聾病易感基因GJB2 235delC、299delAT突變檢測(cè)試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了聾病易感基因GJB2?235delC、299delAT突變檢測(cè)試劑盒，該試劑盒包括擴(kuò)增試劑和一系列標(biāo)準(zhǔn)品；所述擴(kuò)增試劑包括：PCR緩沖液、MgCl2和dNTPs的反應(yīng)混合物，Taq酶，超純水，高特異性擴(kuò)增GJB2：235delC、299delAT；所述一系列標(biāo)準(zhǔn)品包括：235delC分型標(biāo)準(zhǔn)品、299delAT分型標(biāo)準(zhǔn)品。本發(fā)明以上述2個(gè)聾病易感基因位點(diǎn)為檢測(cè)對(duì)象，通過(guò)上述耳聾易感基因位點(diǎn)的擴(kuò)增和熒光定量檢測(cè)，與基因分型標(biāo)準(zhǔn)品的對(duì)比，即可篩選出含有上述位點(diǎn)突變的個(gè)體，同時(shí)確定基因型。對(duì)聾病易感基因的檢測(cè)，尤其是對(duì)新生兒耳聾基因的篩查具有重要意義。
【專利說(shuō)明】聾病易感基因GJB2235delC、299delAT突變檢測(cè)試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及聾病易感基因GJB2235delC、299delAT突變檢測(cè)試劑盒，屬于生物檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]世界范圍內(nèi)對(duì)聽(tīng)力語(yǔ)言殘疾者進(jìn)行的致病因素研究表明，約60-80%患者的病因與遺傳因素有關(guān)，其中發(fā)達(dá)國(guó)家的臨床研究數(shù)據(jù)表明，遺傳性耳聾在耳聾患者中約占80%。因此近十幾年來(lái)，遺傳性耳聾的發(fā)病機(jī)制及其分子流行病學(xué)的研究成為了聾病研究最重要的內(nèi)容之一。隨著人類基因組計(jì)劃完成，聾病基因的定位和克隆取得了巨大的進(jìn)步，聾病的分子遺傳學(xué)研究和分子流行病學(xué)的數(shù)據(jù)使研究者們逐步認(rèn)識(shí)到聾病易感基因突變?cè)诰S護(hù)聽(tīng)力健康和發(fā)現(xiàn)聽(tīng)力異常中的重要性。
[0003]在目前已經(jīng)定位和克隆的耳聾相關(guān)基因中，GJB2是最常見(jiàn)的易感基因，在先天性重度耳聾患者中約占30-50%。目前，在該基因已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了 100多種突變類型，在中國(guó)常見(jiàn)的突變形式為235delC，其在所有致病性突變中約占74.14%，約22.2%的中國(guó)耳聾患者與該突變有關(guān)。另外GJB2299_300delAT的突變等位基因頻率約為3%。
[0004]目前常用的基因檢測(cè)方法有:直接測(cè)序(direct sequencing, DS)、連接酶檢測(cè)反應(yīng)(ligase detection reaction, LDR)、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析(restrictionfragment length polymorphism, RFLP)、變性高效液相色譜分析(denaturing highperformance liquid chromotography,DHPLC)、基因芯片。這些方法都存在不同的缺陷，例如操作繁瑣、結(jié)果不易判讀、重復(fù)性差、假陰性假陽(yáng)性多等問(wèn)題。對(duì)于染色體突變的基因分型，一般的熒光定量試劑盒往往需要對(duì)同一個(gè)標(biāo)本進(jìn)行多管檢測(cè)，才能獲得2個(gè)以上的分型信息。
[0005]本發(fā)明以上述2個(gè)聾病易感基因位點(diǎn)為檢測(cè)對(duì)象，通過(guò)上述耳聾易感基因位點(diǎn)的擴(kuò)增和熒光定量檢測(cè)，與基因分型標(biāo)準(zhǔn)品的對(duì)比，即可篩選出含有上述位點(diǎn)突變的個(gè)體，同時(shí)確定基因型。對(duì)聾病易感基因的檢測(cè)，尤其是對(duì)新生兒耳聾基因的篩查具有重要意義；首次利用四通道/四色染料-熒光定量PCR檢測(cè)的方法實(shí)現(xiàn)了 2位點(diǎn)分型檢測(cè)的目標(biāo)，并含有內(nèi)對(duì)照以監(jiān)控檢測(cè)過(guò)程。閉管檢測(cè)防止了開(kāi)蓋檢測(cè)操作而產(chǎn)生的污染，為臨床診斷和相關(guān)領(lǐng)域科研提供可靠方法。

【發(fā)明內(nèi)容】
[0006]本發(fā)明目的是提供一種可在I個(gè)小時(shí)內(nèi)同時(shí)檢測(cè)聾病易感基因GJB2 235delC、299delAT突變，區(qū)分基因型并含有內(nèi)對(duì)照以監(jiān)控檢測(cè)過(guò)程。
[0007]為了實(shí)現(xiàn)上述目的，采取的技術(shù)方案:一種聾病易感基因GJB2 235delC、299delAT突變檢測(cè)試劑盒，該試劑盒包括擴(kuò)增試劑和一系列標(biāo)準(zhǔn)品；
[0008]所述擴(kuò)增試劑包括:PCR緩沖液、MgCl2和dNTPs的反應(yīng)混合物，Taq酶，超純水，高特異性擴(kuò)增GJB2:235delC、299delAT的引物混合物，對(duì)上述位點(diǎn)進(jìn)行特異性檢測(cè)的探針混合物，對(duì)人基因組DNA進(jìn)行檢測(cè)的通用探針混合物，內(nèi)對(duì)照及對(duì)內(nèi)對(duì)照進(jìn)行檢測(cè)的引物探針混合物；
[0009]所述一系列標(biāo)準(zhǔn)品包括:235delC分型標(biāo)準(zhǔn)品(10ng/uL的235delC雜合型突變DNA標(biāo)本I管)、299delAT分型標(biāo)準(zhǔn)品(10ng/uL的299delAT雜合型突變DNA標(biāo)本I管)。
[0010]所述用于對(duì)GJB2:235delC、299delAT突變進(jìn)行特異性檢測(cè)的探針，對(duì)人基因組DNA進(jìn)行檢測(cè)的通用探針，對(duì)內(nèi)對(duì)照進(jìn)行檢測(cè)的探針被分為四組，分別采用四種不同的發(fā)光基團(tuán)對(duì)各組探針的5’端進(jìn)行標(biāo)記，3’端的淬滅基團(tuán)可以為相同或不同的熒光染料。
[0011]所述探針?biāo)譃榈乃慕M為:用于對(duì)GJB2:299delAT突變進(jìn)行特異性檢測(cè)的探針采用同一組發(fā)光-淬滅基團(tuán)；用于對(duì)235delC突變進(jìn)行特異性檢測(cè)的探針采用同一組發(fā)光-淬滅基團(tuán)；對(duì)人基因組DNA進(jìn)行檢測(cè)的通用探針采用同一組發(fā)光-淬滅基團(tuán)；用于對(duì)內(nèi)對(duì)照進(jìn)行特異性檢測(cè)的探針采用同一組發(fā)光-淬滅基團(tuán)。
[0012]所述5’端不同的發(fā)光基團(tuán)所使用的熒光染料可以為:ALEXAFluor350、FAM、TET、HEX/JOE/VIC、Cy3,TAMRA,RO X、/TexasRed,Cy5 ;3’端相同或不同的淬滅基團(tuán)所使用的熒光染料可以為:BHQ1、BHQ2、TAMRA、DABCYL。
[0013]使用所述的試劑盒進(jìn)行PCR復(fù)合擴(kuò)增反應(yīng)的條件:PCR擴(kuò)增體系的pH值為
8.0-9.0，鎂離子濃度為1.5-3.5mM，4種dNTP的終濃度各為200-300μΜ，Taq酶的用量為
0.1-0.4U/μ L，引物探針混合物中的引物、探針的終濃度為0.2-0.4 μ M0
[0014]使用所述試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，擴(kuò)增階段反應(yīng)在一個(gè)復(fù)合擴(kuò)增反應(yīng)體系中同時(shí)擴(kuò)增GJB2:235delC、299delAT，人基因組DNA目標(biāo)序列，內(nèi)對(duì)照目標(biāo)序列。
[0015]用于GJB2:235delC、299delAT 檢測(cè)的引物為:
[0016]SEQ N0.1:5’ -ACGTGTGCTACGATCACTACTTCC-3’ ；
[0017]SEQ N0.2:5’ -CTCCTCGATGTCCTTAAATTCACTC-3’ ；
[0018]用于GJB2:299delAT突變檢測(cè)的探針為:
[0019]SEQ N0.5:5’ -CCTTGATGAACTTCCTCTTCTTCTCGTC T CS'；
[0020]用于GJB2:235delC突變檢測(cè)的探針為:
[0021 ] SEQ N0.6:5 ’ -ACATCCGGCTATGGGCCT G C-3，
[0022]用于對(duì)人基因組DNA進(jìn)行檢測(cè)的通用探針為:
[0023]SEQ N0.7:5，-ACGCCAGCGCTCCTAGTGGC-3，；
[0024]其中LNA核苷以黑體字表示。
[0025]3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于:所述的內(nèi)對(duì)照為一段人工合成的序列裝載到PMD18-T的質(zhì)粒載體上得到，這段人工合成的序列(SEQ N0.4)經(jīng)過(guò)NCBI網(wǎng)站Blast沒(méi)有找到高相關(guān)的同源區(qū)。擴(kuò)增序列及對(duì)內(nèi)對(duì)照進(jìn)行檢測(cè)的引物探針為:
[0026]SEQ N0.8:CACCAGCATCTCCCTTCATGTTGACTACCGTAGGCTGCCACCATTTCAGAAGAACGATGACCCCTTGCTAGCAGTGGAAGAGTTGCATGAAGGTAATATACTCGATCCGTAATTCCACTATTGAAATGGGTACATGACTGATACAGACCATC
[0027]SEQ N0.9:5’ -CACCAGCATCTCCCTTCATGT-3’
[0028]SEQ N0.10:5’ -GATGGTCTGTATCAGTCATGTACCCA-3’
[0029]SEQ N0.11:5，-GAACGATGACCCCTTGCTAGCAGTGGAAGAG-3’
[0030]所述各位點(diǎn)的復(fù)合擴(kuò)增采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)來(lái)實(shí)現(xiàn)，采用熒光定量PCR進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)，通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)品的同步擴(kuò)增和分析，得出所測(cè)標(biāo)本的分型信息或突變比例信息。
[0031]其中所檢測(cè)的人基因組DNA為:使用Chelex法、磁珠提取法或酚/氯仿抽提法對(duì)來(lái)源樣本進(jìn)行處理得到的DNA ;所述的來(lái)源樣本為:來(lái)源于人類的:濾紙片血斑/ 口腔拭子樣本、FTA卡血斑/ 口腔拭子樣本、口腔拭子樣本、血液/痕、組織、羊水。
[0032]使用所述的試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，擴(kuò)增階段反應(yīng)在任何型號(hào)的PCR儀上進(jìn)行，擴(kuò)增程序:94-980C l-5min ；45 個(gè)循環(huán)的 94-98°C 5-10s, 55-65°C 30_50s。
[0033]使用的帶熒光標(biāo)記并經(jīng)LNA核苷單體摻入修飾的引物，提高了探針的Tm值，縮短了探針長(zhǎng)度，增強(qiáng)了探針對(duì)點(diǎn)突變的識(shí)別力，從而增加了探針的靈敏度和特異性，防止假陽(yáng)性和假陰性的出現(xiàn)。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0034]圖1是本發(fā)明的試劑盒對(duì)GJB2:235delC分型標(biāo)準(zhǔn)品(IOng DNA背景下235雜合突變型DNA)不同稀釋梯度情況下的檢測(cè)圖譜；
[0035]圖2是本發(fā)明的試劑盒對(duì)GJB2:299delAT分型標(biāo)準(zhǔn)品(IOng DNA背景下299雜合突變型DNA)不同稀釋梯度情況下的檢測(cè)圖譜；
[0036]圖3是根據(jù)圖1、圖2數(shù)據(jù)作出的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；
[0037]圖4是本發(fā)明的試劑盒對(duì)正常個(gè)體血斑來(lái)源DNA (0.5ng/20uL體系)的檢測(cè)圖譜；
[0038]圖5是本發(fā)明的試劑盒對(duì)GJB2:235delC突變的個(gè)體血斑來(lái)源DNA (0.5ng/20uL體系)的檢測(cè)圖譜；
[0039]圖6是本發(fā)明的試劑盒對(duì)GJB2:299delAT突變個(gè)體血斑來(lái)源DNA (lng/20uL體系)的檢測(cè)圖譜。
【具體實(shí)施方式】
[0040]下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，但不作為對(duì)本發(fā)明的限定。
[0041]實(shí)施例1本發(fā)明的試劑盒檢測(cè)突變及正常個(gè)體的DNA樣本
[0042]用于GJB2:235delC突變檢測(cè)的探針5’端采用FAM熒光染料標(biāo)記，用于GJB2:299delAT突變檢測(cè)的探針5’端采用HEX熒光染料標(biāo)記，用于人線粒體DNA檢測(cè)的探針5’端采用Cy5熒光染料標(biāo)記，用于內(nèi)對(duì)照檢測(cè)的探針5’端采用ROX熒光染料標(biāo)記。
[0043]1、待測(cè)樣本1000份，都已經(jīng)使用“DNA提取-PCR擴(kuò)增-測(cè)序”的技術(shù)方法對(duì)各位點(diǎn)進(jìn)行過(guò)測(cè)序檢測(cè)。其中，GJB2:235delC突變樣本I份，GJB2:299delAT突變樣本4份。
[0044]2、檢材的基因組DNA提取
[0045]Chelex提取法:剪下I-3mm血斑(標(biāo)本來(lái)自于XX醫(yī)院檢驗(yàn)科)置于1.5mL離心管中，加入SdH2OlmL,振蕩離心，棄上清液，重復(fù)步驟兩次，棄上清液，將5% Chelex-1OO震蕩懸浮后快速用剪掉的槍頭吸取200 μ L加入離心管中，振蕩數(shù)秒，。于56°C水浴保溫30min后，振蕩數(shù)秒。95°C沸水浴lOmin，輕微振蕩數(shù)秒。2000rpm離心5min，上清中為提取的DNA。
[0046]3、擴(kuò)增和擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)分析
[0047](I) PCR 擴(kuò)增體系:
【權(quán)利要求】
1.聾病易感基因GJB2235delC、299delAT突變檢測(cè)試劑盒，其特征在于包括擴(kuò)增試劑和一系列標(biāo)準(zhǔn)品；所述擴(kuò)增試劑包括:PCR緩沖液、1%(:12和dNTPs的反應(yīng)混合物，Taq酶，超純水，高特異性擴(kuò)增GJB2:235delC、299delAT引物混合物，對(duì)上述位點(diǎn)進(jìn)行特異性檢測(cè)的探針混合物，對(duì)人基因組DNA進(jìn)行檢測(cè)的通用探針混合物，內(nèi)對(duì)照及對(duì)內(nèi)對(duì)照進(jìn)行檢測(cè)的引物探針混合物；所述一系列標(biāo)準(zhǔn)品包括:235delC分型標(biāo)準(zhǔn)品、299delAT分型標(biāo)準(zhǔn)品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于: 用于GJB2:235delC、299delAT檢測(cè)的引物為:
SEQ N0.1:5’ -ACGTGTGCTACGATCACTACTTCC-3’ ；
SEQ N0.2:5’ -CTCCTCGATGTCCTTAAATTCACTC-3’ ； 用于GJB2:299delAT突變檢測(cè)的探針為:
SEQ N0.5:5’ -CCTTGATGAACTTCCTCTTCTTCTCGTC 71C-3’ ； 用于GJB2:235delC突變檢測(cè)的探針為:
SEQ N0.6:5’ -ACATCCGGCTATGGGCCT C?C_3’ 用于對(duì)人基因組DNA進(jìn)行檢測(cè)的通用探針為:
SEQ N0.7:5’ -ACGCCAGCGCTCCTAGTGGC-3’ ； 其中LNA核苷以黑體字表示。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于:所述的內(nèi)對(duì)照為一段人工合成的序列裝載到PMD18-T的質(zhì)粒載體上得到，這段人工合成的序列(SEQ N0.4)經(jīng)過(guò)NCBI網(wǎng)站Blast沒(méi)有找到高相關(guān)的同源區(qū)。擴(kuò)增序列及對(duì)內(nèi)對(duì)照進(jìn)行檢測(cè)的引物探針為:
SEQ N0.8:CACCAGCATCTCCCTTCATGTTGACTACCGTAGGCTGCCACCATTTCAGAAGAACGATGACCCCTTGCTAGCAGTGGAAGAGTTGCATGAAGGTAATATACTCGATCCGTAATTCCACTATTGAAATGGGTACATGACTGATACAGACCATC
SEQ N0.9:5’ -CACCAGCATCTCCCTTCATGT-3’
SEQ N0.10:5’ -GATGGTCTGTATCAGTCATGTACCCA-3’
SEQ N0.11:5’ -GAACGATGACCCCTTGCTAGCAGTGGAAGAG-3’
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于:所述的用于GJB2:235delC、299delAT突變檢測(cè)的探針，對(duì)人基因組DNA進(jìn)行檢測(cè)的通用探針，內(nèi)對(duì)照探針，每條探針的5’端和3’端均進(jìn)行熒光染料標(biāo)記，5’端為發(fā)光基團(tuán)和3’端為淬滅基團(tuán)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于:所述用于對(duì)GJB2:235delC、299delAT突變進(jìn)行特異性檢測(cè)的探針，對(duì)人基因組DNA進(jìn)行檢測(cè)的通用探針被分為四組，分別采用四種不同的發(fā)光基團(tuán)對(duì)各組探針的5’端進(jìn)行標(biāo)記，3’端的淬滅基團(tuán)可以為相同或不同的熒光染料。
6.根據(jù)權(quán)利4要求所述的試劑盒，其特征在于:探針?biāo)譃榈乃慕M為:用于對(duì)GJB2:299delAT突變進(jìn)行特異性檢測(cè)的探針采用同一組發(fā)光-淬滅基團(tuán)；用于對(duì)235delC突變進(jìn)行特異性檢測(cè)的探針采用同一組發(fā)光-淬滅基團(tuán)；對(duì)人基因組DNA進(jìn)行檢測(cè)的通用探針采用同一組發(fā)光-淬滅基團(tuán)；用于對(duì)內(nèi)對(duì)照進(jìn)行特異性檢測(cè)的探針采用同一組發(fā)光-淬滅基團(tuán)。
7.根據(jù)權(quán)利4要求所述的試劑盒，其特征在于:5’端不同的發(fā)光基團(tuán)所使用的熒光染料可以為:ALEXAFluor350、FAM、TET、HEX/JOE/VIC、Cy3, TAMRA, ROX、/Texas Red、Cy5 ;3’端相同或不同的淬滅基團(tuán)所使用的熒光染料可以為:BHQ1、BHQ2、TAMRA、DABCYL。
8.根據(jù)權(quán)利I要求所述的試劑盒，其特征在于:包括一系列標(biāo)準(zhǔn)品:235delC分型標(biāo)準(zhǔn)品(10ng/uL的235delC雜合型突變DNA標(biāo)本I管)、299delAT分型標(biāo)準(zhǔn)品(10ng/uL的299delAT雜合型突變DNA標(biāo)本I管)。
9.權(quán)利要求1所述試劑盒應(yīng)用于聾病易感基因的檢測(cè)，其特征在于通過(guò)熒光定量PCR特異性檢測(cè)聾病易感基因GJB2:235delC、299delAT ;用于299delAT檢測(cè)的引物探針為:SEQ N0.USEQ N0.2,SEQ N0.5 ;用于 GJB2:235delC 突變檢測(cè)的引物探針為:SEQ N0.3,SEQN0.4、SEQ N0.6 ;用于對(duì)人基因組DNA檢測(cè)的引物探針為:SEQ N0.3、SEQ N0.4、SEQ N0.7 ；用于對(duì)內(nèi)對(duì)照檢測(cè)的引物探針為:SEQ N0.9,SEQ N0.10,SEQ N0.11。所述各位點(diǎn)的復(fù)合擴(kuò)增采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)來(lái)實(shí)現(xiàn)，采用熒光定量PCR進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)，通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)品的同步擴(kuò)增和分析，得 出所測(cè)標(biāo)本的分型信息或突變比例信息。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103451300SQ201310410783
【公開(kāi)日】2013年12月18日 申請(qǐng)日期:2013年9月11日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月11日
【發(fā)明者】步迅, 夏子芳, 劉艷艷, 張全芳 申請(qǐng)人:步迅, 夏子芳