一種原核基因工程雜合陽(yáng)離子抗菌肽cc的獲得及其發(fā)酵方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種重組雜合陽(yáng)離子抗菌肽CC的大腸桿菌基因工程菌的獲得方法。本發(fā)明的原理為，通過(guò)生物信息學(xué)與分子生物學(xué)技術(shù)相結(jié)合的方法，選取有醫(yī)療潛力的天然抗菌肽，進(jìn)行抗菌肽的分子設(shè)計(jì)，翻譯后合成基因序列，經(jīng)過(guò)克隆載體構(gòu)建、表達(dá)載體構(gòu)建等技術(shù)程序構(gòu)建雜合抗菌肽CC大腸桿菌基因工程菌。通過(guò)在GST標(biāo)簽與抗菌肽之間設(shè)置DPP三肽序列，表達(dá)后進(jìn)行純化。通過(guò)乳糖誘導(dǎo)代替IPTG誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化來(lái)降低成本，優(yōu)化培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基組成，與發(fā)酵相結(jié)合。對(duì)其進(jìn)行的生物學(xué)活性鑒定結(jié)果表明，其高效的抗菌活性、對(duì)熱和pH穩(wěn)定以及極微弱的溶血活性使其在食品、飼料以及養(yǎng)殖業(yè)上具有廣闊的應(yīng)用前景。
【專利說(shuō)明】—種原核基因工程雜合陽(yáng)離子抗菌肽CC的獲得及其發(fā)酵
方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及基因工程和生物【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其是涉及一種原核基因工程雜合陽(yáng)離子抗菌肽CC的獲得與發(fā)酵方法。
【背景技術(shù)】
[0002]抗菌肽是動(dòng)、植物和人類先天性免疫機(jī)制的組成部分，在機(jī)體受到病毒、細(xì)菌等攻擊時(shí)被誘導(dǎo)產(chǎn)生。抗菌肽具有廣譜抗菌作用，尤其是對(duì)一些產(chǎn)生抗生素耐藥性的病原菌的殺滅作用更引起了人們對(duì)它的興趣。抗菌肽在農(nóng)業(yè)、醫(yī)療、食品等領(lǐng)域的應(yīng)用潛力巨大。迄今為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了上千種天然抗菌肽，但是具有較好的醫(yī)療選擇指數(shù)的種類卻比較少，因此，人們希望通過(guò)分子上的重新設(shè)計(jì)，例如，雜合肽的設(shè)計(jì)等方式從豐富的天然抗菌肽資源中獲得理想的新型人工抗菌肽。
[0003]雜合抗菌肽的設(shè)計(jì)特點(diǎn)是集兩個(gè)(或以上)天然肽的優(yōu)點(diǎn)于一身，經(jīng)過(guò)適當(dāng)?shù)娜斯ば揎椇?，可以揚(yáng)長(zhǎng)避短，最大程度上發(fā)揮抗菌活性，并不引起溶血。天蠶素抗菌肽(cecropins)是目前研究最清楚、效果最好的天然抗菌肽；家蠅天蠶素抗菌肽(Cec Md)是本實(shí)驗(yàn)室經(jīng)誘導(dǎo)家蠅幼蟲(chóng)，然后克隆得到的(同源性81% )。而Chensirin是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的中國(guó)東北林蛙皮膚上分泌的天然抗菌肽，其活性很高，但具有較高的溶血活性。通過(guò)對(duì)兩者進(jìn)行雜合設(shè)計(jì)，獲得了低溶血，高抗菌活性的新型雜合肽，與天然肽相比具有很大的優(yōu)勢(shì)。
[0004]人們?yōu)榱说玫娇咕闹饕捎昧巳N方法:1.直接從生物體中提取天然肽，但含量非常少，且提取工藝復(fù)雜，成本較高，難以滿足大規(guī)模生產(chǎn)的要求；2.化學(xué)方法合成。這種方法只適用于非常短的抗菌肽，但大多數(shù)抗菌肽分子量都比較大，不適合化學(xué)和成；
3.分子量比較大的抗菌肽大多都采用基因工程的方法，該方法研究的比較透徹，而且是生產(chǎn)抗菌肽的有效途徑。如果采用基因工程學(xué)的方法生產(chǎn)抗菌肽，就要得到高效表達(dá)的發(fā)酵菌株，并建立其純化和發(fā)酵的條件和方法。通過(guò)對(duì)誘導(dǎo)方式、誘導(dǎo)條件、培養(yǎng)基組成的優(yōu)化以及建立發(fā)酵體系等進(jìn)而為規(guī)模生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是:提供了一種原核基因工程雜合陽(yáng)離子抗菌肽CC的獲得及其發(fā)酵方法，得到高效表達(dá)的發(fā)酵菌株， 并建立了其純化和發(fā)酵的最優(yōu)條件。
[0006]為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明的技術(shù)方案是:
[0007]—種原核基因工程雜合陽(yáng)離子抗菌肽CC，其特征是，所述抗菌肽CC包括兩對(duì)引物，其核苷酸序列如序列表序列3-6所示；
[0008]所述抗菌肽CC是由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的抗菌肽；
[0009]所述抗菌肽CC的核苷酸序列如序列表中序列I所示或如下序列所示；
[0010]
【權(quán)利要求】
1.一種原核基因工程雜合陽(yáng)離子抗菌肽Ce，其特征是，所述抗菌肽CC包括兩對(duì)引物，其核苷酸序列如序列表序列3-6所示； 所述抗菌肽CC是由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的抗菌肽； 所述抗菌肽CC的核苷酸序列如序列表中序列I所示或如下序列所示；

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種原核基因工程雜合陽(yáng)離子抗菌肽CC的獲得方法，其特征是，包括以下步驟: 51.合成CC融合蛋白基因； 52.構(gòu)建雜合抗菌肽CC重組大腸桿菌基因工程菌； 53.CC融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)； 54.CC的純化； 55.CC的生物學(xué)活性鑒定； 56.CC融合蛋白誘導(dǎo)表達(dá)方式的轉(zhuǎn)變； 57.CC重組基因工程菌的發(fā)酵培養(yǎng)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種大腸桿菌基因工程雜合陽(yáng)離子抗菌肽CC的獲得方法，其特征是，所述SI過(guò)程包括:根據(jù)家蠅cecropin基因(GenBank:DQ232774)并應(yīng)用生物信息學(xué)工具計(jì)算各組合的一級(jí)特征參數(shù)、預(yù)測(cè)二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)和抗菌活性，設(shè)計(jì)出具有醫(yī)療潛力的雜合抗菌肽CC,在其基因序列前端引入三肽序列(Asp-pro-pro, DPP);根據(jù)大腸桿菌對(duì)密碼子的偏愛(ài)性將雜合抗菌肽的基因序列翻譯成核酸序列，在其兩端加上BamH I和SalI限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)和保護(hù)性堿基，末端加上終止密碼子，合成兩對(duì)引物F1、Rl, F2、R2，應(yīng)用重疊PCR技術(shù)合成雜合抗菌肽CC的基因；所述兩對(duì)引物的核苷酸序列如序列表中序列3-6所示。
4.如權(quán)利要求2所述的一種大腸桿菌基因工程雜合陽(yáng)離子抗菌肽CC的獲得方法，其特征是，所述S2過(guò)程包括:構(gòu)建CC克隆質(zhì)粒pMD18-T / CC并測(cè)序鑒定，構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒pGEX-6p-l / CC并測(cè)序鑒定，構(gòu)建基因工程菌株pGEX-6P-l / CC / BL21(DE3)并測(cè)序鑒定，所述測(cè)序鑒定為:測(cè)序結(jié)果使用NCBI Blast與所設(shè)計(jì)的基因進(jìn)行對(duì)比，選取兩者結(jié)果一致的重組菌為測(cè)序結(jié)果正確的重組菌。
5.如權(quán)利要求2所述的一種大腸桿菌基因工程雜合陽(yáng)離子抗菌肽CC的獲得方法，其特征是，所述S3過(guò)程中包括:將步驟S2中測(cè)序結(jié)果正確的重組菌和含有空載體的對(duì)照菌進(jìn)行平板培養(yǎng)、種子培養(yǎng)，將發(fā)酵液中菌體生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)期后分別加入IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，然后進(jìn)行SDS-PAGE分析和western blot分析,選取表達(dá)成功的雜合抗菌肽CC。
6.如權(quán)利要求2所述的一種大腸桿菌基因工程雜合陽(yáng)離子抗菌肽CC的獲得方法，其特征是，所述S4過(guò)程包括:將基因工程菌pGEX-6P-l / CC / BL21(DE3)大量培養(yǎng)、誘導(dǎo)，收集菌體并獲得融合蛋白包涵體，經(jīng)變性、復(fù)性后進(jìn)行親和層析純化，純化后的融合蛋白經(jīng)甲酸切割后去除標(biāo)簽，然后進(jìn)行定量，純化樣品保留。
7.如權(quán)利要求2所述的一種大腸桿菌基因工程雜合陽(yáng)離子抗菌肽CC的獲得方法，其特征是，所述S6過(guò)程包括:利用乳糖來(lái)誘導(dǎo)雜合抗菌肽CC融合蛋白的表達(dá)，并將其與IPTG誘導(dǎo)的表達(dá)效果進(jìn)行比較；在確定具有可行性的基礎(chǔ)上，應(yīng)用單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)基因工程菌PGEX-6P-1 / CC / BL21(DE3)的誘導(dǎo)時(shí)間、誘導(dǎo)溫度和轉(zhuǎn)速進(jìn)行了優(yōu)化；應(yīng)用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)乳糖的誘導(dǎo)濃度、碳源、磷酸鹽和氯化鈉的添加量進(jìn)行了較大范圍的初步優(yōu)化；應(yīng)用均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)培養(yǎng)基組成的碳源、氮源、氯化鈉、磷酸鹽以及微量元素鐵的添加量進(jìn)行了優(yōu)化，并進(jìn)行回歸建模。
8.如權(quán)利要求2所述的一種大腸桿菌基因工程雜合陽(yáng)離子抗菌肽CC的獲得方法，其特征是，所述S7過(guò)程中包括:應(yīng)用均勻設(shè)計(jì)的回歸模型Y=183.501+22.376XJ0.710Χ3_44.483Χ4-872.168Χ5+4.416Χ/+4673.818Χ52_59.618Χ62來(lái)預(yù)測(cè)結(jié)果，通過(guò)回歸模型對(duì)發(fā)酵過(guò)程的控制和調(diào)整，獲得聞效表達(dá)、質(zhì)粒穩(wěn)定的發(fā)酵方法和條件。
【文檔編號(hào)】C12N15/70GK103467584SQ201310409440
【公開(kāi)日】2013年12月25日 申請(qǐng)日期:2013年9月3日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月3日
【發(fā)明者】張愛(ài)忠, 姜寧, 蔡鵬 , 王志強(qiáng), 孫艷發(fā), 趙平森, 任文, 張晨雪, 王法明, 朱雙, 劉曉明 申請(qǐng)人:黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)