一種化學(xué)發(fā)光測定三聚氰胺的方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于化學(xué)發(fā)光傳感器領(lǐng)域，涉及利用目標(biāo)誘導(dǎo)鏈釋放技術(shù)，結(jié)合雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和化學(xué)發(fā)光技術(shù)測定三聚氰胺（Me）的方法。當(dāng)有目標(biāo)物Me存在時(shí)，Me與功能化磁珠FMB1表面的雙鏈DNA中的適體DNA1作用，釋放出適體的互補(bǔ)序列DNA2。釋放出來的互補(bǔ)序列DNA2與另一功能化的磁珠（FMB2）作用，在修飾HRP的發(fā)夾DNA（HRP-H1和HRP-H2）存在下進(jìn)行鏈?zhǔn)诫s交反應(yīng)，使兩種修飾的DNA生長成為一條長的雙鏈DNA。通過磁性分離，再利用HRP對luminol-H2O2化學(xué)發(fā)光體系的催化作用產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光，通過測定化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度實(shí)現(xiàn)Me的測定。本方法具有高的選擇性和檢測靈敏度。
【專利說明】一種化學(xué)發(fā)光測定三聚氰胺的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于分析化學(xué)和化學(xué)發(fā)光傳感器領(lǐng)域，涉及利用目標(biāo)誘導(dǎo)鏈釋放技術(shù)，結(jié)合雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和化學(xué)發(fā)光測定技術(shù)建立了一種測定三聚氰胺的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]三聚氰胺(Melamine)(化學(xué)式=C3H6N6),俗稱密胺、蛋白精，IUPAC命名為:1，3，5-三嗪-2，4，6-三胺，是一種三嗪類含氮雜環(huán)有機(jī)化合物，被用作化工原料。對身體有害，不可用于食品加工或食品添加物。
[0003]目前發(fā)展的三聚氰胺檢測方法包括酶聯(lián)免疫法(ChoiJ H, Kim Y T,Lee J H.Rapid quantification of melamine in milk using competitive1， I1-oxalyldiimidazole chemiluminescent enzyme immunoassay.Analyst, 2010，135:2445)、質(zhì)譜法(Yang S P，Ding J H，Zheng J.Detection of melamine in milkproducts by surface desorption atmospheric pressure chemical ionization massspectrometry.Analytical Chemistry, 2009，81:2426)、表面增強(qiáng)拉曼光譜法(Hu HBj Wang Z H， Pan L.Ag—coated Fe3O4QSiO2 three-ply composite microspheres:synthesis, characterization, and application in detecting melamine with theirsurface-enhanced Raman scattering.The Journal of Physical Chemistry C， 2010，114:7738 ;Kim A，Barcelo S J，Williams R Sj Li Z Y.Melamine sensing in milkproducts by using surface enhanced Raman scattering.Analytical Chemistry2012，84:9303)、納米金顆粒比色法(Qi W J，Ling J，Huang C Z.Visual and lightscattering spectrometrie detections of melamine with polythymine-stabilizedgold nanoparticles through specific triple hydrogen-bonding recognition.Chemical Communications, 2010， 46:4893 ；Ai K L， Liu Y Lj Lu L H.Hydrogen-bonding recognition-1nduced color change of gold nanoparticles forvisual detection of melamine in raw milk and infant formula.Journal of theAmerican Chemical Society, 2009，131:9496)和電化學(xué)方法(趙暢，余波，陳振興，晉冠平，類分子印跡納米多孔膜修飾電極制備三聚氰胺電化學(xué)傳感器，食品科學(xué)，2012，33214 ；Zhu H，Zhang S X，Li M X.Electrochemical sensor for melamine based on itscopper complex.Chemical Communications, 2010，46: 225)等。這些方法各有其優(yōu)點(diǎn)，能不同程度的滿足對三聚氰胺的檢測要求，但方法或者靈敏度不高、或者需要昂貴的儀器。所以必須發(fā)展一種靈敏度高，簡單的新型檢測方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]基于目標(biāo)誘導(dǎo)鏈釋放和雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)化學(xué)發(fā)光測定三聚氰胺的方法的研究:當(dāng)有目標(biāo)物Me存在時(shí)，目標(biāo)物與功能化磁珠表面的雙鏈DNA中的適體DNAl作用，從而釋放出適體的互補(bǔ)序列DNA2 ;釋放出來的互補(bǔ)序列DNA2與另一功能化的磁珠作用，在修飾HRP的發(fā)夾DNA (HRP-Hl和HRP-H2)存在下進(jìn)行鏈?zhǔn)诫s交反應(yīng)，使兩種發(fā)夾DNA生長成為一條長的雙鏈DNA。通過磁性分離，再利用HRP對Iuminol-H2O2化學(xué)發(fā)光體系的催化作用產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光，通過測定化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度實(shí)現(xiàn)對Me的測定。
[0005]本發(fā)明是通過以下措施來實(shí)現(xiàn)的:基于目標(biāo)誘導(dǎo)鏈釋放和雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)化學(xué)發(fā)光測定三聚氰胺的方法的研究，其特征是包括以下步驟:
(1)制備出FMBl和FMB2;
(2)制備HRP修飾的Hl和H2；
(3)利用基于目標(biāo)誘導(dǎo)鏈釋放和雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和化學(xué)發(fā)光檢測技術(shù)對Me進(jìn)行定量分
析；
(4)利用所建立的方法，對樣品進(jìn)行檢測。
[0006]本發(fā)明所述的功能化磁性金納米粒子(FMBl)制備包括以下步驟:將1.0 ml的磁性金納米粒子用2.0 ml的0.1 M磷酸緩沖液(pH 7.0)洗滌3次，然后加入200 μ I
1.0XlO-5 M的DNAl和1.0X 1(T5 M的DNA2混合物，在37° C下反應(yīng)12小時(shí)。最后將所得的功能化磁性金納米粒子(FMBl)用2.0 ml的0.1 M的磷酸緩沖液洗滌3次，然后分散在2.0 ml磷酸緩沖液中，保存在4° C下備用。
[0007]本發(fā)明所述的功能化磁性金納米粒子(FMB2)制備包括以下步驟:將1.0 ml的磁性金納米粒子用2.0 ml的0.1 M磷酸緩沖液(pH 7.0)洗滌3次，然后加入100 μ I
1.0X 10_5 M的Η1，在37° C下反應(yīng)12小時(shí)。最后將所得的功能化磁性金納米粒子(FMB2)用2.0 ml的0.1 M的磷酸緩沖液洗滌3次，然后分散在2.0 ml磷酸緩沖液中，保存在4° C下備用。
[0008]本發(fā)明所述的HRP修飾的Hl和H2制備包括以下步驟:在100 μ I 1.0Χ10-5Μ的Hl或Η2的(pH為7.4的磷酸緩沖溶液)加入10 mg NHS, 20 mg EDC,在37 ° C下攪拌I小時(shí)。然后加入100 μ I HRP，在37 ° C下攪拌過夜，得HRP-Hl或HRP-H2復(fù)合物。
[0009]一種對Me的檢測的方法，其特征是:取Me標(biāo)準(zhǔn)溶液或的樣品溶液50 μ L加入到200 yL的FMBl溶液，37° C反應(yīng)40分鐘，然后混合物在磁力架上分離。將上述上清液轉(zhuǎn)移到裝有FMB2溶液的試管中。然后加入含有5.0X 1(T7 M HRP-Hl和5.0X 1(T7 M HRP-H2溶液200 yL。在37 V反應(yīng)I h后進(jìn)行磁分離，除去上清液。將磁珠用100 μ L磷酸緩沖溶液(pH 7.0)清洗兩遍后，分散于1.0 ml磷酸緩沖溶液(pH 7.0)中，然后進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測。
[0010]本發(fā)明所述的樣品制備包括以下步驟:稱取10 g鮮奶，加入10 mL Cl3CCOOH和50 mL CH3OH混合溶液中，超聲15 min,在10000 r/min轉(zhuǎn)速下離心10 min后取上清液,用
0.45 ym的濾網(wǎng)膜過濾，對所得濾液進(jìn)行分析測定，并進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)。
[0011]具體實(shí)驗(yàn)原理如圖1所示。
[0012]雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)反應(yīng)時(shí)間對化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的影響如圖2所示。
[0013]MG標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖3所示。
[0014]鮮奶樣品中三聚氰胺的測定檢測結(jié)果如表I所示。
[0015]本發(fā)明中的化學(xué)發(fā)光檢測條件，具體特征如下:
(I)檢測雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)反應(yīng)時(shí)間。優(yōu)選的，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。隨著反應(yīng)時(shí)間增加，化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度逐漸增大。但在反應(yīng)進(jìn)行到60 min之后化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的增加幅度減緩。所以，實(shí)驗(yàn)選擇60 min作為最佳的雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)反應(yīng)時(shí)間。
[0016]分析性能如下:
本發(fā)明在最佳條件下，考察了 Me濃度與化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的關(guān)系。如圖3所示，結(jié)果表明隨著Me濃度增大，化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度越大，并且化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度與Me濃度在I nM?5000 nM范圍內(nèi)成非線性關(guān)系:y = 547143.47*exp (x/4223147) - 4286.23*exp (-χ/669.24)-542818.62，R2= 0.9986 (y:化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度；x:Me濃度，單位:ηΜ ; η = 7)。化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度與Me濃度在I nM?100 nM范圍成內(nèi)線性關(guān)系:y = 6.9027x + 29.317，R2 = 0.9987，檢測限為0.3 nM。對50 nM的Me進(jìn)行7次平行測定的RSD為3.8%。
[0017]檢測體系對Me的選擇性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)Me的濃度為10_7 mo I/L時(shí)，誤差在5%的范圍內(nèi) 1000 倍的 K+、Na+、Mg2+、Ca2+、Fe3+、NH4+、Ba2+、Zn2+、Cr、N(V、S042'P043'C032'C2(V、葡萄糖、色氨酸、賴氨酸、組氨酸、精氨酸、維生素B2和維生素C ；500倍的Fe2+、抗壞血酸、腺嘌呤、鳥嘌呤，尿酸、ATP、甲硫氨酸、半胱氨酸；100倍的Cd2+、Sn2+和Pb2+均不干擾該方法對Me的響應(yīng)。表明方法具有高的選擇性。
[0018]雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的鏈增長是通過Hl和H2序列進(jìn)行交替連接而成的，因此兩種序列對于雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系來說缺一不可。為了進(jìn)一步研究反應(yīng)中雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的生長效率，在對比實(shí)驗(yàn)中只加入HRP-H2，保證一個(gè)目標(biāo)物Me對應(yīng)一個(gè)HRP，根據(jù)HRP-1uminol-H2O2化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度，對目標(biāo)物進(jìn)行定量。根據(jù)線性范圍的下線確定雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的放大倍數(shù)。隨著Me濃度的增大，化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度越大，并且化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度與Me濃度在70 nM?1000 nM范圍內(nèi)呈線性關(guān)系:y = 0.8891x - 38.652，R2 = 0.9994，檢測限為45 nM。如以線性范圍的下限為對象對靈敏度進(jìn)行比較，則雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)靈敏度為非雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的70倍。
[0019]通過檢測液態(tài)奶中三聚氰胺的含量來檢驗(yàn)方法的可靠性。并利用加標(biāo)回收法對該方法進(jìn)行了考察，結(jié)果列于表I?；厥章试?8.0%?100.3%之間，表明此方法在復(fù)雜基底中測定Me具有良好的準(zhǔn)確度。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0020]圖1為本發(fā)明的具體實(shí)驗(yàn)原理圖。
[0021]圖2為雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)反應(yīng)時(shí)間對化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的影響。
[0022]圖3為MG濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
【具體實(shí)施方式】
[0023]下面的實(shí)例將具體說明本發(fā)明的操作方法，但不能作為對本發(fā)明的限定。
[0024]實(shí)例:基于目標(biāo)誘導(dǎo)鏈釋放和雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)化學(xué)發(fā)光測定三聚氰胺的方法
1.實(shí)驗(yàn)部分
1.1儀器與試劑
1- (3-二甲氨基醛)-3-乙基二亞胺鹽酸鹽(EDC)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)購自天津市巴斯夫化工有限公司。魯米諾(Iuminol)購自上海阿拉丁試劑公司。HRP (辣根過氧化物酶)購自上海順適生物技術(shù)有限公司。
[0025]所用人工合成DNA序列由北京賽百盛生物工程有限公司購得，序列如下:
DNAl 的部分序列為:5/ -TTT TTT TTT TTT CCA AAA GGG-(CH2)6U DNA2 的部分序列為:5' -TGG AAA AAA AAA AAA-3'
Hl 的部分序列為:5' -NH2-(CH2)6-GCG AGG TTT TTT TTT TTT CCA GCG CCG CAC AGATGG AAA AAA AAA AAA-3,
H2 的部分序列為:5' -TGG AAA AAA AAA AAA AGG GTA GCG CCG TTT TTT TTT TTTCCA ATT AGA-(CH2)6-NH2I'
IFFM-E型流動注射化學(xué)發(fā)光分析儀(西安瑞邁分析儀器有限公司)；MP1-E型電化學(xué)發(fā)光分析系統(tǒng)(西安瑞邁分析儀器有限公司);THZ-82A氣浴恒溫振蕩器(全壇市醫(yī)療儀器廠)。
[0026]1.2實(shí)驗(yàn)步驟 1.2.1 FMBl的制備
將1.0 ml的磁性金納米粒子用2.0 ml的0.1 M磷酸緩沖液(pH 7.0)洗滌3次，然后加入200 u I 1.0X KT5M的DNAl和1.0X KT5M的DNA2混合物，在37° C下反應(yīng)12小時(shí)。最后將所得的功能化磁性金納米粒子(FMBl)用2.0 ml的0.1 M的磷酸緩沖液洗滌3次，然后分散在2.0 ml磷酸緩沖液中，保存在4° C下備用。
[0027]1.2.2 FMB2 的制備
將1.0 ml的磁性金納米粒子用2.0 ml的0.1 M磷酸緩沖液(pH 7.0)洗滌3次，然后加入100 u I 1.0父10_1的111，在37° C下反應(yīng)12小時(shí)。最后將所得的功能化磁性金納米粒子(FMB2)用2.0 ml的0.1 M的磷酸緩沖液洗滌3次，然后分散在2.0 ml磷酸緩沖液中，保存在4° C下備用。
[0028]1.2.3 HRP修飾的Hl和H2的制備
在100 u I 1.0XlO-5 M的Hl或H2的(pH為7.4的磷酸緩沖溶液)加入10 mg NHS,20 mg EDC，在37 ° C下攪拌I小時(shí)。然后加入100 u I HRP，在37 ° C下攪拌過夜，得HRP-Hl 和 HRP-H2 復(fù)合物。
[0029]1.2.4 Me 檢測
取含Me的標(biāo)準(zhǔn)溶液50 ii L加入到200 y L的FMBl溶液，37 ° C反應(yīng)40分鐘，然后混合物在磁力架上分離。將上述上清液轉(zhuǎn)移到裝有FMB2溶液的試管中。然后加入含有
5.0XlO-7M HRP-Hl 和 5.0XKT7 M HRP-H2 溶液 200 y L。在 37 °C 反應(yīng) I h 后進(jìn)行磁分離，除去上清液。將磁珠用100 u L磷酸緩沖溶液(pH 7.0)清洗兩遍后，分散于1.0 ml磷酸緩沖溶液(pH 7.0)中，然后進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測。
[0030]1.2.5樣品的制備
稱取10 g鮮奶，加入10 mL Cl3CCOOH和50 mL CH3OH混合溶液中，超聲15 min，在10000 r/min轉(zhuǎn)速下離心10 min后取上清液,使用0.45 V- m的濾網(wǎng)膜過濾,對所得濾液進(jìn)行分析測定，并進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)
1.3結(jié)果與討論
如圖2所示，隨著反應(yīng)時(shí)間增加，化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度逐漸增大。但在反應(yīng)進(jìn)行到60 min之后化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的增加幅度減緩。實(shí)驗(yàn)選擇60 min作為最佳的雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)反應(yīng)時(shí)間。[0053] 考察了食品中常含有的離子、氨基酸、維生素等成分對該方法測定Me的選擇性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)Me的濃度為10_7 mo I/L時(shí)，誤差在5%的范圍內(nèi)1000倍的K+、Na+、Mg2+、Ca2+、Fe3+、NH4\ Ba2+、Zn2+、Cl—、NO3' SO42' PO43' CO32' C2O4'葡萄糖、色氨酸、賴氨酸、組氨酸、精氨酸、維生素B2和維生素C ；500倍的Fe2+、抗壞血酸、腺嘌呤、鳥嘌呤，尿酸、ATP、甲硫氨酸、半胱氨酸；100倍的Cd2+、Sn2+和Pb2+均不干擾該方法對Me的響應(yīng)。表明方法具有高的選擇性，本方法具有應(yīng)用到真實(shí)樣品檢測的可行性。
[0031]考察了 Me濃度與化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的關(guān)系。如圖3所示，結(jié)果表明隨著Me濃度增大，化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度越大，并且化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度與Me濃度在I nM?5000 nM范圍內(nèi)成非線性關(guān)系:y = 547143.47*exp (x/4223147) - 4286.23*exp (_x/669.24) - 542818.62，R2 =
0.9986?；瘜W(xué)發(fā)光強(qiáng)度與Me濃度在I nM?100 nM范圍成內(nèi)線性關(guān)系:y = 6.9027x +29.317，R2 = 0.9987，檢測限為0.3 nM。對50 nM的Me進(jìn)行7次平行測定的RSD為3.8%。
[0032]雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的鏈增長是通過Hl和H2序列進(jìn)行交替連接而成的，因此兩種序列對于雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系來說缺一不可。為了進(jìn)一步研究反應(yīng)中雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的生長效率，在對比實(shí)驗(yàn)中只加入HRP-H2，保證一個(gè)目標(biāo)物Me對應(yīng)一個(gè)HRP，根據(jù)HRP-1uminol-H2O2化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度，對目標(biāo)物進(jìn)行定量。根據(jù)線性范圍的下線確定雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的放大倍數(shù)。隨著Me濃度的增大，化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度越大，并且化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度與Me濃度在70 nM?1000 nM范圍內(nèi)呈線性關(guān)系:y = 0.8891x - 38.652，R2 = 0.9994，檢測限為45 nM。如以線性范圍的下限為對象對靈敏度進(jìn)行比較，則雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)靈敏度為非雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的70倍。
[0033]通過檢測液態(tài)奶中三聚氰胺的含量來檢驗(yàn)方法的可靠性。并利用加標(biāo)回收法對該方法進(jìn)行了考察，結(jié)·果列于表I?；厥章试?8.0%?100.3%之間，表明此方法在復(fù)雜基底中測定Me具有良好的準(zhǔn)確度。
[0034]表I鮮奶樣品中三聚氰胺的測定結(jié)果。
【權(quán)利要求】
1.一種化學(xué)發(fā)光測定三聚氰胺的方法，其特征是包括以下步驟: FMBl的制備:將磁性金納米粒子用磷酸緩沖液洗滌后，加入200 μ I 1.0X 10_5 M的DNAl和1.0X 10_5 M的DNA2混合物，在37° C下反應(yīng)12小時(shí)；將所得的功能化磁性金納米粒子(FMBl)用磷酸鹽緩沖液洗滌，然后分散在磷酸鹽緩沖液中，保存在4° C下備用； FMB2的制備:將磁性金納米粒子用磷酸緩沖液洗滌后，100 μ I 1.0X 10_5 M的Η1，在37° C下反應(yīng)12小時(shí)；將所得的功能化磁性金納米粒子(FMB2)用磷酸鹽緩沖液洗滌，然后分散在磷酸鹽緩沖液中，保存在4° C下備用； 制備HRP (辣根過氧化物酶)修飾的Hl:在100 μ I 1.0XlO-5 M的Hl加入10 mg NHS(N-羥基琥珀酰亞胺)，20 mg EDC(l-(3-二甲氨基醛)-3-乙基二亞胺鹽酸鹽)，在37 ° C下攪拌I小時(shí)，然后加入100 μ I HRP，在37 ° C下攪拌過夜，即得； 制備HRP修飾的Η2:在 100 μ I 1.0Xl(T5] 9H2W；U0mgNHS，20 mg EDC，在 37 ° C下攪拌I小時(shí)，然后加入100 μ I HRP，在37 ° C下攪拌過夜，即得； .1.5 Me (三聚氰胺)的檢測:取含Me的標(biāo)準(zhǔn)溶液50 μ L加入到200 μ L的FMBl溶液，37° C反應(yīng)40分鐘，然后混合物在磁力架上分離，將上清液轉(zhuǎn)移到FMB2溶液中；然后加入含有 5.0 X 1(7Μ HRP-Hl 和 5.0Χ1(7 M HRP-H2 溶液 200 yL，在 37 °C 反應(yīng) I h 后進(jìn)行磁分離，除去上清液，將磁珠用100 μ L磷酸緩沖溶液清洗兩遍后，分散于1.0 ml磷酸緩沖溶液中，然后進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測。
2.權(quán)利要求1所述的DNA序列為: .2.1 DNAl 的部分序列為:5' -TTT TTT TTT TTT CCA AAA GGG-(CH2)6_SH_3 ； .2.2 DNA2 的部分序列為:5' -TGG AAA AAA AAA AAA-3'； .2.3 Hl 的部分序列為:5/ -NH2-(CH2)-GCG AGG TTT TTT TTT TTT CCA GCG CCG CACAGA TGG AAA AAA AAA AAA-3,； .2.4 H2 的部分序列為:5' -TGG AAA AAA AAA AAA AGG GTA GCG CCG TTT TTT TTTTTT CCA ATT AGA-(CH2)6-NH2I'。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化學(xué)發(fā)光測定三聚氰胺的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N15/11GK103439320SQ201310398470
【公開日】2013年12月11日 申請日期:2013年9月4日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月4日
【發(fā)明者】混旭 申請人:青島科技大學(xué)