黃芪愈傷組織和黃芪懸浮細(xì)胞的快速繁殖方法
【專利摘要】本發(fā)明研究了一種黃芪愈傷組織和懸浮細(xì)胞的快速繁殖方法，包括無(wú)菌外植體的獲得、愈傷組織的誘導(dǎo)、懸浮細(xì)胞培養(yǎng)、稀土調(diào)控懸浮細(xì)胞中酶的活性及黃酮皂苷的含量等步驟，本發(fā)明方法所制備的黃芪懸浮細(xì)胞中含有較高含量的黃芪皂苷。本發(fā)明方法利用稀土對(duì)黃芪懸浮細(xì)胞進(jìn)行有目的的調(diào)控，可以在短期內(nèi)獲得大量的制藥原料，并能有效降低生產(chǎn)成本。
【專利說(shuō)明】黃芪愈傷組織和黃芪懸浮細(xì)胞的快速繁殖方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及組培條件下黃芪懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)，尤其是稀土硝酸鈰對(duì)懸浮細(xì)胞中黃芪皂苷的調(diào)控。
【背景技術(shù)】
[0002]黃芪又名綿芪，綿黃芪，為豆科植物膜莢黃芪，為國(guó)家三級(jí)保護(hù)植物，漸危種，主要分布在中國(guó)北方地區(qū)，是一種較名貴的中藥材，以根入藥，藥用歷史悠久，具有補(bǔ)氣固表，利尿脫毒，斂瘡生肌，益氣補(bǔ)中之功效。目前，黃芪的用藥量越來(lái)越大，但黃芪的天然資源貧乏，栽培過(guò)程中由于病蟲害的影響，產(chǎn)量和品質(zhì)有所下降，因此采用基因技術(shù)的方法，開(kāi)發(fā)生產(chǎn)黃芪的藥用成分，進(jìn)行黃芪植物資源開(kāi)發(fā)，減少占地的一種新方法。
[0003]黃芪皂苷，英文名稱；Astragaloside 分子式=C43H68O16分子量:840.99分子結(jié)構(gòu):
【權(quán)利要求】
1.一種黃芪愈傷組織和懸浮細(xì)胞的快速繁殖方法，包括無(wú)菌外植體的獲得、愈傷組織的誘導(dǎo)、懸浮細(xì)胞培養(yǎng)、稀土調(diào)控黃芪懸浮細(xì)胞中黃酮皂苷的含量，其主要步驟如下: (1)按照植物組織培養(yǎng)常規(guī)消毒方法對(duì)野外采取的外植體材料進(jìn)行消毒處理，獲得無(wú)菌的外植體； (2)將步驟(I)獲得的無(wú)菌黃芪葉片，芽接種到愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)，誘導(dǎo)出來(lái)的愈傷組織接種入增值培養(yǎng)基中進(jìn)行愈傷組織增值，增值培養(yǎng)4-5代，獲得嫩綠松散的愈傷組織； (3)將步驟(2)獲得的嫩綠松散的愈傷組織接種到附加激素0.5-1.5 mg/L NAA和1_3mg/L IBA的MS培養(yǎng)基中進(jìn)行震蕩懸浮培養(yǎng)，培養(yǎng)2_3代獲得黃芪懸浮細(xì)胞； (4)將步驟(3)獲得的黃芪懸浮細(xì)胞接種入MS+lmg/LNAA+2mg/LIBA+稀土 l_3mg/L，收集黃芪懸浮細(xì)胞稱重，然后分兩份，一份-70°C冰箱保存鮮樣，一份60°C烘干保存干樣。
2.按照權(quán)利要求1的制備方法，其特征在于:步驟(I)中所述無(wú)菌的黃芪外植體葉片和芽按照下述方法得到:取黃芪葉片和芽，洗衣粉浸泡4分鐘，流水沖洗50分鐘，經(jīng)次氯酸鈉消毒處理12分鐘，無(wú)菌水沖洗5遍，用吸水紙吸去無(wú)菌外植體表面的水分。
3.按照權(quán)利要求1的制備方法中，其特征在于:所述的培養(yǎng)條件為溫度25°C，濕度50%-70%，光強(qiáng)度20001x ;光期14 h暗期10h。
4.按照權(quán)利要求1的制備方法中，其特征在于:步驟(2)所述的黃芪愈傷組織按照按照下述方法得到:將獲得的無(wú)菌黃芪葉片和芽切成Icm2小塊，接種入MS培養(yǎng)基中進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)，每瓶接種4塊，附加激素lmg/LNAA，3mg/L2，4_D，蔗糖30g/L，瓊脂6.5g/L，pH=8，初代培養(yǎng)30天，連續(xù)繼代4-5次，繼代周期20天，獲得嫩綠松散的愈傷組織。
5.按照權(quán)利要求1的 制備方法中，其特征在于:步驟(3)所述的黃芪懸浮細(xì)胞按照按照下述方法得到:取誘導(dǎo)出來(lái)的嫩綠松散的愈傷組織，接種到盛有40 mLMS液體培養(yǎng)基100mL三角瓶中，接種后置于旋轉(zhuǎn)式搖床振蕩培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速為120 r/min，溫度25°C，初次液體培養(yǎng)愈傷組織生長(zhǎng)旺盛，搖勻培養(yǎng)液后稍置片刻，用顆粒適中的懸浮細(xì)胞團(tuán)進(jìn)行繼代培養(yǎng)，換用200 mL三角瓶裝60 mL液進(jìn)行培養(yǎng)，再繼而用500 mL三角瓶裝120 mL液培養(yǎng)，以進(jìn)行懸浮培養(yǎng)系的誘導(dǎo)。
6.按照權(quán)利要求1的制備方法中，其特征在于:步驟(4)所述稀土對(duì)黃芪懸浮細(xì)胞的調(diào)控按照下述方法實(shí)施:將l_3mg/l稀土溶液加入誘導(dǎo)出的懸浮培養(yǎng)系中進(jìn)行調(diào)控，25天后取樣測(cè)定黃芪皂苷的含量，精密稱取干樣品lg，60°C烘干，研磨后過(guò)80目篩，加入65%的乙醇和水1:1，溶液30ml放入超聲波中，60°C超聲提取45min，過(guò)濾棄殘?jiān)褂?5%的乙醇定容至100ml，搖勻后，取1.00 mL提取液加入試管，再分別加入1.00 mL 8%香草醛試劑，置于冰浴中緩緩加入10.0mL體積分?jǐn)?shù)為72%的硫酸，搖勻，放入70°C水浴中，保溫25 min,取出置于室溫冷卻，搖勻，立即于波長(zhǎng)542 nm處測(cè)定吸光度，測(cè)定3次求平均值。
7.按照權(quán)利要求1的制備方法中，其特征在于:步驟(4)中所述的稀土是硝酸鈰稀土。
8.按照權(quán)利要求1的制備方法中，其特征在于:步驟(4)中所述的黃芪皂苷提取方法為超聲提取法。
【文檔編號(hào)】C12N5/04GK103451146SQ201310410256
【公開(kāi)日】2013年12月18日 申請(qǐng)日期:2013年9月11日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月11日
【發(fā)明者】蘇劉花 申請(qǐng)人:南京澤朗農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司