大量的積累(Torrent et al.，1997)。
[0014](2)人工合成的高賴氨酸基因
[0015]該方法主要是基于蛋白的結(jié)構(gòu)、折疊、功能、拓?fù)涞刃再|(zhì)設(shè)計(jì)新的蛋白?；谟衩状既艿鞍椎慕Y(jié)構(gòu)特點(diǎn)，Kim等人設(shè)計(jì)并合成了一個(gè)新的儲(chǔ)藏蛋白ASP1，該蛋白含有78.9%的必需氨基酸，在轉(zhuǎn)基因煙草的葉片中以及其它植物中能夠大量的合成與積累，使得氨基酸的含量提高(Kim et al., 1992 ；Zhang et al., 2003)。基于 α 螺旋的 coiled-coil 結(jié)構(gòu)，Keeler等人設(shè)計(jì)了一個(gè)新的蛋白CP3-5，該蛋白含有31%的賴氨酸和20%的甲硫氨酸,用種子特異性啟動(dòng)子啟動(dòng)該基因在煙草中表達(dá)后發(fā)現(xiàn)該蛋白在煙草種子中大量穩(wěn)定地積累，在一些轉(zhuǎn)基因株系中甚至能達(dá)到種子總蛋白的2%，使得賴氨酸含量大幅提高(Keeler etal., 1997)。
[0016](3)天然存在的高賴氨酸蛋白基因[0017]選擇天然存在的同源或異源的高賴氨酸基因在植物體內(nèi)表達(dá)是目前被廣泛應(yīng)用的一種方法，一些高賴氨酸植物蛋白已經(jīng)被研究并應(yīng)用到改善植物蛋白品質(zhì)方面。對(duì)于整個(gè)研究而言，高賴氨酸蛋白基因的選擇是一個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題。豆科類的蛋白賴氨酸含量較高，如將大豆球蛋白和菜豆蛋白基因在煙草種子中異源表達(dá)后，這些蛋白在煙草種子中大量穩(wěn)定地積累，使得賴氨酸含量增加(Utsumiet al., 1993; Takaiwaet al.，1995)。此外,還有一些豆類蛋白如WBLRP和VSPs在煙草或水稻中異源表達(dá)后，使賴氨酸含量提高(Gaoetal., 2001; Guenouneet al，2003)。動(dòng)物中的一些高賴氨酸基因也可以作為蛋白品質(zhì)改善的候選基因，如雞的卵清蛋白和牛的酪蛋白基因，但是這些蛋白在植物中積累量比較低(Schroeder et al., 1991;Philip et al.，ZOOOt5Bicar等人將牛奶蛋白與玉米種子特異性強(qiáng)啟動(dòng)子27kDa Y -zein連結(jié)構(gòu)建載體轉(zhuǎn)入玉米中，獲得了種子賴氨酸含量提高了 29-47%的轉(zhuǎn)基因玉米(Bicaret al.，2008)。玉米的延伸因子eEFlA (elongation factorlA)是個(gè)多功能蛋白，在玉米胚乳細(xì)胞中與圍繞蛋白體的肌動(dòng)蛋白共定位，富含賴氨酸，可能與玉米胚乳中的賴氨酸含量高度相關(guān)(Habben，et al., 1995; Sun, et al.，1997)。eEFlA可以作為一個(gè)候選的高賴氨酸基因以改善蛋白品質(zhì)，但是現(xiàn)在還沒(méi)有相關(guān)的報(bào)道。1997年劉俊起等克隆了一個(gè)花粉特異蛋白基因的cDNA(SB401) (Liu et al.，1997)，其編碼的氨基酸序列中賴氨酸含量高達(dá)16.7%，將此cDNA與玉米19kDa醇溶蛋白啟動(dòng)子連接后轉(zhuǎn)化玉米，SB401表達(dá)產(chǎn)物能在玉米籽粒中穩(wěn)定積累并使籽粒中賴氨酸和蛋白質(zhì)含量明顯提高，該方法獲得發(fā)明專利(ZL01118297.0)。后通過(guò)常規(guī)育種方法獲得了穩(wěn)定的高蛋白質(zhì)和高賴氨酸轉(zhuǎn)基因玉米自交系(Yu et al.，2004)。郎志宏等在馬鈴薯中克隆了一個(gè)SB401同源基因SBLR。SBLR基因編碼211個(gè)氨基酸，其中賴氨酸重量比為18.93%。將該基因轉(zhuǎn)入玉米，得到了 6個(gè)蛋白質(zhì)和賴氨酸含量提高均在30%以上的株系。該基因在作物品質(zhì)改良中的應(yīng)用也擁有專利(ZLO1118296.2)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0018]本發(fā)明的目的是提供一種新的高賴氨酸蛋白基因GhLRP及其應(yīng)用。
[0019]為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目 的，本發(fā)明首先提供一種來(lái)自棉花的高賴氨酸蛋白基因GhLRP,以及在嚴(yán)格條件下，可與該基因的核苷酸序列發(fā)生雜交的核苷酸序列。所述高賴氨酸蛋白基因GhLRP的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，其⑶S序列如SEQ ID N0.3所示。
[0020]本發(fā)明還提供了一種由所述高賴氨酸蛋白基因GhLRP編碼的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示，賴氨酸含量為18.97%。
[0021 ] 本發(fā)明還提供了含有所述基因的表達(dá)載體。
[0022]進(jìn)一步地，所述載體還含有一種啟動(dòng)子。
[0023]作為優(yōu)選,所述啟動(dòng)子為種子特異啟動(dòng)子F128。
[0024]所述載體的構(gòu)建方法如下:
[0025]利用雙T-DNA載體，將GhLRP基因與谷子種子特異啟動(dòng)子F128和來(lái)自胭脂堿合成酶(nos)基因的3’轉(zhuǎn)錄終止區(qū)域連接，構(gòu)建植物表達(dá)載體，以潮酶素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(hpt)作為選擇標(biāo)記基因。用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化08 X 178雜交玉米幼胚，經(jīng)潮酶素篩選獲得抗性再生植株。經(jīng)過(guò)基因組DNA PCR檢測(cè)得到88個(gè)含GhLRP基因的TO代轉(zhuǎn)基因玉米株系，將轉(zhuǎn)基因玉米自交獲得Tl代種子。通過(guò)PCR、RT-PCR和Western檢測(cè)Tl代玉米植株，將陽(yáng)性的株系種子進(jìn)行賴氨酸和蛋白質(zhì)含量的測(cè)定，從中選擇賴氨酸和蛋白質(zhì)含量均較高的3個(gè)株系繼續(xù)進(jìn)行后代的跟蹤檢測(cè)。
[0026]本發(fā)明還提供了含有所述基因的工程菌。
[0027]本發(fā)明還提供了用于擴(kuò)增高賴氨酸蛋白基因GhLRP的引物對(duì)，包括正向引物F:5' -CCMCTTTTACTCATTACTGTCTCA-3'和反向引物R:5, -TTTATGTTTCTCATGCTCTTTAGGC-3'。
[0028]本發(fā)明還提供了一種提高禾本科植物種子中蛋白質(zhì)和賴氨酸含量的方法，將含有高賴氨酸蛋白基因的植物表達(dá)載體，用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化禾本科植物，從而獲得賴氨酸和蛋白質(zhì)含量均較高的禾本科植物。
[0029]本發(fā)明以轉(zhuǎn)化08X 178雜交玉米幼胚為例,從而獲得賴氨酸和蛋白質(zhì)含量均較高的玉米株系。
[0030]本發(fā)明還提供了高賴氨酸蛋白基因GhLRP在提高禾本科種子賴氨酸含量中的應(yīng)用。
[0031]本發(fā)明的有益效果在于:
[0032]本發(fā)明所獲得的結(jié)果為玉米品質(zhì)改良提供了潛在的基因資源。同時(shí)，該方法為玉米營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)改良提供了一種新的途徑。所獲得的轉(zhuǎn)基因高賴氨酸玉米在實(shí)際生產(chǎn)中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0033]圖1為本發(fā)明GhLRP基因的⑶S序列及其編碼蛋白的氨基酸序列及組成。
[0034]圖2為本發(fā)明實(shí)施例2中pSB130_GhLRP雙元表達(dá)載體的示意圖。
[0035]圖3為本發(fā)明實(shí)施例3中玉米抗性愈傷的篩選和再生過(guò)程；
[0036]其中:A為玉米愈傷在含有15mg/L潮霉素的篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)；B為抗性愈傷的分化培養(yǎng)；C為分化出的幼苗在生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)；D為再生苗在小盆中生長(zhǎng)；E為玉米苗在溫室土壤中培養(yǎng)；F為TO代轉(zhuǎn)基因玉米。
[0037]圖4為本發(fā)明Tl代轉(zhuǎn)化玉米的分子檢測(cè)；
[0038]圖中(A)為部分轉(zhuǎn)化株系的PCR檢測(cè)電泳圖；其中:Lane I, Lane2, Lane3, Lane4, Lane5 分別為轉(zhuǎn)基因株系 F12, F33, F78, F88, F91 的檢測(cè)結(jié)果；M，DNA Marker ;WT，08X 178野生型雜交玉米作為對(duì)照；
[0039]圖中(B)為部分轉(zhuǎn)化株系的RT-PCR檢測(cè)電泳圖；其中:Lane I, Lane2, Lane3, Lane4, Lane5 分別為轉(zhuǎn)基因株系 F12, F33, F78, F88, F91 的檢測(cè)結(jié)果；
[0040]圖中(C)為部分轉(zhuǎn)化株系的Western檢測(cè)圖；其中:Lanel, Lane2, Lane3, Lane4, Lane5 分別為轉(zhuǎn)基因株系 F12, F33, F78, F88, F91 的檢測(cè)結(jié)果，每個(gè)泳道蛋白上樣量為20 μ g。
[0041]圖5為本發(fā)明T2代轉(zhuǎn)GhLRP玉米種子zein與non_zein的積累模式的分析；
[0042]圖中:㈧為zein含量；(B)為non-zein含量；(C)為野生型及轉(zhuǎn)基因株系F12, F78, F88種子醇溶蛋白的15%SDS_PAGE電泳圖，每個(gè)泳道的蛋白上樣量相當(dāng)于400 μ g成熟玉米種子粉末包含的醇溶蛋白含量。
[0043]圖6為本發(fā)明T3代轉(zhuǎn)GhLRP玉米種子外觀、容重分析及萌發(fā)率分析；
[0044]圖中:(A)為T3代轉(zhuǎn)基因玉米株系F12，F(xiàn)78和F88種子和野生型玉米種子在白熾光(上部和中部)和透射光(底部)下的表型觀察圖；(B)為玉米種子的容重分析；(C)為玉米種子的萌發(fā)率分析。
【具體實(shí)施方式】
[0045]以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。
[0046]實(shí)施例1編碼高賴氨酸蛋白基因GhLRP的克隆
[0047]根據(jù)海島棉基因組中的高賴氨酸蛋白基因Fbl2A (GenBank:U34401.1)設(shè)計(jì)克隆高賴氨酸蛋白基因 GhLRP 的引物GhLRP-5:5' -GCGTCGACCCAACTTTTACTCATTACTGTCTCA-3;和 GhLRP-3:5 ' -GGAATTCTTTATGTTTCTCATGCTCTTTAGGC-3 '。5 ’ 端引物引入 Sal I 酶切位點(diǎn)，3’端引物引入EcoRI酶切位點(diǎn)。以陸地棉基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增條件如下:95°C，變性5min ;57°C，退火0.5min ;72°C，延伸0.5min ;擴(kuò)增循環(huán)數(shù)35 ;最后72。。，延伸IOmin ;4°C保存。將PCR產(chǎn)物在0.8%瓊脂糖凝膠中電泳，用試劑盒回收目的條帶。取適量回收產(chǎn)物，與PMD19T vector連接轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)。小提該質(zhì)粒PMD18T_GhLRP，經(jīng)SalI和EcoRI酶切鑒定后測(cè)序。GhLRP基因的核苷酸序列`如SEQ ID N0.1所示，其編碼蛋白的氨基酸序列及氨基酸組成如圖1所示。
[0048]實(shí)施例2用于玉米中表達(dá)的表達(dá)載體構(gòu)建和農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化
[0049]目的基因GhLRP的表達(dá)盒由來(lái)自谷子的種子特異啟動(dòng)子F128(ZL200710099169.7)和胭脂堿合成基因nos的3’轉(zhuǎn)錄終止區(qū)域組成，選擇標(biāo)記基因?yàn)槌泵杆亓姿徂D(zhuǎn)移酶基因(hpt)，其編碼氨基糖苷4 一磷酸轉(zhuǎn)移酶APH(4)-1。載體示意圖如圖2所
示，載體包括兩個(gè)T-DNA區(qū)-T-DNAl和T-DNA2區(qū)；RB1，LBl, RB2, LB2分別指兩個(gè)T-DNA
區(qū)的右邊界和左邊界；T-DNA1區(qū)包括由F128啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GhLRP表達(dá)框；T_DNA2區(qū)包括由CaMV35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的hpt表達(dá)框。
[0050]用SalI和EcoRI將GhLRP從質(zhì)粒PMD18T_GhLRP上切下，連接到雙-T載體pSB130-SBgLR(該質(zhì)粒由香港中文大學(xué)辛世文教授提供的pSB130載體衍生而來(lái)，該質(zhì)粒上有兩個(gè)T-DNA，一個(gè)包含選擇標(biāo)記基因hpt，另一個(gè)T-DNA上有多克隆位點(diǎn)，可以克隆目的基因)，形成重組質(zhì)粒pSB130-GhLRP。采用凍融法將質(zhì)粒pSB130_GhLRP直接轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌菌株LBA4404中，獲得含有重組質(zhì)粒pSB130-GhLRP的農(nóng)桿菌LBA4404 (pSB130_GhLRP)。農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化技術(shù)為公知技術(shù)。
[0051]實(shí)施例3用含pSB130_GhLRP的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化玉米幼胚
[0052]農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化玉米幼胚的方法是一個(gè)比較成熟的轉(zhuǎn)化方法，具體步驟如下:
[0053]1、玉米的控制授粉
[0054]( I)玉米抽雄后，在授粉的前一天，用大口袋套住雄穗，下面用別針別住，收集花粉；
[0055](2)雌穗花絲未抽出前，用小口袋將其套住，并用大頭針別好；
[0056](3)在授粉的前一天，當(dāng)花絲伸出約2cm長(zhǎng)時(shí)，用剪刀剪去花絲的頂部，促進(jìn)其伸長(zhǎng);
[0057](4)第二天，當(dāng)花絲伸長(zhǎng)后，進(jìn)行授粉；
[0058](5)授粉后系上小牌，寫上授粉的品種和日期，10-12天后收獲。
[0059]2、幼胚的剝離[0060](I)取授粉后10-12天，幼胚大小為1.5-2.0mm的08 X 178雜交玉米雌穗；
[0061](I)將新收獲的玉米雌穗去掉苞葉、花絲，花絲一定要去干凈，可用酒精燈將未除凈的花絲燒去；用小刀去掉雌穗的頭尾部分；
[0062](2)將雌穗浸在70%乙醇(加幾滴Tween20)中滅菌IOsec ；
[0063](3)將雌穗取出，置于無(wú)菌的環(huán)境中備用；
[0064](4)將一只槍式鑷子從頂部插入雌穗，用左手持住鑷子，右手用裝有#22刀片的手術(shù)刀切去籽粒的上半部分；
[0065](5)換上#10刀片，將刀尖插入籽粒下部的果皮與胚乳之間，將胚乳挑出；
[0066](6)用刀尖將粘在胚乳頂部或頂部果皮內(nèi)的幼胚轉(zhuǎn)移到基本培養(yǎng)基上，操作要小心，不要損傷幼胚。
[0067]3、農(nóng)桿菌的制備
[0068](I)從保存的菌板上挑一環(huán)菌接到Y(jié)EB (含125mg/L Sm和100mg/L Kan)平板培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)兩天(或20°C培養(yǎng)三天)；
[0069](2)收集菌體，用侵染培養(yǎng)基調(diào)菌液至0D600=0.3-0.4，28°C，180rpm避光搖菌1-2小時(shí)備用。
[0070]4、幼胚的農(nóng)桿菌侵染
[0071](I)在2ml滅菌的離心管中加入1.5ml的浸染培養(yǎng)基，用小刀片把幼胚從平板上挑至離心管中，用移液器輕輕吹打`，在30min內(nèi)共洗兩次；
[0072](2)吸出浸染培養(yǎng)基，加入1.5ml準(zhǔn)備好的菌液，避光緩慢顛倒20次后靜置，此過(guò)程為IOmin ；
[0073](3)將幼胚連同菌液倒在鋪有無(wú)菌濾紙的培養(yǎng)皿中，超凈臺(tái)中吹干，但不要使幼胚失水；
[0074](4)將吹干的幼胚轉(zhuǎn)移至共培養(yǎng)培養(yǎng)基中，盾片朝上，20°C避光共培養(yǎng)三天。
[0075]5、恢復(fù)培養(yǎng)
[0076]將共培養(yǎng)三天的幼胚轉(zhuǎn)移到恢復(fù)培養(yǎng)基中。如果共培養(yǎng)的幼胚長(zhǎng)菌，可將長(zhǎng)菌的幼胚小心地挑到2ml滅菌的離心管中，用無(wú)菌水洗直至洗凈，然后用含有100mg/L頭孢霉素的無(wú)菌水洗30min，最后將幼胚連同無(wú)菌水倒在鋪有無(wú)菌濾紙的培養(yǎng)皿中吹干，再將幼胚轉(zhuǎn)移到恢復(fù)培養(yǎng)基中，28°C黑暗培養(yǎng)7天。
[0077]6、篩選培養(yǎng)
[0078]將恢復(fù)培養(yǎng)的幼胚轉(zhuǎn)移到篩選培養(yǎng)基中暗培養(yǎng)，每?jī)芍芾^代一次。一般情況下，篩選時(shí)潮霉素的濃度分別為5mg/L、10mg/L、15mg/L和20mg/L,篩選次數(shù)和最終潮霉素的濃度視情況而定。
[0079]7、篩選后的誘導(dǎo)
[0080]將篩選后的愈傷轉(zhuǎn)移到高糖培養(yǎng)基中，暗培養(yǎng)兩周。
[0081]8、分化培養(yǎng)
[0082]將恢復(fù)培養(yǎng)兩周的抗性愈傷轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基中，見光培養(yǎng)，光照周期為光照/黑暗:16h/8h，每?jī)芍芾^代一次。
[0083]9、生根培養(yǎng)
[0084]待分化出的幼苗長(zhǎng)至2_3cm時(shí)，將幼苗從抗性愈傷上切下，移入罐頭瓶的生根培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)生根，當(dāng)幼苗及根系粗壯后即可煉苗移栽。
[0085]10、再生苗的煉苗移栽
[0086]將小苗移到溫室中放置2-3天后，將封口膜打開，加入一層無(wú)菌水，再放置2-3天。然后將小苗移栽入小盆中(草炭土和蛭石按1:1比例)，移栽時(shí)將根部的瓊脂清洗干凈，以防被微生物滋生，同時(shí)注意避免損傷根系。將栽入小盆的小苗放在塑料拱棚中培養(yǎng)，待小苗比較壯實(shí)后移入溫室土壤中繼續(xù)培養(yǎng)。
[0087]玉米抗性愈傷的篩選和再生過(guò)程見圖3。潮霉素篩選后的抗性愈傷經(jīng)誘導(dǎo)后被轉(zhuǎn)移至分化培養(yǎng)基中見光培養(yǎng)(圖3B)，分化出的幼苗從愈傷組織上切下轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根(圖3C)，待小苗的根系比較發(fā)達(dá)時(shí)移到溫室，煉苗后種到小花盆里(圖3D)，種子成熟后及時(shí)收獲(圖3F)。
[0088]轉(zhuǎn)化各步驟中使用的培養(yǎng)基成分如下:
【權(quán)利要求】
1.一種高賴氨酸蛋白基因GhLRP，其特征在于，所述高賴氨酸蛋白基因GhLRP的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
2.一種由權(quán)利要求1所述的高賴氨酸蛋白基因GhLRP編碼的蛋白，其特征在于，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
3.含有權(quán)利要求1所述基因的表達(dá)載體。
4.如權(quán)利要求3所述的載體，其特征在于，所述載體還含有一種啟動(dòng)子。
5.如權(quán)利要求4所述的載體，其特征在于，所述啟動(dòng)子為種子特異啟動(dòng)子F128。
6.含有權(quán)利要求1所述基因的工程菌。
7.用于擴(kuò)增高賴氨酸蛋白基因GhLRP的引物對(duì)，其特征在于，包括正向引物F:5' -CCMCTTTTACTCATTACTGTCTCA-3'和反向引物R:5, -TTTATGTTTCTCATGCTCTTTAGGC-3'。
8.一種提高禾本科植物種子中蛋白質(zhì)和賴氨酸含量的方法，包括將權(quán)利要求3所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化禾本科植物。
9.高賴氨酸蛋白基因GhLRP在提高 禾本科種子賴氨酸含量中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N15/29GK103484473SQ201310398102
【公開日】2014年1月1日 申請(qǐng)日期:2013年9月4日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月4日
【發(fā)明者】于靜娟, 趙倩, 朱登云, 岳靜, 李叢 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)